Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak Suncus murinus

Bu prosedürün genel amacı, Suncus murinus'un safra yolu içindeki sinir dağılımının görüntülenmesi için tam mount immünohistokimya boyaması kullanmaktır. Bu yöntem, birçok türün iç organlarının, özellikle standart yöntemlerle değerlendirilmesi zor olan düzensiz veya küçük organların sinir dağılımını analiz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajları operasyonun basit olmasıdır.

Karmaşık prosedürler gerektirmez ve yüksek başarı oranına sahiptir. Prosedürü benimle birlikte göstermek, her ikisi de laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yidan Dai ve bir araştırma görevlisi olan Shuang-Qin Yi olacak. Hayvanı bir çeker ocakta ayrı ayrı PBS ve% 4 paraformaldehit perfüzyonları ile yıkayarak başlayın.

Daha sonra kan damarlarını etiketlemek için perfüzyon kateterinden abdominal aort içine iki ila üç mililitre beyaz neopren lateks enjekte edin. Ve ilgilenilen tüm dokular etiketlendiğinde, karın organlarını ve ilgili sinirlerini ve damarlarını çıkarın. Daha sonra, safra sistemini etiketlemek için safra kesesine yaklaşık 0.1 mililitre mavi neopren lateks enjekte edin ve tam montajlı immün boyama için dokuları gece boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

Ertesi sabah, numuneyi bir nutatör üzerinde damıtılmış suda bir saatlik oda sıcaklığında dört yıkama için bir cam şişeye aktarın. Son yıkamadan sonra, herhangi bir intrinsik peroksidaz reaksiyonunu önlemek için dokuları taze hazırlanmış% 1 ortoperiyodik asit içinde oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca damıtılmış suda yıkayın, ardından taze hazırlanmış% 0.004 papillon içinde 37 santigrat derece sabit sıcaklıktaki su banyosunda hafifçe sallanarak iki saat inkübe edin.

Kuluçka işleminin sonunda, numuneyi 50 ila 60 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra dokuları gece boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içinde saklayın. Ertesi sabah, numuneyi az önce gösterildiği gibi damıtılmış suda yıkayın ve ardından taze hazırlanmış papillonda iki saatlik bir inkübasyon daha yapın.

Numuneyi damıtılmış suda 50 ila 60 dakika daha yıkayın, ardından gece boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Üçüncü sabah, dokuları damıtılmış suda dört kez yıkayın, ardından üç ardışık artan 30 dakikalık sükroz inkübasyonuna daldırın. Daha sonra numuneyi eksi 20 santigrat derecede 30 ila 60 dakika dondurun, ardından oda sıcaklığında tamamen çözdürün.

Üçüncü donma-çözülme döngüsünden sonra, dört santigrat derece gece boyunca inkübasyon için numuneyi %2 Triton X-100'e aktarın. Ertesi sabah, numunenin boyutuna bağlı olarak üç ila altı gün boyunca nutatör üzerinde dört santigrat derecede hafifçe sallanmak için numuneyi, ilgilenilen birincil antikorun bir kabına aktarın. Uygun etiketleme periyodundan sonra, bağlanmamış birincil antikoru oda sıcaklığında PBS'de bir saatlik dört yıkama ile çıkarın ve numuneyi dört santigrat derecede hafifçe sallayarak üç gün boyunca uygun ikincil antikorla etiketleyin.

İkincil antikor etiketleme süresinin sonunda, numuneyi PBS'de dört kez yıkayın. Daha sonra dokuları 10 mikrolitre% 30 hidrojen peroksit içinde 100 mililitre taze hazırlanmış% 0.002 DAB renklendirme çözeltisinde dört santigrat derecede 16 ila 72 saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Optimum boyama yoğunluğuna ulaşıldığında, renklenme reaksiyonunu durdurmak için numuneyi PBS'de% 0.04 sodyum azid içine aktarın.

Daha sonra numuneyi dikkatlice taze PBS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına daldırın ve stereo mikroskop üzerine monte edilmiş bir kamera kullanarak dokuların tam montajlı görüntülerini yakalayın. Ekstrahepatik safra yollarının innervasyonunun görselleştirilmesine ek olarak, nörofilament pozitif sinir liflerine karşı antikorla etiketleme, vagus sinirinin yemek borusu boyunca ve mideye çalışma ve dağılım yoğunluğunun kesin olarak tanımlanmasına da izin verir. Safra kesesinin kan damarlarını beyaz neopren lateks ile etiketlemek, safra kesesinin boynunda fundusa göre daha yüksek bir innervasyon yoğunluğu ile çevre dokulara yüksek kontrast oluşturan ince sinir fibrozunu ortaya çıkarır.

Üst safra kanalında iki tip sinir demeti etiketlenir, düzensiz ve yoğun bir sinir ağı oluşturan ve safra yolu üzerinde ve içinde yapışkan bir şekilde uzanan ince sinir demetleri ve safra yolu yüzeyine paralel olarak dağılmış daha kalın sinir demetleri. Ortak safra kanalının mavi neopren lateks ile ve damarların beyaz neopren lateks ile etiketlenmesi, koledok kanalının sonundaki ince sinir liflerinin ve duodenal papilla bölgesinin görüntülenmesini sağlar. Bu prosedürü denemeden önce, tüm sürecin tamamlanması iki ila üç hafta gerektirdiğinden, deneylerin her biri için zaman çizelgesini oynatmaya dikkat edin.

Çözeltileri değiştirirken numuneye zarar vermemek için, numuneyi forseps ile çıkarmak yerine her zaman çözeltileri dökün. Bu videoyu izledikten sonra, bu tekniği çeşitli iç organlardaki bir dizi sinirin etiketlenmesine uygulayabilmelisiniz.