Name: Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak Suncus murinus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, Suncus murinus safra yolundaki sinir dağılımını görselleştirmek için tam montajlı immünohistokimya yöntemini. Bu teknik, küçük ve düzensiz iç organların innervasyon analizi için basit ve güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların onayları yok.

Tüm deneysel prosedürler Tokyo Büyükşehir Belediyesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Hayvanlar, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca muhafaza edildi ve işlendi . Japonya&#39;nın Tokyo Büyükşehir Belediyesi Sınır Sağlık Bilimleri Bölümü Fonksiyonel Morfoloji Laboratuvarı&#39;nda yetiştirilen ve bakımını sürdürdükleri hayvanları kullandık. 1. Hayvan Bakımı ve Konut <ol><li> Kapalı yetiştirme kolonisinden 7 S. murinus (3 kadın ve 70-90 g ağırlığında 4 erkek) elde edin. </li><li> S. murinus&#39;u, kağıt şeritleri içeren ahşap yuva kutusuna sahip plastik kafeslerde sütten kesildikten (doğumdan 20 gün sonra) ayrı ayrı tutun. Onları geleneksel şartlara sahip bir hayvan odasında tutun: 23-27 ° C, nem kontrolü yok ve 12:12 saatlik ışık: karanlık döngü. Ticari olarak tedarikAlabalık topakları ve su ad libitum. </li></ol> 2. Doku Hazırlama <ol><li> % 4 (w / v) paraformaldehid (PFA) hazırlamak için, 40 mL PFA&#39;nın 1,000 mL 0.01 M Fosfat Tamponlu Tuzu içinde (PBS, pH 7.4) çözündürülmesi. Duman kabininde, solüsyon berrak oluncaya kadar bir girdap kullanarak karıştırın. 4% PFA O / N&#39;yi 4 ° C&#39;de saklayın. Dikkat: PFA kullanırken uygun Kişisel Koruyucu Ekipmanları (PPE) giyin. </li><li> Hayvanı perfüze ile tamir etmek için eteri anesteziyle eter ile inceltin ve daha sonra intraperitoneal bir somnopentil enjeksiyonu yapın (pentobarbital sodyum, 0.6 mL / kg vücut ağırlığı). </li><li> Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, 3 cm uzunluğunda bir orta hat abdominal insizyon oluşturarak bisturi ile karın boşluğunu açın. İnferior vena kava çıkartılarak inceltilirken, bu arterin bifurkasyonunun hemen üzerindeki iliyak arterlerin hemen üstündeki seviyede abdominal aorta retrograd olarak bir kateter takın. </li><li> Somnopentil enjekte edin (pentobarbital yaniDium, 1.0 mL / kg vücut ağırlığı). Ötenazi sona erdikten sonra, bir duman dolabında 0.01 M PBS (pH 7.4) ve daha sonra% 4 PFA ile seyreltin. </li><li> Perfüzyondan sonra, kan damarlarını etiketlemek için 2-3 mL beyaz neopren lateks (distile Su (DW) ile seyreltik beyaz neopren lateks 3: 2) enjekte edin. </li><li> Karaciğer, safra kesesi, safra kanalları, duodenum ve pankreas en blokları dahil olmak üzere karın organlarını ilgili sinir ve damarlarla çıkarın. </li><li> Safra kesesine yaklaşık 0.1 mL mavi neopren lateks (mavi mürekkeple 10 mL inceltilmiş beyaz neopren lateks ekleyin) enjekte ederek safra sistemi etiketleyin. </li><li> Tam monte immün boyama için 4 ° C&#39;de% 4&#39;lük PFA ile gece boyunca düzeltme yapın. Dikkat: PFA toksiktir. PFA&#39;yı doğrudan kullanmaktan kaçının. PFA, duman kabininde kullanılmalıdır. </li></ol> 3. Bütün montaj immünohistokimyası Not: Yıkama, antikor inkübasyonu ve renklendirme de dahil olmak üzere protokol boyuncaE numune besleyici üzerinde kalmalı, nazikçe oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de salınmalıdır . <ol><li> Gün 1: Enzimatik tedavi ve potansiyel endojen peroksidazın inaktivasyonu <ol><li> Hazırlanan örneği DW 4x ile uygun bir boyutta cam flakon içerisinde 1 saat süreyle oda sıcaklığında yıkayın. PFA&#39;yı çıkarmak için numuneyi nazikçe sallayın. Çözüm alışverişi yaparken numuneye zarar vermemek. </li><li> % 1 (w / v) ortoperiodik asit hazırlamak için 1 g ortoperiodik asit 100 mL DW&#39;de eritilir. </li><li> Entrensek peroksidaz reaksiyonunu önlemek için numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 1 ortoperyodik asit ile inkübe edin. </li><li> 0.004 g papainin, 100 mL 0.025 mol / L Tris-HC1 tamponunda (pH 7.6) çözülmesi ile% 0.004 (w / v) papain hazırlayın. </li><li> Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika oda sıcaklığında yıkayın. </li><li> Örnek, yeni hazırlanmış% 0.004 papain içinde 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle hafifçe sallanan bir sabit sıcaklık banyosunda inkübe edin. </li><li> Numuneyi D ile yıkayınOda sıcaklığında 50-60 dk. </li><li> Numuneyi 4 ° C / N&#39;de% 4 PFA içinde saklayın. </li></ol></li><li> 2. Gün: Enzimatik tedavi <ol><li> Elde edilen numuneyi 1 saat boyunca oda sıcaklığında DW ile 4 kez yıkayın. </li><li> Örnek, yeni hazırlanmış% 0.004 papain içinde 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle hafifçe sallanan bir sabit sıcaklık banyosunda inkübe edin. </li><li> Numuneyi oda sıcaklığında 50-60 dakika oda sıcaklığında yıkayın. Numuneyi 4 ° C / N&#39;de% 4 PFA içinde saklayın. </li></ol></li><li> 3. Gün: Dondurma tedavisi <ol><li> Depolanmış numuneyi, yukarıdaki gibi RT&#39;de 1 saat boyunca DW 4x ile yıkayın. </li><li> 2.5 g, 5 g ve 10 g sakrozun sırasıyla 100 mL 0.01 M PBS&#39;de çözülmesi ile% 2.5 (w / v),% 5 (w / v) ve% 10 (w / v) sukroz hazırlayın PH 7.4). </li><li> Numuneyi, her biri 30 dakika boyunca% 2.5 (w / v),% 5 (w / v) ve% 10 (w / v) sakroz içine daldırın. </li><li> Numuneyi -20 ° C&#39;de 30-60 dakika boyunca dondurun ve sonra oda sıcaklığında tam olarak çözündürün; Döngüyü 3x tekrarlayın. </li><li> Üst% 2 Triton X-100 (v / v), 100 mL 0.01 M PBS&#39;ye (pH 7.4) 2 mL Triton X-100 ekleyin. </li><li> Numuneyi% 2 Triton X-100&#39;de 4 ° CO / N&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> 4. Gün: Birincil antikor inkübasyonu <ol><li> Primer antikorun seyreltme solüsyonunu 0.2 mL Bovine Serum Albumin (BSA), 0.3 mL Triton X-100 ve 0.1 g sodyum azid&#39;in 100 mL 0.01 M PBS (pH 7.4) içerisinde çözündürülmesi ile hazırlayın. Dikkat: Sodyum azid akut toksiktir. Solunması ve dokunulması engellenmelidir. Uygun PPE kullanın. </li><li> Yukarıdaki seyreltme tamponunda primer antikoru (NFP) 1: 600 sulandırın (adım 3.4.1). Örnek hafifçe besleyici üzerinde sallanan tutarak, 3 ° C 3-6 gün boyunca NFP antikoru ile örneği inkübe edin. Daha büyük numuneler inkübasyon sürelerinin artmasını gerektirecektir. </li></ol></li><li> İkincil antikor inkubasyonu <ol><li> Bağlanmamış birincil antikoru çıkarmak için numuneyi oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS&#39;de 4x yıkayın. </li&gt; <li> 0.2 g BSA ve 0,3 mL Triton X-100&#39;ün 100 mL 0.01 M PBS (pH 7.4) içinde eritilmesi ile sekonder antikor için seyreltme solüsyonunu hazırlayın. </li><li> Seyreltme tamponu (adım 3.5.2) ikincil antikor (peroksidaz konjuge, afinite saflaştırılmış koyun anti-fare IgG-HRP) 1: 600 seyreltin. Numuneyi, ikincil antikor ile 4 ° C&#39;de 3 gün inkübe edin ve numuneyi yavaşça nutrator üzerinde salıncak tutun. </li></ol></li><li> renklendirme <ol><li> Çözeltiyi karanlıkta tutarak, duman dolabının altında 0.002 g 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB), 0,05 mL mol / L Tris-HCI tamponuna (pH 7.6) ilave ederek DAB renklendirme çözeltisini hazırlayın. </li><li> Numuneleri oda sıcaklığında PBS 4x&#39;de 1 saat boyunca yıkayın. </li><li> Yeni hazırlanmış DAB renklendirme çözeltisine 10 uL% 30 H202 ekleyin ve 4 ° CO / N&#39;de solüsyon ile inkübe edin veya hafifçe nutrator&#39;da sallanırken 3 d süreyle inkübe edin. </li><li> Reaksiyonu pla tarafından durdurunOptimum boyama yoğunluğuna ulaşıldığında PBS içinde% 0.04 sodyum azid ile numuneyi cingleyin. NOT: Bu adıma kadar sodyum azid kullanmaktan kaçının, çünkü bu yaban mersini peroksidazını inhibe eder. </li></ol></li><li> Boyalı dokuyu görüntüleme <ol><li> PBS içeren bir petri cam tabakasına (5 cm yüksekliğinde, 10 cm çapında) dikkatli bir şekilde örnek aktarın. Bir stereomikroskopta monte edilmiş bir kamera kullanarak tümüyle monte edilmiş görüntüleri yakalayın. NOT: Şeffaf bir cam tabağa PBS içinde tamamen batırılmışken, tümüyle monte lekelenmiş dokular görüntülenecektir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+hypoglossal+nerve+in+the+chick+embryo+as+observed+by+the+whole-mount+nerve+staining+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method.</a> Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+the+avian+vagus+nerve+with+special+reference+to+the+morphological+innervation+of+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung.</a> Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+avian+trigeminal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of avian trigeminal nerves.</a> Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anatomy+of+innervation+of+the+gallbladder+in+humans+and+Suncus+murinus+with+special+reference+to+morphological+understanding+of+gallstone+formation+after+gastrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy.</a> World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+the+pancreas+in+the+house+musk+shrew%2C+Suncus+murinus%2C+with+special+reference+to+the+blood+supply+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15782096">Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures.</a> Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4087648/">Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy.</a> World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).</li>
<li>Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26179953">Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study.</a> Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+proteins+in+axonal+regeneration+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases.</a> Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).</li>
<li>Wyatt, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+the+sphincter+of+Oddi+to+the+stomach%2C+duodenum+and+gall-bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder.</a> J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).</li>
<li>Mawe, G. M., Kennedy, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+neurons+provide+nicotinic+fast+synaptic+input+to+sphincter+of+Oddi+neurons+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig.</a> Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).</li>
<li>Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+neuropeptidergic+properties+of+the+duodenal+neurons+projecting+to+the+gallbladder+in+the+golden+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster.</a> Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).</li>
<li>Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+nerve+cells+from+the+duodenum+to+the+sphincter+of+Oddi+and+gallbladder+of+the+Australian+possum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum.</a> Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).</li>
<li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. (62), e4042(2012).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu çalışma, nörofilament proteine ​​karşı bir antikor kullanarak ekstrahepatik safra yolunun innervasyonunun görselleştirilmesi için deneysel prosedürü açıklamaktadır. Bu protokol, Kuratani ve Tanaka 1 , 2 , 3 tarafından tanımlanan protokolden uyarlanmıştır. Bu deney için, tüm montaj boyama yaklaşımı 2-3 hafta sürdüğü için, deneylerin her biri için zaman çizelgesini planlayın. Dondurma / çözülme işl...

