Name: Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin, LERLIC-MS/MS ve shotgun proteomics kullanarak glutamin ve asparagin deamidasyon izoformlarını karakterize edin ve nicelendirin. Bu yöntem, karmaşık proteomlarda biyokimyasal süreçleri anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Singapur (NMRC-OF-IRG-0003-2016) ve NTU-NHG Araştırma Grant Yaşlanma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (: Bu çalışma kısmen Eğitim Singapur Bakanlığının (Grant ARC9 / 15 Tier 2) hibe ile desteklenmiştir Grant ARG / 14017). Biz nazik bu çalışma mümkün kılan ambalaj materyalleri sağlayan Dr. Andrew Alpert ve PolyLC ekibine şükranlarımızı ve en içten teşekkürlerimi ifade etmek istiyorum.

1. Uzun uzunlukta Anyon değişim ambalaj (lax) Kılcal Sütun (Not: lax kolon evde bu protokolde tarif olarak paketlenmiş, lax sütunlar da ticari olarak temin edilebilir olmasına rağmen, daha fazla ayrıntı için Materyaller ve Reaktifler: İçindekiler&#39;i bakınız). <ol><li> Bulamaç hazırlamak üzere tamponu (Tablo 1) ambalaj 3.5 mL zayıf anyon değiştirme ambalaj malzemesi, 50 mg süspanse edin. </li><li> bir dişi-dişi bağlantı parçası, bir ferule ve bir dişi somun ile - kılcal sütun (200 um iç çap (ID) boru 50 cm uzunluğunda) ucunu birleştirin. dişi-erkek uydurma içindeki bir ekran 1/16&quot; OD 1 mikron arasında bir gözenek boyutuna yerleştirin (Not:. Burada kullanılan ekran malzeme sızmasını önlemek için ambalaj malzemesinin parçacık boyutundan daha küçük bir gözenek boyutuna sahip olması gerekir kolonu). </li><li> 4500 psi&#39;de çalıştırılan bir basınç pompası kullanan bulamaç ile kılcal paketleyin. (Not: Colu paketleyinambalaj malzemesi kadar mn kolonun girişi) de görülebilir. </li><li> alanına 1.2 de tarif edildiği gibi kılcal kolon diğer ucunu bir araya getirin. </li></ol> 2. Numune Hazırlama Bu protokol modeli proteomu olarak insan beyin dokularından analiz LERLIC-MS / MS uygulanmasını açıklar. (Not: diğer dokuları veya proteomik örnekleri kullanımı durumunda, örnek hazırlama işlemleri adapte edilmelidir.) <ol><li> Doku homojenizasyon: a. üç kez beş dakika boyunca 1 x fosfat tampon solüsyonu ile yıkama, beyin dokuları (50 ila 100 mg). b. 1: 1 ile doku homojenize 2.5 doku / metalik boncuk / SDC homojenizasyon tamponu (Tablo 2) oranı (ağırlık / ağırlık / hacim) bir doku homojenleştirici kullanılarak maksimum şiddette güvenli kilitli tüpler 4 ° C&#39;de 5 dakika karıştırıldı. (Not: SDC homojenizasyon tamponu proteaz inhibitörleri içerebilir önce 3&#39;te gösterildiği gibi) c. ileri geri elde edilen doku homojenatı, santrifüj10.000 xg, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir önceki adımı, m ve yeni bir 1.5 mL tüpe supernatant toplamak. d. Kalan topak için bc adımları tekrarlayın ve hiçbir topak görülünceye kadar gerekli olduğu kadar çok kez süpernatantlar birleştirin. (Not: İkiden fazla kez bc adımları tekrarlayın varsa, santrifüj basamağı sırasında numunenin kaybını önlemek için yeni bir kasa kilidi tüpe örnek ve boncuk taşımak). e. Bikinkoninik asit analizi (BCA) 12 ile elde edilen homojenatlarının protein konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Sodyum deoksikolat (SDC), beyin homojenatlarının içinde çözelti triptik sindirim 13 -assisted. a. Protein disülfid bağları azaltılmasını başlatmak için elde edilen homojenata (Tablo 3 Çözüm 5 belirtilen stok solüsyonu kullanılarak), 10 mM ditiyotreitol (DTT) bir son konsantrasyon ekleyin. b. bir banyoda 30 dakika boyunca inkübe edin Homojenat60 ° C&#39;de daha önceden ayarlanır. c. Homojenat Tablo 4 Çözüm 7&#39;de gösterildiği stok solüsyonu kullanılarak 20 mM iyodoasetamit (IAA) bir son konsantrasyon ekleyin. d. 45 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında EAM içeren Homojenat inkübe edin. e. Beyin homojenatı seyreltme tamponu kullanılarak, iki kat (Tablo 3 Çözelti 6) seyreltin. f. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca ikinci bir indirgeme adımı için örnek inkübe edin. g. (Ağırlık / ağırlık) protein-enzim oranı, 1:50 Tablo 2&#39;nin Çözüm 2 içinde çözülmüş dizileme dereceli modifiye tripsin ekleyin. h. 30 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe etmek suretiyle tripsin ile Homojenat Digest. ben. Formik asit (FA)% 0.5 nihai konsantrasyon ilave edilerek bir sonraki gün enzimatik sindirim söndürün. (Not: FA ilavesi, asidik koşullar altında SDC tuzlarının çökelmesini neden olur.) j. Yavaşça SDC precipi içeren numunelerin vortekstates. k. 12.000 xg, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri SDC tuzları aşağı pelet. l. Süpernatant toplayın ve temiz yeni bir tüpe sıvı transferi. (Not: SDC pelet gelen tuzları yeniden askıya yok etmek bu adımın pipetleme esnasında özen ve / veya toplarlar.) m. 1 dakika boyunca güçlü döndürülerek altında SDC yeniden eritilmesi tampon maddesi (Tablo 5) SDC pelet yeniden çözülür. n. Adımları tekrarlayın iki kez çöktürülmüş peptidleri kurtarmak ve süpernatanlanm birleştirmek JL. (Not:. Bkz Serra et al ilgili daha ayrıntılı bilgi 2016 13 triptik sindirim protokolü burada adapte içinde çözelti SDC destekli.) </li><li> triptik bir tuz giderme örnekleri sindirilmiş. a. Bir 1 g Cı-18 kartuşu kullanılarak sindirilmiş numunelerin tuz giderme gerçekleştirin. (Not: Bir büyük hacimli kartuş (5 mL) kullanımını, bağımsız bir şekilde, protein elde teminat örneklerde kalan SDC tuzlarının uygun temizlik miktarının öncedenLC-MS / MS, enjeksiyon için). b. 5 mL asetonitril (ACN) ile 1 g Cı-18 kartuşun klima gerçekleştirin. c. Kalan organik çözücünün çıkması için durumunu 1 g Cı-18 kartuşu temizlik tamponu (Tablo 6) 5 ml geçirin. d. 1 g Cı-18 kartuşa örnek yükleyin. e. Temizlik tamponu 5 mL her bir aşama kullanılarak 1 g C-18 kolonu içinde numuneye 5 temizleme adımları - 3 uygulayın. f. Elüsyon tamponu 5 mL (Tablo 7) benzer şekilde 1 g Cı-18 kartuştan tuzdan arındırılmıştır peptidlerin elüt edilmesi. g. bir vakum yoğunlaştırıcısı içinde ayrıştırılmıştır peptidler kurutun. c. Elüsyon tamponu 200 uL nihai hacim içinde kurutuldu yeniden oluşturun. (Not:. Kullanımı (güçlü ve uzun&gt; 30 dakika boyunca bir sonikasyon banyosu içerisinde müteakip sonikasyon ile, ardından 10 dakika) vorteksleme tamamen yeniden askıya enjeksiyon tamponu içinde kurutulmuştur peptidler) d. Ana için LERLIC-MS / MS için örnek enjeksiyon hacmi ayarlamaprotein ug 3-1 arasında Lyze. </li></ol> 3. Tek boyut LERLIC-MS / MS Ayırma <ol><li> Sıvı kromatografi koşulları: Mobil fazlar: A: su içinde% 0.1 FA (Tablo 8). B:% 0.1 FA ACN içinde (Tablo 9) Akış hızı: 0.4 mL / dak Kolon: lax kılcal sütun (50 cm uzunluğunda - 200 um İD) a. 45 dakika süreyle% 3 B - 434 dakika boyunca% 85 B, 85 - 522 - dakika boyunca% 70 B, 70-124 dakika boyunca% 35 B, 35, 40 dakika, 95% 95 B: Aşağıdaki 1200 d gradyanı kullanarak 5 dakika boyunca% 3 B, 3, izokratik - 7 dakika boyunca% 95 B, 23 dakika boyunca% 95 B, izokratik tutulur. b. Serra ve Gallart-Palau ve arkadaşları de belirtildiği gibi lax kılcal borular kullanılarak peptitlerin ayrılmasını gerçekleştirir. 3, çok yüksek basınç sıvı kromatografi kullanılarak. </li><li> Kütle spektrometresi yapılandırma: a. veri toplama alternatif betwe gerçekleştirmek için tarama etkinlik ayrıntılarını yapılandırmatr tam Fourier dönüşümü-kütle spektrometresi (FT-MS) ve Fourier dönüşümü-tandem kütle spektrometresi (FT-MS / MS) aşağıdaki parametrelerle: a.1. Veri toplama modu: Pozitif FT-MS parametreleri a.2: Kütle aralığı: 350 - 2000 m / z Çözünürlük: 60.000 Microscans: spektrum başına 1 Otomatik kazanç kontrolü: 1 × 10 6 FT-MS / MS parametreleri a.3: Parçalanma modu: Yüksek enerjili çarpışma ayrışma (HCD) A.4 Kütle aralığı: 150 - 2000 m / z a.5 Çözünürlük: 30.000 A.6 en K iyonları: 10 Microscans: spektrum başına 1 devlet şarj edin:&gt; 2+ İzolasyon genişliği: 2 Da A.7 Otomatik kazanç kontrolü: 1 × 10 6 b. 1.5 kV çalışan bir nano-elektrosprey iyon kaynağı ile donatılmış bir Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak 3&#39;te gösterildiği gibi peptitler kütle spektrometresi algılama gerçekleştirin. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> prote gerçekleştirinLERLIC-MS / MS ile veritabanı arama belirli proteomik yazılımını kullanarak, aşağıdaki parametreler kullanılarak veriler elde edildi: (Not: Daha fazla bilgi için 3 bakınız.) a. İyon toleransı: 10 ppm b. Fragman iyon toleransı: 0.05 Da c. Yanlış Keşif Oranı (FDR):% 1 d. Veritabanı: UniProt İnsan veritabanı e. Sabit modifikasyonlar: Cys de Carbamydomethylation f. Değişken modifikasyonlar (yazılım gerekli ise): Oksidasyon (Met), deamidasyonu (Asn ve Gln). </li><li> Şekli karakterizasyonu ve LERLIC-MS / MS verileri izomerik deamidatlı ürünlerin değerlendirilmesi: a. Analiz için bir e-tabloda yazılımına LERLIC-MS / MS Dışa veritabanı arama sonuçları. b. Bul ve deamidate peptidler ve bunların olmayan Deamide muadillerinin tüm listesini çıkarmak. c. referans olarak elde peptitlerin listesini kullanarak, kütle tolerans 5 ppm bir uygun olanı yazılım kullanarak bu peptitlerin iyon kromatogramları (XICs) ekstrakte edin. (Not:XICs ekstraksiyonu için kullanılan yazılım ile ilgili daha fazla bilgi için 3 bakınız.) d. Görsel olarak 3 belirtildiği gibi izomerik ürünler ayrılmış çift pik elüsyon belirlemek için elde edilen XICs kontrol edin. (Not: kolayca veritabanı arama sonucunda iki farklı tutma süreleri varlığı tarafından yönlendirilen bulunabilir MS / MS seviyesinde tespit peptidlerin izomerik ürünleri). e. Her deamide Alanı / peptid izomerik ürünler rölatif ölçümü elde XICs olarak tanımlanan her izomerin pik alanına dayanılarak yapılmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometric+analysis+of+protein+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Geiger, T., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation%2C+isomerization%2C+and+racemization+at+asparaginyl+and+aspartyl+residues+in+peptides.+Succinimide-linked+reactions+that+contribute+to+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation.</a> J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).</li>
<li>Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Glutamine+Deamidation+by+Long-Length+Electrostatic+Repulsion-Hydrophilic+Interaction+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+%28LERLIC-MS%2FMS%29+in+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics.</a> Anal Chem. , (2016).</li>
<li>Reissner, K. J., Aswad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+and+isoaspartate+formation+in+proteins%3A+unwanted+alterations+or+surreptitious+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).</li>
<li>Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240939643_First_evidence_of_spontaneous_deamidation_of_glutamine_residue_via_cyclic_imide_to_-_and_-glutamic_residue_under_physiological_conditions">First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions.</a> JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+white+matter+pathology+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease+with+cerebrovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease.</a> Mol Brain. 9, 27(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lobe+proteins+implicated+in+synaptic+failure+exhibit+differential+expression+and+deamidation+in+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia.</a> Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).</li>
<li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11158575">Molecular clocks.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).</li>
<li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+and+characterization+of+deamidated+peptides+with+RP-ERLIC-based+multidimensional+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).</li>
<li>Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+deamidation%3A+differentiation+of+glutamic+acid+and+gamma-glutamic+acid+in+peptides+by+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation.</a> Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+proteome+coverage+is+increased+by+unique+peptide+recovery+from+sodium+deoxycholate+precipitate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate.</a> Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+Neurodegenerative+Protein+Modifications+via+Proteomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling.</a> Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).</li>
