Name: Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Keşfedin, fare meme dokusunun bütün dağılımlarını kesitlere ayırarak mikroskobik düzeyde lezyon tanımlaması yapma yöntemini. Bu teknik, histopatolojik değerlendirmeyi geliştirerek üreme biyolojisi araştırmalarında doğru sonuçlar elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu projeyle ilgili teknik uzmanlıkları ve desteği için Pam Ovwigho, Tenette Jones ve Natasha Clayton, NIEHS&#39;yi onaylamak istiyorlar.

Bu çalışma için tüm hayvan kullanımı ve prosedürleri NIEHS Laboratuar Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve bir Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği Laboratuar Hayvan Bakımı tarafından akredite edilmiş tesis. 1. Meme Tam montajlı Hazırlama 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> Referans 3&#39;te açıklandığı gibi gebe olmayan bir CD-1 dişi farenin bir tarafındaki kasık bezi bezlerini çıkarın ve bunları elektrostatik yüklü bir slayda yerleştirin. </li><li> Bezi yapışmayan kâğıda veya filmle örtün ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. Sızdırmazlık bezi sabitlemek için sızdırmazlık bezi slaytlar yapacak şekilde bezin düz bir şekilde dışarıya yayılması için slayda basınç ( yani su ağırlıkları) ekleyin. </li><li> Slaytları fiksatif suya daldırın ( örn. % 100 etanol, kloroform ve buzlu asetik asit 6: 3: 1 oranında)Gece boyunca oda sıcaklığında. </li><li> Fiksatif bezleri çıkarın ve 15-30 dakika etanol ile yıkayın. 30 dakikalık yıkamayı takiben, etanolun 1 / 3&#39;ünü dökerek su ilave edin ve su ekleyin. Yıkama her seferinde yaklaşık 5 dakika bekletilmeli ve su ilave edilerek 3 kez tekrar edilmelidir. </li><li> Lekeyi ( örn., Karmin alum çözeltisi) 12-24 saat boyunca. NOT: Daha kalın dokular uzun boyanma süreleri gerektirir. Boyama detayları için referans 3&#39;e bakınız. </li><li> Boşa dökülen zamandan sonra dökün ve slaytları 30 saniye süreyle suyla durulayın. Slaytları% 70 etanol içinde 15 dakika yıkayarak dokuları kurutun, bunu takiben% 95 etanol içinde 15 dakika yıkayın ve 20 dakika süreyle% 100 etanol içinde nihai yıkama yapın. </li><li> En az 24 saat boyunca ksilende yerleştirerek dokulardaki yağları temizleyin veya doku kalınsa herhangi bir opak veya beyaz alanı uzaklaştırmak için yağları temizleyin. </li><li> Ksilenden dokuyu çıkarın ve hızlı bir şekilde mDoku dehidrasyonunu önlemek için slaydaya orta besleme; Üzerine lamel yerleştirin. Slayt en az 48 saat kurumasını bekleyin. </li><li> 2&#39;de tarif edildiği gibi, anormallikleri için bütün monte doku değerlendirir. NOT: Tüm lekelerde lezyonlar tespit edildiğinde ve bölümlerin kimlik tespiti için gerekli olması durumunda aşağıdaki adımlar takip edilmelidir. </li></ol> 2. Bir Cam Slayt&#39;dan Sütun Dağı Tümünün Çıkarılması <ol><li> Mamul tam monte slayt bir gece boyunca ksilen dolu cam boyama kavanoza batırarak lamel ve montaj orta çıkarın. NOT: Aşırı montaj çözeltisine sahip daha kalın dokular ve slaytlar lamel kaldırma için ek zaman gerektirebilir. </li><li> İlk gece beklettikten sonra, slaytları taze ksilen içine yerleştirin ve 6 saat bekletin. Bir gece boyunca taze ksilen koyun. NOT: Lambalı son bulamadan sonra slayttan kolayca düşer. </li><li> Ag ileElinizi severek slayt tutun ve bir parça halinde çıkarılmasını sağlamak için dikkatli bir forsepsle birlikte lamelleri çıkarın. NOT: Lamerleri hala cam slaydına yapıştırdıysanız, az miktarda çaba harcayana kadar ıslanmaya devam edin. </li><li> Lamel kaldırıldıktan sonra, sürgüyü ksilen içeren cam bir Petri kabına dik tutun, dikkatlice keskin, tek kullanımlık traş bıçağı alın ve bıçağı kaydırarak tek bir hareketle