Ev sinek fıtığı , Suncus murinus , Insectivora ve Soricidae ailesine aittir. Bu minik memeli, Güneydoğu Asya&#39;da dağılmıştır ve insan yerleşim yerleri veya sığır kalemlerinin yakınında bulunan evlere ve çimenlik alanlara yerleşmiştir. Bu tür, fare, sıçan ve tavşan gibi diğer laboratuar hayvanlarına göre insanlara daha fazla benzeyen genel morfolojik özellikleri sergilemektedir. Daha önce, pankreas 6 , büyük duodenal papilla 7 , pilor 8 , safra kesesi 5 ve ekstrahepatik safra yolu 9&#39;daki periferik sinirleri etiketlemek için S. murinus nevrofilament proteini (NFP) için bir periferik nöron işaretleyici ile birlikte tümüyle bağlanan immün boyama yapıldı. NFP olgun nöronal hücre iskeletinin bir parçası olan makromoleküler bir kompleksdir. Nörofilamanla ilgili proteinNFP ve zigosom arasındaki etkileşime aracılık eder. Hem enzim fonksiyonu hem de bağlayıcı proteinlerin yapısı NFP 10 tarafından düzenlenir. NFP kompleksi üç polipeptidden oluşur: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) ve NF-H (200 kDa). NFP hem merkezi hem de periferik sinir sisteminde nöronal aksonlarda bulunabilir. Anti-insan NFP antikorunun, merkezi ve periferik sinir sisteminin aksonlarını işaret ettiği gösterilmiştir. Anatomik ve elektrofizyolojik araştırmalar sfinkter, safra kesesi ve proksimal gastrointestinal sistemin 11 , 12 , 13 , 14&#39;e bağlı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, nöronal bağlantılarının morfolojik özellikleri henüz tanımlanmamıştır. Bu çalışma, S. murinus bil&#39;in innervasyonunu etiketlemek için tam monte bir immünohistokimyasal boyama yönteminin kullanılmasını göstermektedirBir NFP antikoru ile birlikte.