<li>Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+Fc+deamidation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Human antibody Fc deamidation in vivo.</a> Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial+processed+soy-based+food+product+contains+glycated+and+glycoxidated+lunasin+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms.</a> Sci Rep. 6, 26106(2016).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+peptidomic+strategy+to+decipher+the+molecular+diversity+of+cyclic+cysteine-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides.</a> Sci Rep. 6, 23005(2016).</li>
<li>Leo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+at+asparagine+and+glutamine+as+a+major+modification+upon+deterioration%2Faging+of+proteinaceous+binders+in+mural+paintings%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings.</a> Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).</li>
<li>Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+extent+of+bone+degradation+using+glutamine+deamidation+in+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen.</a> Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).</li>
<li>Buszewski, B., Noga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+%28HILIC%29--a+powerful+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique.</a> Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).</li>
<li>Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion-exchange+chromatography+of+phosphopeptides%3A+weak+anion+exchange+versus+strong+anion+exchange+and+anion-exchange+chromatography+versus+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).</li>
<li>Adav, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dementia-linked+amyloidosis+is+associated+with+brain+protein+deamidation+as+revealed+by+proteomic+profiling+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues.</a> Mol Brain. 9 (1), 20(2016).</li>
<li>Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+laterally+about+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies.</a> J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+expressing+human+SOD1+successfully+recapitulates+mitochondrial+phenotypic+features+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).</li>
<li>Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+and+in+vivo+stability+of+a+succinimide+intermediate+observed+on+a+therapeutic+IgG1+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule.</a> mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+functional+implication+of+a+stable+succinimide+in+the+structural+stability+of+Methanocaldococcus+jannaschii+glutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase.</a> Nat Commun. 7, 12798(2016).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+Repulsion+Hydrophilic+Interaction+Chromatography+for+Isocratic+Separation+of+Charged+Solutes+and+Selective+Isolation+of+Phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides.</a> Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+Evaluation+and+Minimization+of+Nonenzymatic+Deamidation+in+Proteomic+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li>
<li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis%3A+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu video yazıda LERLIC-MS / MS 3&#39;ün bir adım adım protokol sunmak için bir yöntem derinlemesine karakterizasyonunun ve doğru bir şekilde, protein deamidasyonu ve bu protein modifikasyonu ilgili enzimatik işlemlerin kapsamını tespit etmek. LERLIC-MS / MS elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) 27 ilkesi altında uzun bir uzunlukta (50 sm) lax kullanımına dayanmaktadır. Çalışmamızda 3&#39;te gösterildiği gibi uzun uzunlukt...