kaydırın. </li><li> Doku kaldırıldıktan sonra, dokunun hava kuruması sağlanmadığından emin olmak için meme pedini bir ksilen dolu cam Petri kabına daldırın. NOT: Bu adımda dikkatli olun. Bütün gövde ince (≤ 1 mm) ve ksilen işlenmesinden kırılgan. Herhangi bir izlenim veya gözyaşı dokunun morfolojisini değiştirebilir ve daha sonraki değerlendirmeleri daha da karmaşık hale getirebilir. </li></ol> 3. Doku İşleme <ol><li> Doku Petri kabında olduğunda, onu dikkatle aktarınEtiketlenmiş bir histoloji kasetine. Doku hasarını en aza indirgemek için küt uçlu, tırtıklı uçlu forseps ile yağ yastığının kenarından tutun. <ol><li> Bir ustura kullanarak, büyük dokuları (özellikle sıçanlar için) yarım kesip, doku boyutlarını karşılayacak iki ayrı etiketli kasete yerleştirin. Dokuyu sağ tarafa yerleştirin (lenf nodunu referans olarak kullanın). Lenf düğümü olmayan dokunun, kasete aktarıldığında aynı dik konumda tutulduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Kaseti, doku işlemcisine yerleştirmeden önce en fazla 2 saat boyunca bir ksilen kabı içine yerleştirin. NOT: Örneklerin kasete yerleştirildiği gün işleme tabi tutulması önerilir. Ksilen içinde uzatılmış ıslatma test edilmemiştir. </li><li> Elle doku işlemcisine maksimum sayıda kaset yükleyin. </li><li> Başlamadan önce, bu işlem için kullanılacak tüm reaktifleri işlemcinin reaktif listesine programlayın. Hareketi otomatikleştirmek içinBir istasyondan diğerine geçmek için menü seçeneklerini kullanın ve yeni bir program oluşturun. Tüm adımlar tamamlandığında, devam etmek için &#39;Tamam&#39;ı seçin. NOT: İşlemci, başlamadan önce tüm istasyon ayrıntılarının gözden geçirilmesine izin verir. <ol><li> İşlemciyi kasetleri, 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca ksilen içinde bekletmek üzere otomatik hale getirin ve ardından ikinci kez aynı koşullar altında yeni ksilen emdirin. İşlemciyi, ksilol çözeltisinden çıkarmak için makineyi otomatikleştirin ve dokuları 30 dakika boyunca 60 ° C&#39;ye ayarlanmış bir 1: 1 ksilen: eritilmiş parafin karışımı içeren bir sonraki istasyona aktarın. NOT: İşlemci daha sonra kasetleri, 1 saat erimiş parafin içeren yeni bir odaya aktaracaktır. 1 saat sonra numuneler otomatik olarak yeni bir eriyik parafin odasına aktarılır ve 2 saat daha işlenir. Her iki adım da 60 ° C&#39;de gerçekleştirilir. </li><li> İşlemci daha sonra kasetleri eriyik para içeren istasyona aktarır1 saat boyunca ffin. Daha sonra, numuneler otomatik olarak taze eritilmiş parafinin son istasyonuna aktarılır ve 2 saat daha işlenir. Her iki adım da 60 ° C&#39;de gerçekleştirilir. </li></ol></li></ol> 4. İşlenmiş Meme Doku Gömme <ol><li> Kasetleri kalıba gömmek için hazır olana kadar gömme istasyonunun 58 ° C&#39;lik parafin tutma tankına yerleştirin. </li><li> Doku için en iyi kalıp boyutunu belirlemek için kaset kapağını çıkarın. Kalıbın dokuyu yerleştirmek için yeterince büyük olduğundan ve çevre çevresinde doku içermeyen parafin bir sınır olması için yeterli yer bıraktığından emin olun. </li><li> Kalıpta 3-4 mm erimiş parafin ekleyin ve cam slaytun tabanına ve kasetin altına komşu olan memeye tümüyle monte edilmiş yüzeyi, kalıpta yukarı bakacak şekilde yönlendirin. </li><li> Kalıbı bir soğutma plakasına aktarın ve dokuyu gerektiğinde kalıba paralel olacak şekilde hızla ayarlayın bottom. NOT: Parafin sertleştikten sonra doku yerinde korunacaktır. </li><li> Sıcak forseps kullanarak kasetin etiketli alt yarısını kalıp üzerine yerleştirin; Forseps kullanarak sıkıca bastırın. </li><li> Tüm kaseti kaplayacak şekilde sürekli eriyik halinde kalıba ilave erimiş parafin ekleyin. Blok sertleşmesini tamamlamak için kalıp ılık