<table><tbody><tr><td>ortoperiyodik asit</td><td>Wako</td><td>162-00732</td><td></td></tr><tr><td>papain</td><td>Wako</td><td>164-00172</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini (BSA)</td><td>Wako</td><td>010-15131</td><td></td></tr><tr><td>sodyum azid</td><td>Nacalai Tesque</td><td>312-33</td><td></td></tr><tr><td>nörofilament protein (NFP) antikoru</td><td>Dako</td><td>M0762, lot 089, klon: 2F11</td><td></td></tr><tr><td>peroksidaz konjuge afinite saflaştırılmış koyun anti-fare IgG-HRP</td><td>MBL</td><td>Kodu 330</td><td></td></tr><tr><td>3,3 '-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)</td> <td>Wako</td><td>349-00903</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma</td><td>I-0125</td><td></td></tr></tbody></table>

safra yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin bir tam montajlı İmmünohistokimyasal yöntem kullanmak<em&gt; suncus murinus</em

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Bu çalışma, tüm montaj immünohistokimyası boyama yöntemini detaylı olarak anlatmaktadır; nörofilament protein antikoru, Sunci murinus ( S. murinus) &#39; daki safra yolunun innervasyonunu etiketlemek için kullanmaktadır &#160; ). İlk olarak, numune S. murinus&#39;dan ayrılmış ve% 4 paraformaldehitle (PFA) sabitlenmiştir. İkincisi, bir enzimatik tedavi ve potansiyel endojen peroksidaz inaktivasyonu gerçekleştirildi. Sonra, numune birincil antikor anti-nörofilament protein antikoruna 3-6 gün maruz bırakılmıştır. Ardından, yaban mersini peroksidazı ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe edildi. Renk reaksiyonu, numunenin bir 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB) substratı ile reaksiyona sokulmasıyla ortaya çıkmıştır. Bu yöntem bütün iç organların innervasyonunu analiz etmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu protokol, diğer nöronal antikorları test etmek için de adapte edilebilir, ancak antibodilerin optimizasyonuEsler önce yapılmalıdır. Bu yöntem başlangıçta Kuratani ve Tanaka tarafından tanıtıldı 1 , 2 , 3 .

Şekil 1 - 4 , S. murinus&#39;un ekstrahepatik safra yolunda NFP-pozitif sinir lifleri için tipik sonuçları göstermektedir. NFP&#39;ye karşı antikor, yüksek özgünlük ve asgari seviyede ekstrahepatik safra yolunun ( Şekil 1 ), safrakesesi ( Şekil 2 ), üst safra kanalının ( Şekil 3 ) ve duodenal papilla alanının ( Şekil 4 ) tüm gö...

Sunkus murinustaki ekstrahepatik safra yolundaki nörofilament protein ekspresyonunu görselleştirmek için bütünüyle monte edilen bir immünohistokimyasal yaklaşım . Burada sunulmaktadır. Bu protokol, S. murinus veya diğer türlerdeki tüm iç organların innervasyonunu analiz etmek için kullanılabilir.

Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Bu prosedürün genel amacı, Suncus murinus'un safra yollarındaki sinir dağılımının görüntülenmesi için whole-mount immünohistokimyasal boyama yöntemini uygulamaktır. Bu yöntem, birçok türün visseral organlarının, özellikle standart yöntemlerle değerlendirilmesi zor olan düzensiz veya küçük organların sinir dağılımını analiz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, işlemin basit olmasıdır.Karmaşık prosedürler gerektirmez ve başarı oranı yüksektir. Prosedürü beraberimde, her ikisi de laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Yidan Dai ve araştırma görevlisi Shuang-Qin Yi uygulamalı olarak gösterecekler. İşleme, hayvanı bir çeker ocak içerisinde tek tek PBS ve %4 paraformaldehit perfüzyonları ile yıkayarak başlayın.Ardından, kan damarlarını işaretlemek için perfüzyon kateteri aracılığıyla abdominal aortaya iki ila üç mililitre beyaz neopren lateks enjekte edin. İlgilenilen tüm dokular işaretlendiğinde, abdominal organları ve bunlarla ilişkili sinirleri ve damarları çıkarın. Sonra, safra sistemini işaretlemek için safra kesesine yaklaşık 0,1 mililitre mavi neopren lateks enjekte edin ve dokuları, bütün bağışıklama boyaması (whole-mount immunostaining) için 4% paraformaldehit içinde dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca post-fikse edin.Ertesi sabah, örneği distile su içerisinde nutatör üzerinde, oda sıcaklığında birer saatlik dört yıkama için cam bir flakona aktarın. Son yıkamanın ardından, herhangi bir intrinsik peroksidaz reaksiyonunu önlemek için dokuları oda sıcaklığında, taze hazırlanmış %1 ortoperiyodik asitte 20 dakika inkübe edin. Ardından örneği oda sıcaklığında distile su ile 10 dakika yıkayın ve ardından taze hazırlanmış %0,004 papillon içerisinde, 37 °C sabit sıcaklıktaki su banyosunda hafif sallama eşliğinde iki saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonunda, örneği 50 ila 60 dakika boyunca distile su ile yıkayın. Ardından dokuları gece boyunca dört derece Celsius'ta %4 paraformaldehitte saklayın. Ertesi sabah, örneği az önce gösterildiği gibi distile su ile yıkayın ve ardından taze hazırlanmış papillon içerisinde iki saatlik başka bir inkübasyon gerçekleştirin.Numuneyi distile su ile 50 ila 60 dakika daha yıkayın, ardından %4 paraformaldehit ile gece boyunca sabitleyin. Üçüncü gün sabahı, dokuları distile su ile dört kez yıkayın ve ardındanle ardışık olarak artan üç farklı sükroz inkübasyonunda 30'ar dakika bekletin. Daha sonra numuneyi -20 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca dondurun ve ardından oda sıcaklığında tamamen çözülmesini sağlayın.Üçüncü dondurma-çözme döngüsünden sonra, örneği %2 Triton X-100 içerisine aktararak 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, örneği ilgilenilen birincil antikorun bulunduğu bir kaba aktarın ve numunenin boyutuna bağlı olarak 4 °C'de nutatör üzerinde üç ila altı gün boyunca hafifçe sallayarak bekletin. Uygun markalama süresinin ardından, bağlanmamış birincil antikoru oda sıcaklığında PBS ile yapılan dört adet bir saatlik yıkama ile uzaklaştırın ve numuneyi uygun ikincil antikor ile 4 °C'de hafifçe sallayarak üç gün boyunca markalayın.Sekonder antikor işaretleme süresinin sonunda, numuneyi PBS ile dört kez yıkayın. Daha sonra dokuları, 100 ml taze hazırlanmış %0,002'lik DAB boyama çözeltisi içindeki 10 µL %30'luk hidrojen peroksit ile birlikte, dört derece Celsius'ta, hafifçe sallayarak 16 ila 72 saat boyunca inkübe edin. Optimal boyama yoğunluğuna ulaşıldığında, boyama reaksiyonunu durdurmak için numuneyi PBS içindeki %0,04'lük sodyum azide aktarın.Ardından örneği, taze PBS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına dikkatlice daldırın ve bir stereo mikroskoba monte edilmiş kamera kullanarak dokuların bütünlemesine (whole-mount) görüntülerini yakalayın. Ekstrahepatik safra yollarının innervasyonunun görselleştirilmesine ek olarak, nörofilaman pozitif sinir liflerine karşı antikor ile markalama, vagus sinirinin özofagus boyunca ve mideye doğru seyri ile dağılım yoğunluğunun kesin olarak tanımlanmasını da sağlar. Safra kesesi kan damarlarının beyaz neopren lateks ile markalanması, çevre dokulara kıyasla yüksek kontrastta ince sinirsel fibrozları ortaya çıkarır; burada safra kesesinin boyun kısmında, fundus kısmına göre daha yüksek bir innervasyon yoğunluğu gözlemlenir.Üst safra kanalında iki tip sinir demeti işaretlenmiştir: safra yollarının üzerinde ve içinde yapışık şekilde seyreden, düzensiz ve yoğun bir sinir ağı oluşturan ince sinir demetleri ile safra yolu yüzeyine paralel olarak dağılan daha kalın sinir demetleri. Ana safra kanalının mavi neopren lateks ile, damarların ise beyaz neopren lateks ile işaretlenmesi, ana safra kanalının ucundaki ve duodenal papilla bölgesindeki ince sinir liflerinin görselleştirilmesine olanak tanır. Bu prosedürü uygulamadan önce, tüm sürecin tamamlanması iki ila üç hafta sürdüğü için her bir deneyin zaman çizelgesini dikkatlice planlayın.Çözeltileri değiştirirken numuneye zarar vermemek için, numuneyi pensle çıkarmak yerine her zaman çözeltileri dökerek boşaltın. Bu videoyu izledikten sonra, bu tekniği çeşitli visseral organlar içindeki bir dizi sinirin etiketlenmesine uygulayabiliyor olmanız gerekir.