Deamidasyonu bir protein dönüşüm sonrası modifikasyonu asparagin (Asn) ve / veya glutamin (Gln) kalıntıları 1 modifikasyonu yoluyla protein omurgasına bir negatif yük getirmektedir (PTM) &#39;dir. 2: 1 oranında Asn kalıntısının etki ederken bu değişiklik, bir ortak 3 de izomerik ürünleri isoaspartic asit (IsoAsp) ve n -aspartic asit (Asp) oluşturur. Rağmen, bu oran tamir enzimi, L-isoaspartyl metiltransferaz (PIMT) 3, 4 müdahalesi ile değiştirilebilir. Benzer şekilde, Gln kalıntısının deamidasyon beklenen 1 de izomer gama-glutamik asit (γ-Glu) ve alfa-glutamik asit izoformu (α-Glu) oluşturur: 7 oranında 3, 5, bu oran aksiyonu ile kaydırılabilir her yerde enzim transglutaminaz 2 ve diğer transglütaminazlar da dahil olmak üzere transglütaminaz 1, ebeyin 6 hücre dışı veziküller ile ilişkili olarak nzyme yakın zamanda tespit edilmiş. Deamidasyon kökeni (birkaç kronik de Gln transamidasyon ile ilgili detaylar ve Etkileri 3 bakınız önceki transglütaminazlar ve diğer enzimler, transamidasyon yoluyla arası / molekül içi çapraz bağlanma aracılık ettiği Gln kalıntıları özellikle yaygındır, kendiliğinden veya enzimatik olarak mevcut olabilir ve ölümcül insan hastalıkları). Bu nedenle, deamidasyon etkilenen moleküller 4, 7, 8, önemli bir yapı üzerinde yankı ve işlevi vardır ve 9 yaşlanma, hizmet olarak moleküler saat dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal sonuçları ışığında derinlemesine bir kimyasal karakterizasyonu 3 gerektiren bir PTM olan . Asn kalıntılarına deamidasyonunun olmasına rağmen<html> nispeten aşağıdan yukarı tüfek proteomik ile iyi karakterize edilmiş 1, 10, Gln kalıntısının deamidasyon yine elektron esaslı radikal parçalanma 11 model bileşimlerinin zor analizi ötesinde, uygun bir karakterizasyon yöntemi bulunmamaktadır. Son zamanlarda, tek bir analizde karmaşık biyolojik numunelerin ve model bileşiklerinden Gln ve Asn deamidasyon izoformlarının ayrılmasını sağlayan yeni bir tek boyutlu tüfek proteomik stratejisi (LERLIC-MS / MS) 3 geliştirdik. LERLIC-MS / MS, uzun uzunlukta (50 sm) elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) modunda çalışan iyon değişim kolonu (lax) kullanılarak triptik sindirilmiş peptidlerin ayrılması göre ve tandem kütle spektrometrisi ile birleştirilir (LC MS / MS). Bu yeni analitik strateji karakterize ve nispeten insan beyin dokularında her deamide kalıntısının ölçüde ölçmek için kullanılmıştırf &quot;&gt; 3. Yine de burada özetlenen protokol ilgi biyokimyasal bağlamında protein deamidasyon özelliklerini incelemek amaçlanmıştır LERLIC-MS / MS video görüntüleme sağlayacaktır. ETİK TABLOSU Bu protokolün tüm işlemler Singapur Nanyang Teknoloji Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve kurumsal kurallarına uygun olarak yapılmıştır.