plakadan soğuk bir plakaya hareket ettirin. </li><li> Çatlaklar veya hava kabarcığı önlemek için parafin tamamen katılaştığında bloğu kalıptan çıkarın. NOT: Parafine gömülmüş dokuları, hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> 5. Parafine gömülü Meme Dokusunun MikroTomda Parçalanması <ol><li> Kesit almadan önce parafin bloklarını -20 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. NOT: Blokta, orijinal kaplamalı tüm montaj dokusundan artık montaj ortamı olacaktır. Bloğu soğutmak, blok kesitlemeyi ve şeritleme işlemini geliştirir. </li><li> Mikrofonu hazırlaTaze susuz su içeren su banyosunu açarak rotome yapın ve sıcaklığı 42-45 ° C&#39;ye ayarlayın. Mikrotom üzerine yeni, alçak profilli bir bıçak yerleştirin ve 4 μm&#39;ye ayarlayın. NOT: Dokuda artık montaj ortamı bulunması nedeniyle bölüm kalitesi 4 μm&#39;den kalın bölümlerle azalır. </li><li> Balonu balata bakacak ve dikey düzleme hizalayacak şekilde bloğu mikrotom içine yerleştirin. Ardından, gazlı bezin bir bölümünü soğuk suda nemlendirin ve birkaç dakika boyunca bloğa yerleştirin. </li><li> Büyük tekerleği, kaba gelişmiş tekerlekle birlikte saat yönünde hareket ettirerek, tam bir yüz veya temsilci blok bölümü elde edilinceye kadar bloğu parçalayın. NOT: Bütün montaj işlemi sırasında ksilen temizlendiğinden doku incedir. Temsili bir kesim elde etmede kesilme sayısını en aza indirgemek için bloğu düz bıçakla hizalayın. </li><li> Şerit seçElle bölüp şeridi ılık (45 ° C) su banyosunda önceden püskürtün (önceden hazırlanmış), doku kırışıklarının dağılmasına izin verin ve bir bölümü temiz bir cam slayt üzerine dikkatlice yüzdürün. </li><li> Fazla suyu alabilmek için slaytları dikey bir kurutucuya yerleştirin. Slaytları hafifçe açılmış bir slayt kutusunda gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 6. Bölmeli Meme Dokularının Otomatik ve Manuel H &amp; E boyanması <ol><li> Boyamadan önce, slaytlar oda sıcaklığında saklanır. </li><li> Otomatik boyama için, ana menüdeki leke seçeneklerinden H &amp; E&#39;yi seçin. Deparaffinizasyon, boyama ve dehidrasyon, otomatik boyayıcıda tamamlanır. Bölümleri monte etmek için montaj orta ve lamel kullanın. </li><li> Sürgüleri manuel olarak boyarsanız, sürgüleri 5 dakika süreyle ksilen içine batırarak bölümleri deparafinize hale getirin. Yeni ksilen&#39;e aktarın ve 5 dakika tekrarlayın. </li><li> Slaytları suya batırarak yeniden su haline getirin.Em üç dakikada% 100 etanol ile iki kere uygulayın, bunu takiben% 95 taze etanol içinde iki kez tekrarlayın ve 5 dakikada bir 1X yıkama tamponu içinde iki ayrı yıkama yapın. </li><li> Slaytları damıtılmış suda yıkayın. </li><li> Slaytları 1-2 dakika boyunca hematoksilen içine ekleyin. Sürgüleri çıkarın ve 5 dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın. NOT: Hematoksilen her kullanımdan önce filtrelenmelidir. </li><li> Renk ayrımını artırmak için slaytları 30 saniye süreyle% 1 buzlu asetik asit içine yerleştirin ve akan musluk suyunda 1 dakika boyunca durulayın. </li><li> Doku bölümlerini mavileştirmek için 30 saniye ile 1 dakika arasında 1X PBS&#39;ye slaytlar ekleyin, bunu takiben musluk suyunda 5 dakika durulayın ve daha sonra 15-20 saat boyunca% 95 alkolle yıkayın. </li><li> 30 dakika ila 1 dakika süreyle eozin çözeltisi ile karşı lekeler. Bunu takiben, slaytları taze% 95 etanol içinde iki kez kurutun ve ardından% 100 etanol içinde iki kez tekrarlayın. Her bir yıkamayı 5 dakika boyunca uygulayın. </li><li> Ksilendeki kayaları temizleyin, her biri 5 dakika süreyle ksilende iki değişiklik yapın. </li><li> coverslipMontaj orta ve kuru gece boyunca oda sıcaklığında doku bölümü. </li></ol>