using-whole-mount-immunohistochemical-method-to-study-innervation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Cajal interstisyel hücreler (ICC), gastrointestinal (Gİ) sistem kalp pili hücreleri. Bunlar, düz kas hücreleri ve gastrointestinal kontraktilite düzenlemek için post-ganglion nöronal liflerdir arasındaki karmaşık ağları oluşturmaktadır. Burada, immünofloresan kesitsel yöntemler ve fare ICC ağlarının bütün montaj görselleştirme sunuyoruz.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

Fizyolojik anjiyogenez ve yoksun Normal erişkin vaskülarize memeli doku çalışma için kullanılan cerrahi müdahaleye maruz kalmamış: (i) başlatılması ve test ajanların intraperitoneal uygulanması aşağıdaki anjiyogenez geliştirilmesi; ve sistemik uygulanması aşağıdaki (ii) anjiyogenez değişiklik Test ajanlar seçilir.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

Bu video, meme kanserinin bir fare modelinde tümör hedefleme antikorlarının biyolojik dağılımını incelemek için in vivo immünofloresan lokalizasyon (IVIL) tekniğini göstermektedir. Farede tümöre özgü bir antikorun intravenöz enjeksiyonu üzerine, tümör cerrahi olarak izole edilir ve antikorun tümör dokusu içindeki lokalizasyonu ex vivo immün boyama yoluyla doğrulanır.

Antikor Biyodağılımını İncelemek için Bir İn Vivo İmmünofloresan Lokalizasyon Yöntemi

Bu video, immünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanarak nöronal popülasyon dağılımını görselleştirmek ve analiz etmek için embriyonik murin gastrointestinal sisteminin immün boyamayı göstermektedir.

Embriyonik Murin Gastrointestinal Sistemindeki Nöronal Popülasyonların İmmünofloresan Boyanması

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Ekokardiyografik inceleme farelerde sık sık kullanılır. Bu amaç için pahalı yüksek çözünürlüklü ultrason cihazları geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı histolojik xarakteristikaları analizler ile kardiyak Morfoloji belirlemek için birlikte uygun fiyatlı bir Ekokardiyografik yordamı açıklar.

Kardiyak Morfoloji Ekokardiyografik ve histolojik muayene fare

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Öğrenin, Suncus murinus safra yolundaki sinir dağılımını görselleştirmek için tam montajlı immünohistokimya yöntemini. Bu teknik, küçük ve düzensiz iç organların innervasyon analizi için basit ve güvenilir bir yaklaşım sunar.

Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak

Daha fazla video keşfet