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 ve mikro; m 100-&Arama; (dökme malzeme)</td><td>PolyLC A.Ş.</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Uzun uzunlukta iyon değiştirici kılcal kolon 50 cm - 200 &mikro; m Kimlik</td><td>PolyLC A.Ş.</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>PEEKsil Boru 1/16 "OD x 200 & m ID x 50 cm uzunluk</td><td>Trajan Scientific Australia altında SGE Analitik Bilimi&nbsp;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>1/16 "OD boru için dişiden kadına bağlantı parçası</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>Mikroferule için dişi somun</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>Microferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>Basınçlı Bomba NanoBaume</td><td>Batı Sıvıları Mühendisliği</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Önemi UFLC sistem</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli kilit tüpleri</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik boncuklar. 0,9 & ndash; 2,0 mm. 1 lb. Steril olmayan.</td><td>Sonraki Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj&nbsp;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R</td><td></td></tr><tr><td>Standart Dijital Isıtmalı Sirkülasyon Banyosu, 120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Sep-pack c18 tuz giderme kartuşu 50 mg</td><td>Sular</td><td>WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>Vacumm yoğunlaştırıcı</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Konsantratör Plus Sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite kütle spektrometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Termo Esir Sprey&nbsp;</td><td>Michrom-Bruker A.Ş.</td><td>TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör INCUCELL&nbsp;</td><td>MMM Grubu</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama dereceli modifiye tripsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr> <tr><td>Fosfat tampon çözeltisi 10x (1x'e seyreltilmiş)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril HPLC sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol HPLC sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>Su HPLC sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

av tüfeği proteomics derinlemesine karakterizasyonu için lerlic-ms / ms ve glutamin ölçümü ve asparajin deamidasyonu

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Protein deamidasyon Karakterizasyonu İnsan patoloji ve diğer biyokimyasal bağlamlarda bu protein dönüşüm sonrası modifikasyonu (PTM) rolü (ler) i ve potansiyeli deşifre zorunludur. Protein deamidasyon karakterizasyonu gerçekleştirmek için, yakın zamanda glutamin (Gln), ve asparajin (Asn) izoformu ayırabilen yeni bir uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LERLIC-MS / MS) yöntemi geliştirdik son derece karmaşık biyolojik örnekler model bileşiklerinden deamidasyon ürünleri. LERLIC-MS / MS, bu nedenle, bir, Gln, deamidasyon izoform ayrılması ve ölçümü için, ilk tüfek proteomik stratejisi. Ayrıca burada açıklanan örnek işleme protokolü LERLIC-MS / MS ile karakterizasyonu sağlayan süksinimid ara stabilize olduğu, bir yenilik olarak, göstermektedir. Bu video makalede gösterildiği gibi LERLIC-MS / MS uygulanması halen bilinmeyen aydınlatmak için yardımcı olabilirProtein deamidasyon n moleküler diziler. Buna ek olarak, LERLIC-MS / MS belirgin biyolojik kökenden deamidasyonu kapsayan enzimatik reaksiyonların daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Gln ve Asn kalıntısının deamidasyonu birçok kronik ve ölümcül hastalıklarda 14 içine dahil edilen bir dejeneratif protein modifikasyonu (DPM) olarak kabul edilir. PTM insan vücudunun ve benzer biyolojik arka 1, 15, antikorlar ve diğer moleküllerin yarı-ömrü ve parçalayıcı durumları tahmin edebilirsiniz gösterilmiştir. Protein deamidasyon önemi, aslında, dolayısıyla bu modifikasyon 16...

Burada uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LERLIC-MS / MS) yöntemi bir adım adım protokol mevcut. Bu av tüfeği proteomik tarafından glutamin ve asparajin deamidasyon izoformlarının ilk kez ölçümü ve karakterizasyonu için sağlayan bir roman yöntemdir.