<ol><li>Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+exposures+and+mammary+gland+development%3A+State+of+the+science%2C+public+health%2C+implications%2C+and+research+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations.</a> Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).</li>
<li>Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+via+Nurture%3A+Effect+of+Diet+on+Health%2C+Obesity%2C+and+Safety+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment.</a> Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).</li>
<li>Stanko, J. P., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/55789/quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using">Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method.</a> J Vis Exp. , In press (2017).</li>
<li>Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf">http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf</a> (2011).</li>
<li>Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf">http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf</a> (2011).</li>
<li>Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm">http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm</a> (2016).</li>
<li>Whole mount preparations. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149">http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149</a> (2016).</li>
<li>Filgo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+evaluation+in+juvenile+toxicity+studies%3A+Temporal+developmental+patterns+in+the+male+and+female+Harlan+Sprague+Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+high-quality+hematoxylin+and+eosin-stained+sections+from+rodent+mammary+gland+whole+mounts+for+histopathologic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+preparation+of+tissue+sections+from+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Path%22%5BJournal%5D)">An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland.</a> Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).</li>
<li>Munoz-de-Toro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+exposure+to+bisphenol-A+alters+peripubertal+mammary+gland+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice.</a> Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).</li>
<li>Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+the+phytoestrogen+genistein+alters+mammary+gland+growth+and+developmental+programming+of+hormone+receptor+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels.</a> Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).</li>
<li>Nikaido, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+maternal+xenotestrogen+exposure+on+development+of+the+reproductive+tract+and+mammary+gland+in+female+CD-1+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring.</a> Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).</li>
</ol>

Yazarların, bu makalenin araştırması, yazarlığı ve / veya yayımı ile ilgili olarak beyan etmek için çelişkili çıkarları yoktur.

Meme bezi tam montajı, endokrin bozucular da dahil olmak üzere kimyasallara maruz kaldıktan sonra ortaya çıkabilen ve devam edebilen normal meme gelişimini ve morfolojik değişiklikleri göstermek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Aynı hayvandan bir bütün montaj ve H &amp; E bölümü birlikte değerlendirildiğinde, erken hastalıkların daha hastalıklı bir duruma gelebilecekleri konusunda doğru görsel bir enstantane sağlayabilirler. Bu yararlı bilgiyi edinme kabiliyeti, dokuyu çıkartırken gl...

Meme bütünlüğü, normal ve kimyasal olarak uyarılan anormal gelişimin anlaşılması için birçok sıçan ve fare çalışmasında uygulanan yararlı ve ucuz bir yöntemdir. Genel olarak, kemirgen gelişimi sırasında ( yani ergenlik, ergenlik, orta-geç gebelik ve involüsyon evresi) çeşitli aşamalarında toplanan bir meme bezi, parakrin, endokrin ve otokrin faktörlerden etkilenen doku ve hücresel mimaride morfolojik değişiklikler gösterecektir 1 . Yaşlanmakta olan sıçanda, bezin epitelial ve stromal kısımları gittikçe yoğunlaşmakta ve bu da morfolojik parametrelerin ölçülmesini bütün montajda zorlaştırmaktadır. Bu nedenle mikroskobik seviyedeki değişiklikleri tanımlamak için histolojik değerlendirme için bir bez toplamak yaygın bir uygulamadır. Her iki proses özellikle kimyasal maruziyeti içeren ( yani çevresel veya farmasötik) çalışmaları veya genetik değişiklik eşliğinde morfolojik değişiklikleri incelemek için yararlıdırations. Risk değerlendirmesinde meme bezini kullanma teknikleri ve yetenekleri gelişmeye devam etmektedir. Bütün montaj hazırlığı rutin ve standartlaştırılmış iken, kesitlemedeki değişiklikler 2 , 3&#39;e devam eder. Bazı laboratuarlar hala deri 4 boyunca enine kesim bölümleri kullanırken çeşitli arka (yani, akademik, hükümet ve endüstri) gelen çok sayıda araştırma grupları, tercih edilen yöntem olarak meme dokusunda uzunlamasına / koronal kesitler adapte edilmiştir. İkinci yöntem, ilgili dokudan ziyade epidermisin (cilt) aşırı derecede temsil edilmesine neden olur: meme bezi epiteli 2 . Koronal veya uzunlamasına kesitler, normal dokuyu 5 karakterize etmek için daha kullanışlıdır ve artan yüzey alanı ve mevcut yapıların sayısı nedeniyle anormalliklerin ve lezyonların belirlenmesini büyük ölçüde iyileştirir. Genel olarak, bu bütün mo yaparMeme bezi 1 , 2 karşılaştırmalı histopatolojik değerlendirme için uygun bir yöntem. Kasık bezleri inci bir fare ya da bir fare, alma ve 4. korunmasını ve 5 kullanılarak yüksek tüm karşılaştırılması için önerilir olsun kontralateral H &amp; E bölümüne monte edilir. Bileşik olarak kullanıldığında, H &amp; E bölümü ve tüm montaj, çevresel maruz kalmanın neden olduğu hücresel ve morfolojik değişikliklerin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlar. Bu, özellikle modelin tümör oluşumuna karşı düşük duyarlılığa sahip olduğu veya tümörün gözle görülemediği bazı kemirgen suşlarında özellikle geçerlidir. Bazı durumlarda, gerekli dokuyu elde etmek her zaman her iki yöntemi de ( ör. Yetersiz doku miktarı, kaynak veya beklenmedik deney sonuçları) kullanarak mümkün olmayabilir. Olgumuzda meme tümü anormallikleri görülürken histopatoKontralateral H &amp; E bezindeki mantıklı bulgular çoğunlukla normaldi. Kontrlateral bezler arasındaki ezici tutarsızlık, tüm bağlardaki anormalliklerin saptanması için ekonomik ve etkili bir prosedür geliştirdi. Modifiye edilmiş bir işleme ve gömme işlemi uygulayarak, yüksek kaliteli H &amp; E lekeli kesitler, parafin gömülü tüm montajlardan hazırlandı. Bu protokolün kimyasal maruz kalma etkileri için güçlü bir algılama aracı haline gelmesini ve laboratuvarlar arası karşılaştırmaları geliştirmesini düşünüyoruz.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>montaj ortamı, tüm montajları ve H& E bölümleri</td></tr><tr><td>Leica otomatik işlemci</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Otomatik Mikrotom</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus mikroskop slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>elektrostatik şarjlı</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>lameller</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Otomatik slayt boyayıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>sıvı yapıştırıcı; kesit almada su banyosunda kullanılır</td></tr><tr><td>Modifiye Harris Hematoksilen 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (Thermo Scientific'in bir parçası)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Karbonat</td><td>SkyTech Laboratuvarları</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Termo </td><td>Carnoy'un sabitleyici Kloroform Macron'unda gerekli</td>olan Fisher Scientific <td>A38-500</td></tr><tr><td></td><td>İnce Kimyasallar</td><td></td><td>Carnoy'un sabitleyici%</td></tr><tr><td>100 Etanolünde</td> gerekli <td>olan Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>Carnoy'un sabitleyici ve yıkama slaytlarında gereklidir</td></tr><tr><td>%95 Etanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum potasyum sülfat dodekahidrat, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Otomasyon yıkama tamponu, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

lezyon tanımlaması için meme bandı bütün dağılımları

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal meme bezi gelişimi, çevresel toksik maddelere ve farmasötik ürünlere maruz kalma, hormonlara aşırı maruz kalma ve genetik değişikliklerle değiştirilebilir. Meme bezi tüm montajları maruz kaldıktan sonra ortaya çıkabilecek morfolojik değişikliklerin ilerlemesini yakalamak için ucuz bir yöntemdir. Bununla birlikte, sonraki yaşamda, anormalliklerin gelişme eğilimi daha fazla olduğunda, bu metot üzerindeki tek dayanak, anormalliği doğru bir şekilde teşhis etmek için her zaman yeterli bilgi sağlamayabilir. Tarihsel olarak, kimyasal test kılavuz çalışmalarında tek bir meme bezi otopside alınır ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyalı kesit olarak hazırlanır. Karşı taraf meme tüm montajı toplama ve analizin dahil edilmesi yanlış-negatif bir değerlendirme olasılığını azaltır. Tüm desteğin değerlendirilmesi, bir slaytta bir veya iki tüm meme bezinin varlığı ile sınırlıdır ve bazı durumlarda, tüm yuvada gözlemlenen anormallikler hayırH &amp; E bölümünde tek biçimli olarak temsil edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, aksi halde kaçırılmış veya tanı koymak güç olan lezyonların tanımlanması için lamelleri örten meme tümörünün H &amp; E lekeli bölümlerine dönüştürülmesi için bir protokol geliştirmektir. Burada, başlangıçta bütün olarak hazırlanan meme bezinden yüksek kaliteli, parafin gömülü bir H &amp; E bölümü üretmek için bir yöntem ayrıntılı. H &amp; E kesitlemesi için kasıtlı olarak hazırlanmış bir dokuya kıyasla, tüm gövde doku çıkartılması ve işlenmesi için ilave hazırlık gerektirir. Bununla birlikte, bu yöntem, ortak lab reaktifleri ve az ek süre gerektirdiği için ucuzdur. Sonuç olarak, bu metot, kimyasal ve çevresel maruziyetlerin normal meme gelişimini nasıl değiştireceği ve genetik değişiklikler nedeniyle oluşan değişiklikleri gösterdiği konusunda çok değerli bilgiler sağlayabilir.