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Bu prosedürün genel amacı, kompleks proteomlardaki endojen glutamin ve asparajin deamidasyon ürünlerini karakterize etmek ve miktarını belirlemek için shotgun proteomiğini kullanmaktır. Bu yöntem; spontan ve antimatik işlemcilerin, glutamin ve asparajin deaminasyonunun izomerik ürünleri üzerindeki etkisi gibi biyokimyadaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, glutamin deaminasyon izomerlerinin uzun bir iyon değişim kapiler kolonunda ayrılması ve böylece peptitlerin izomerik noktalara göre ayrılma kapasitesinin maksimize edilmesidir.Kolon kurulumuna başlamak için, 50 miligram zayıf anyon değişim paketleme materyalini, suda %90 isopropanol içeren 3,5 mililitrelik çözeltide süspanse edin. 200 mikrometre iç çapındaki 50 santimetrelik bir peak borusunun bir ucuna dişi-dişi bağlantı parçası, bir mikroferal ve bir dişi somun sabitleyin. Borunun ucuna, mikroferal içerisine bir mikrometre gözenekli 1/16 inçlik bir süzgeç yerleştirin.4.500 psi'ye ayarlanmış bir basınç pompası kullanarak, materyal üst kısımda görünene kadar anyon değişimini kılcal boruya doldurun. Kolon montajını tamamlamak için, doldurulmuş kılcal borunun karşı ucundaki üst kısma başka bir dişi-dişi bağlantı parçası, microferal ve dişi somun takın. 50 ila 100 miligram dokuyu fosfat tamponlu salin ile beş dakika boyunca yıkayın.Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın ve ardından yıkanmış dokuyu emniyet kapaklı tüplere yerleştirin. Her tüpe, doku ağırlığına eşdeğer miktarda paslanmaz çelik boncuk ve hacim olarak 2,5 katı oranında %1 sodyum deoksikolat içeren 100 millimolar amonyum asetat sulu çözeltisi ekleyin. Dokuyu, dört santigrat derecede beş dakika boyunca maksimum yoğunlukta homojenize edin.Ardından, homojenatı 10, 000 x g'de ve dört °C'de on dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın. Pellet gözlemlenmeyene kadar doku pelletini homojenize etme ve santrifüjleme işlemlerine, her seferinde süpernatantları birleştirerek devam edin.Birleşik süpernatantlardaki protein konsantrasyonunu bisinkoninik asit testi ile belirleyin. Ardından, örnekte 10 millimolar dithiothreitol konsantrasyonuna ulaşmak için homogenata 100 millimolar amonyum asetat içinde bir molar dithiothreitol çözeltisi ekleyin. Homogenatı 60 °C'lik su banyosunda otuz dakika inkübe edin.Örnekte 20 milimolar iodoacetamide konsantrasyonuna ulaşmak için homojenata, 100 milimolar amonyum asetat içerisinde hazırlanmış bir molar iodoacetamide çözeltisi ekleyin. Homojenatı ışık yokluğunda, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin. Ardından homojenatı, 100 milimolar amonyum asetat içerisindeki on milimolar dithiothreitol çözeltisinin iki hacim eşdeğeri ile seyreltin.Homojenatı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Numunede ağırlıkça 1'e 50 protein-enzim oranı sağlamak için homojenata, 100 mM amonyum asetat içinde çözülmüş yeterli hacimde sekanslama derecesi modifiye tripsin ekleyin. Homojenatı sindirmek için numuneyi 30 °C'de gece boyunca inkübe edin.Sodyum deoksikolat tuzlarını çöktürmek için sindirimi, örnek ağırlığının %0,5'i oranında formik asit ile durdurun. SDC tuzlarını içeren örnekleri hafifçe vorteksleyin ve ardından örnekleri 12.000 x g'de, dört santigrat derecede on dakika boyunca santrifüjleyin. SDC tuzu peletini dağıtmamaya dikkat ederek süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Tuzları hacimce %0,5'lik amonyum hidroksit sulu çözeltisi içinde, şiddetli şekilde vorteksleyerek yeniden çözün. Bir gramlık C-18 sorbent kartuşu önce 5 mililitre asetonitril, ardından 5 mililitre suda %0,1 trifloroasetik asit ile koşullandırın. Daha sonra, sindirilmiş örneği kartuşa yükleyin.Numuneleri %0,1 TFA'nın beş mililitrelik porsiyonlarıyla üç ila beş kez