Bu yöntem, meme yastığının orijinal kontralateral H &amp; E bölümünde herhangi bir histolojik değişiklik göstermediyse, aksi halde kaçılacak tanılarla desteklemede etkilidir. Bununla birlikte, sonuç, yalnızca başlangıçtaki bütün montaj hazırlığında ve histolojik değerlendirme için doku hazırlanırken dikkat edilmesi halinde yararlı olacaktır. Parafin gömülmesi koruma sağlayacak ve gelecek bölümlere ayırmak için dokuyu korumaya yardımcı olacaktır. <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

Başlangıçta slaytlar üzerinde sabitlenmiş olan meme dokusunu histopatolojik değerlendirme için başarıyla çıkarmak, işlemek, kesmek ve lekelenmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, üreme ve gelişimsel test kılavuz çalışmalarında meme bezlerinin tümünün monte edilmesini ve değerlendirilmesini teşvik edebilir.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Bu prosedürün genel amacı, mikroskobik düzeyde lezyon tanımlaması yapmak için bütün olarak monte edilmiş fare meme dokusundan yüksek kaliteli boyanmış kesitler oluşturmaktır. Bu yöntem, meme bütün montelerinde makroskobik olarak belirlenen lezyon tiplerinin histopatolojik tanımlanması gibi meme bezi değerlendirmesini içeren temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bütün olarak monte edilmiş dokular kullanıldığında meme bezlerinde bulunabilecek lezyonların tanımlanma şansını artırmasıdır.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, bütün mount fenotiplerini aynı hayvanların karşı tarafındaki bezlerden alınan formalinle sabitlenmiş H ve E boyamalı histopatoloji raporlarıyla karşılaştırdığımızda edindik. Tanılarda bir tutarsızlık olduğunu, bütün mountlarda daha fazla lezyonun belirgin olduğunu gördük. Bütün mount çıkarılması ve gömme adımları bu prosedürün başarısı için kritik olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir.Bez, ince ve kırılgan yapısı nedeniyle hassastır. Tüm montaj bellek örnekleri hazırlandıktan ve doku, metin protokolüne uygun olarak anomaliler açısından analiz edildikten sonra, lamlar ksilenle dolu bir cam boyama kavanozuna daldırılarak lameller ve montaj medyumu uzaklaştırılır. Gece boyunca veya daha uzun süre inkübe edin.Slaytları taze ksilen içine aktarın ve örnekleri altı saat boyunca bekletin. Ardından örnekleri tekrar taze ksilene aktarın ve gece boyunca bekletin. Sonrasında, eldivenli bir elle slaytı tutun ve bir pens yardımıyla lamelini tek parça halinde dikkatlice çıkarın.Kapak camını çıkarmanın kolaylığı, bağlama ortamının kalınlığına ve tüm örneğin kapatılmasından bu yana geçen süreye bağlı olarak değişkenlik gösterebilir. Bu nedenle, kapak camı kolayca ayrılana kadar lamın ksilen içinde kalması zorunludur. Kapak camı çıkarıldıktan sonra, keskin tek kullanımlık bir jilet kullanarak, jileti lam boyunca tek bir hareketle kaydırarak örneği çıkarın.Ardından, dokunun havayla kurumasını önlemek için hafıza pedini hızla ksilen dolu cam bir petri kabına daldırın. Daha büyük dokuları ikiye bölmek için bir jilet kullanın. Sonra, doku hasarını en aza indirmek için küt uçlu tırtıklı pensler yardımıyla yağ pedinin kenarından tutun ve parçaları, doku boyutuna uygun, etiketlenmiş iki ayrı kasetin içine düz tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin.Kaseti, doku işlemciye yerleştirmeden önce iki saate kadar ksilen içeren bir kaba koyun. Ardından, maksimum sayıda kaseti doku işlemciye manuel olarak yükleyin. Başlamadan önce, işlemciyi doku işleme için programlayın.Prosedürü otomatikleştirmek için istasyonu, sıcaklığı ve vakum açma/kapama ayarlarını seçin. İşleyiciyi, kasetleri 37 °C'de 30 dakika boyunca ksilen içinde bekletecek, ardından aynı koşullar altında taze ksilen içinde ikinci bir bekletme işlemi yapacak şekilde programlayın. Daha sonra, kasetlerin ksilen çözeltisinden çıkarılması ve dokuların, 60 °C'ye ayarlanmış bire bir ksilen ve erimiş parafin karışımı içeren bir işlemci haznesine 30 dakika boyunca aktarılması için işlemciyi otomatize edin.Tüm adımlar tamamlandığında, devam etmek için tamam veya başlat seçeneğini seçin. Kasetleri, kalıba yerleştirmeye hazır olana kadar 58 degrees celsius sıcaklıktaki bir parafin banyosunun tutma tankına yerleştirin. Dokular için en uygun kalıp boyutunu belirlemek amacıyla kaset kapaklarını çıkarın.Huni