yıkayın. Ardından peptitleri %75 asetonitril ve %0,1 formik asit içeren sulu bir çözeltinin beş mililitresi ile seyreltin. Sıvıyı bir vakum konsantratöründe kurutun.Kalıntıya, %0,1 formik asit içeren %75 asetonitritten 200 µL ekleyin. Karışımı en az on dakika vorteksleyin ve ardından kuru peptidleri yeniden çözmek için karışımı en az 30 dakika sonikasyona tabi tutun. Enjekte edilen örnek bir ila üç µg protein içerecek şekilde örneği gerektiği gibi seyreltin.LAX kapiler kolonu bir ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografi cihazına bağlayın. Su ve asetonitril içerisinde %0,1'lik formik asit çözeltileri hazırlayın. Akış hızını dakikada 0,4 microliter olarak ayarlayın ve 1.200 dakikalık bir gradyanla çalıştırma programı kurun.Kütle spektrometresi tarama olaylarını, tam Fourier dönüşümlü kütle spektrometrisi ve Fourier dönüşümlü tandem kütle spektrometrisi arasında veri toplama işlemini dönüşümlü yapacak şekilde yapılandırın. Peptitleri ayırmak ve karakterize etmek için LERLIC MS/MS gerçekleştirin. Protein veri tabanı araması yapmak için elde edilen verileri ve proteomik yazılımı kullanın.Veritabanı arama sonuçlarını hesap tablosu yazılımına aktarın. Deamidize olmuş peptidlerin listesini ve bunlara karşılık gelen deamidize olmamış peptidleri belirleyip ayıklayın. Bu peptidlerin her birinin iyon kromatogramlarını beş ppm kütle toleransı ile çıkarın.İzomerik ürünlerin ayrışmış çift pik illüzyonu için çıkarılmış iyon kromatogramlarını inceleyin. LERLIC MS/MS kullanılarak, glutamin ve asparajinin deamidize izoformları bir protein örneğinden iki farklı tutunma süresinde ayrılmış ve tanımlanmıştır. Tersine dönmüş gama alfa glutamil oranı gösteren transamidasyonun enzimatik olarak modifiye edilmiş ara glutamin kalıntıları tanımlanmıştır.Asparagin kalıntılarındaki süksinimid ara ürünü de bu yöntemle tanımlanmıştır. Hafif asidik örnek işleme koşulları süksinimid ara ürününü stabilize ettiği için bu durum, LERLIC MS/MS tekniğinin süksinimid ara ürünlerinin proteom genelindeki çalışmalarına uygulanabileceğini göstermektedir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyokimya araştırmacılarının arkeolojiden biyomedikal araştırmalara kadar uzanan çeşitli bağlamlarda protein deamidasyonunu karakterize etmelerinin yolunu açmıştır.

lerlic-msms-for-depth-characterization-quantification-glutamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Kaynak: Wulf, M., et.al.  Nöromelanin granüllerinin proteomik profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol. J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, insan ölüm sonrası beyin dokusundan izole edilen nöromelanin granüllerinden (NMG'ler) peptit örneklerinin analizini göstermektedir. Peptitler önce yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır ve daha sonra kütle-yük oranlarını (m/z) belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Hedeflenen peptitler,...

İnsan Beyin Dokusundan İzole Edilen Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Burada, nöromelanin granüllerinin lazer mikrodiseksiyonu yoluyla insan post-mortem substantia nigra pars compacta dokusundan izole edilmesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu revize edilmiş ve optimize edilmiş protokol, numune toplama için gereken süreyi büyük ölçüde en aza indirir, gerekli numune miktarını azaltır ve LC-MS / MS analizi ile proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini geliştirir.

Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

Öğrenin, LERLIC-MS/MS ve shotgun proteomics kullanarak glutamin ve asparagin deamidasyon izoformlarını karakterize edin ve nicelendirin. Bu yöntem, karmaşık proteomlarda biyokimyasal süreçleri anlamak için değerli bilgiler sunar.

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Daha fazla video keşfet