ucundan kalıba üç ila dört milimetre erimiş parafin ekleyin, ardından dokuyu erimiş parafin içinde, cam lamın altına ve kasetin tabanına komşu olan meme tüm montaj yüzeyi kalıpta yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Kalıbı bir soğutma plakasına aktarın ve dokunun kalıp tabanına paralel olması için gerekirse hızlıca ayarlayın. Pens yardımıyla, etiketli kaseti kalıbın üzerine sıkıca yerleştirin.Tüm kaseti kaplayacak şekilde, kalıba sürekli bir hareketle ek eritilmiş parafin dökün. Kesit alma için seçilen kesin konumda sabitlemeyi kolaylaştırmak amacıyla kalıbı ısıtıcı plakadan soğuk plakaya taşıyın. Parafin blok tamamen katılaştığında, bloğu kalıptan ayırın.Ve kesit alma işlemi yapılana kadar oda sıcaklığında saklayın. Kesit almadan önce, parafin bloklarını bir saat boyunca -20 °C'de inkübe edin. Ardından, taze distile su içeren su banyosunu açarak mikrotomu hazırlayın ve sıcaklığı 42 ile 45 °C arasına ayarlayın.Ardından, mikrotoma yeni bir düşük profilli bıçak yerleştirin ve dört mikrometreye ayarlayın. Bloğu, mum kısmı bıçağa bakacak ve dikey düzlemle hizalanmış olacak şekilde mikrotoma yerleştirin. Daha sonra, bir gazlı bez parçasını soğuk suyla nemlendirin ve birkaç dakika boyunca bloğun üzerine yerleştirin.Tam bir yüzey veya bloğun temsilci bir kesiti elde edilene kadar, kaba ilerletme tekerleği ile birlikte büyük tekerleği saat yönünde çevirerek bloğu kesin. Ardından, doku kesitini elle sıcak su banyosuna aktarın ve temiz bir lam kullanarak kesiti alın. Fazla suyu gidermek için lamları bir kurutma aparatına yerleştirin.Ardından doku kesitlerini 37 °C'de gece boyunca bekletin. Lamları 37 °C'lik inkübatörden çıkardıktan sonra, boyama işlemi için hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. Otomatik boyama için, lamları boyamak amacıyla ana menüdeki boyama seçeneklerinden H ve E'yi seçin.Deparafinizasyon, boyama vedehidratasyon işlemlerinin tamamı otomatik boyama cihazında gerçekleştirilir. Kesitleri kapatmak için kapatma medyumu ve lam kullanın. Meme dokusu için ideal kalınlığı belirlemek amacıyla dört mikrometre ve altı mikrometre kalınlığında kesitler hazırlanmıştır.Dört mikrometrelik kesitler, epitelyal ve stromal alanların ve bunlara karşılık gelen hücre tiplerinin kolayca ayırt edilebildiği optimal sonuçlar vermiştir. Bu şekiller, normal bezlerin histolojik kesitlerini temsil etmektedir. Her iki bez de sağlam ve homojen, adiposit açısından zengin bir popülasyonla çevrili duktal yapılar göstermektedir.Her kanal, tek bir tabaka basit kübik epitel hücre ile döşelidir ve ikinci bir bazal hücre tabakası tarafından desteklenir. Kontralateral tüm preparatlar, meme bezi kanallarını etkileyen artmış opaklığa sahip bir alan içeriyordu. Ancak, bu opaklığın hiperplastik, inflamatuar veya neoplastik bir değişikliğe bağlı olup olmadığı belirsizdi.Kontralateral tüm montlar burada gösterilmiştir. Bu kesitler, meme bezi kesitindeki büyük bir kan damarının etrafındaki lenfosit sayısının artışı nedeniyle perivasküler inflamasyon olarak teşhis edilmiştir. Bu örneklerde, meme bezi lobüler mimarisi korunmuş, ancak lobüler alveolar hiperplazi nedeniyle normal alveol ve kanalların sayısındaki ve boyutundaki artışla genişlemiştir.Genişlemiş lobüller, proteinli sıvı içeren lümenler oluşturan, iyi diferansiye olmuş ve sıklıkla vakuollü epitelyal hücrelerle döşeli, artmış sayıda alveol ve kanal içeriyordu. Bu prosedürü uygularken, dokunun ksilen nedeniyle kırılgan olduğunu ve kolayca parçalanarak örneğinizin tahrip olabileceğini unutmamak önemlidir. Bu yöntemi denemeden önce, düz yataklı bir tarayıcı kullanarak tüm preparatların yüksek kaliteli fotoğraflarının çekilmesi önerilir.Bu, toksikolojik patoloji alanının, kimyasal tarama için bütün mount (whole mount) değerlendirme yönünde ilerlemesi adına bir fırsattır. Böylece, bu düzeyde lezyonlar tespit edildiğinde, histopatolojik tanı için artık yüksek kaliteli kesitler oluşturulabilir. Bu videoyu izledikten sonra, lezyon tanımlama amacıyla meme bütün mountlarının nasıl çıkarılacağı, gömüleceği ve kesileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Ksilen ile çalışırken laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini ve çalışmanın bir çeker ocak altında gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

sectioning-mammary-gland-whole-mounts-for-lesion-identification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bizim protokol sıçan karın meme bezi nasıl incelemek ve meme bezi bütün bağlar hazırlamak için nasıl açıklamaktadır. Aynı zamanda üç uç noktaları (terminal sonuna tomurcukları sayısı, epitel uzama ve farklılaşma) kullanılarak meme bezi morfolojisi analiz etmek ve bu sonuçlar, diyet değişiklikleri maruz kalan farelerde meme kanseri riskini tahmin etmek için kullanmak nasıl...

Sıçanlarda Meme Bezi Morfolojisi ve Meme Kanseri Riski değişiklikler

Bu yöntem, farelerde meme bezi gelişimi ve işlevi incelemek ve değerlendirmek anlatılmaktadır. Eksize meme bezleri süt ejeksiyon bir oksitosin tabanlı miyoepitelyal hücre daralma tahlil kullanılarak değerlendirilmiştir ise bütün montaj kullanarak geliştirme derecesi değerlendirilir.

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

3 boyutlu (3D) histoloji hacim rekonstrüksiyonu için, bir organın hücrelerden oluşan makroyapılar düzeyindeki değişikliklerinin incelenmesini kolaylaştıran bir görüntü kayıt yaklaşımı sunuyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, vahşi tip ve Igfbp7-boş meme bezleri arasındaki 3 boyutlu değişiklikleri inceledik.

3-Boyutlu Histoloji hacmi ve Fare meme bezlerinin Eğitim için onun Uygulama İmar

Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir.

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Kemirgen içindeki meme bezi gelişimi tipik olarak tanımlayıcı değerlendirmeler kullanılarak veya temel fiziksel özellikleri ölçerek değerlendirilmiştir. Dallanma yoğunluğu, meme gelişiminin objektif olarak ölçülmesi güç bir göstergesidir. Bu protokol, meme bezi dallanma özelliklerinin niceliksel değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır.

Sıçan Memesi Bezinde Dallanma Yoğunluğunun Nicelleştirilmesi Sholl Analiz Yöntemini Kullanarak Bütünüyle Tutturulur

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

Keşfedin, fare meme dokusunun bütün dağılımlarını kesitlere ayırarak mikroskobik düzeyde lezyon tanımlaması yapma yöntemini. Bu teknik, histopatolojik değerlendirmeyi geliştirerek üreme biyolojisi araştırmalarında doğru sonuçlar elde edilmesini sağlar.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Daha fazla video keşfet