Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Bu prosedürün genel amacı, kompleks proteomlardaki endojen glutamin ve asparajin deamidasyon ürünlerini karakterize etmek ve miktarını belirlemek için shotgun proteomiğini kullanmaktır. Bu yöntem; spontan ve antimatik işlemcilerin, glutamin ve asparajin deaminasyonunun izomerik ürünleri üzerindeki etkisi gibi biyokimyadaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, glutamin deaminasyon izomerlerinin uzun bir iyon değişim kapiler kolonunda ayrılması ve böylece peptitlerin izomerik noktalara göre ayrılma kapasitesinin maksimize edilmesidir.

Kolon kurulumuna başlamak için, 50 miligram zayıf anyon değişim paketleme materyalini, suda %90 isopropanol içeren 3,5 mililitrelik çözeltide süspanse edin. 200 mikrometre iç çapındaki 50 santimetrelik bir peak borusunun bir ucuna dişi-dişi bağlantı parçası, bir mikroferal ve bir dişi somun sabitleyin. Borunun ucuna, mikroferal içerisine bir mikrometre gözenekli 1/16 inçlik bir süzgeç yerleştirin.

4.500 psi'ye ayarlanmış bir basınç pompası kullanarak, materyal üst kısımda görünene kadar anyon değişimini kılcal boruya doldurun. Kolon montajını tamamlamak için, doldurulmuş kılcal borunun karşı ucundaki üst kısma başka bir dişi-dişi bağlantı parçası, microferal ve dişi somun takın. 50 ila 100 miligram dokuyu fosfat tamponlu salin ile beş dakika boyunca yıkayın.

Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın ve ardından yıkanmış dokuyu emniyet kapaklı tüplere yerleştirin. Her tüpe, doku ağırlığına eşdeğer miktarda paslanmaz çelik boncuk ve hacim olarak 2,5 katı oranında %1 sodyum deoksikolat içeren 100 millimolar amonyum asetat sulu çözeltisi ekleyin. Dokuyu, dört santigrat derecede beş dakika boyunca maksimum yoğunlukta homojenize edin.

Ardından, homojenatı 10, 000 x g'de ve dört °C'de on dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın. Pellet gözlemlenmeyene kadar doku pelletini homojenize etme ve santrifüjleme işlemlerine, her seferinde süpernatantları birleştirerek devam edin.

Birleşik süpernatantlardaki protein konsantrasyonunu bisinkoninik asit testi ile belirleyin. Ardından, örnekte 10 millimolar dithiothreitol konsantrasyonuna ulaşmak için homogenata 100 millimolar amonyum asetat içinde bir molar dithiothreitol çözeltisi ekleyin. Homogenatı 60 °C'lik su banyosunda otuz dakika inkübe edin.

Örnekte 20 milimolar iodoacetamide konsantrasyonuna ulaşmak için homojenata, 100 milimolar amonyum asetat içerisinde hazırlanmış bir molar iodoacetamide çözeltisi ekleyin. Homojenatı ışık yokluğunda, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin. Ardından homojenatı, 100 milimolar amonyum asetat içerisindeki on milimolar dithiothreitol çözeltisinin iki hacim eşdeğeri ile seyreltin.

Homojenatı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Numunede ağırlıkça 1'e 50 protein-enzim oranı sağlamak için homojenata, 100 mM amonyum asetat içinde çözülmüş yeterli hacimde sekanslama derecesi modifiye tripsin ekleyin. Homojenatı sindirmek için numuneyi 30 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Sodyum deoksikolat tuzlarını çöktürmek için sindirimi, örnek ağırlığının %0,5'i oranında formik asit ile durdurun. SDC tuzlarını içeren örnekleri hafifçe vorteksleyin ve ardından örnekleri 12.000 x g'de, dört santigrat derecede on dakika boyunca santrifüjleyin. SDC tuzu peletini dağıtmamaya dikkat ederek süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.

Tuzları hacimce %0,5'lik amonyum hidroksit sulu çözeltisi içinde, şiddetli şekilde vorteksleyerek yeniden çözün. Bir gramlık C-18 sorbent kartuşu önce 5 mililitre asetonitril, ardından 5 mililitre suda %0,1 trifloroasetik asit ile koşullandırın. Daha sonra, sindirilmiş örneği kartuşa yükleyin.

Numuneleri %0,1 TFA'nın beş mililitrelik porsiyonlarıyla üç ila beş kez yıkayın. Ardından peptitleri %75 asetonitril ve %0,1 formik asit içeren sulu bir çözeltinin beş mililitresi ile seyreltin. Sıvıyı bir vakum konsantratöründe kurutun.

Kalıntıya, %0,1 formik asit içeren %75 asetonitritten 200 µL ekleyin. Karışımı en az on dakika vorteksleyin ve ardından kuru peptidleri yeniden çözmek için karışımı en az 30 dakika sonikasyona tabi tutun. Enjekte edilen örnek bir ila üç µg protein içerecek şekilde örneği gerektiği gibi seyreltin.

LAX kapiler kolonu bir ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografi cihazına bağlayın. Su ve asetonitril içerisinde %0,1'lik formik asit çözeltileri hazırlayın. Akış hızını dakikada 0,4 microliter olarak ayarlayın ve 1.200 dakikalık bir gradyanla çalıştırma programı kurun.

Kütle spektrometresi tarama olaylarını, tam Fourier dönüşümlü kütle spektrometrisi ve Fourier dönüşümlü tandem kütle spektrometrisi arasında veri toplama işlemini dönüşümlü yapacak şekilde yapılandırın. Peptitleri ayırmak ve karakterize etmek için LERLIC MS/MS gerçekleştirin. Protein veri tabanı araması yapmak için elde edilen verileri ve proteomik yazılımı kullanın.

Veritabanı arama sonuçlarını hesap tablosu yazılımına aktarın. Deamidize olmuş peptidlerin listesini ve bunlara karşılık gelen deamidize olmamış peptidleri belirleyip ayıklayın. Bu peptidlerin her birinin iyon kromatogramlarını beş ppm kütle toleransı ile çıkarın.

İzomerik ürünlerin ayrışmış çift pik illüzyonu için çıkarılmış iyon kromatogramlarını inceleyin. LERLIC MS/MS kullanılarak, glutamin ve asparajinin deamidize izoformları bir protein örneğinden iki farklı tutunma süresinde ayrılmış ve tanımlanmıştır. Tersine dönmüş gama alfa glutamil oranı gösteren transamidasyonun enzimatik olarak modifiye edilmiş ara glutamin kalıntıları tanımlanmıştır.

Asparagin kalıntılarındaki süksinimid ara ürünü de bu yöntemle tanımlanmıştır. Hafif asidik örnek işleme koşulları süksinimid ara ürününü stabilize ettiği için bu durum, LERLIC MS/MS tekniğinin süksinimid ara ürünlerinin proteom genelindeki çalışmalarına uygulanabileceğini göstermektedir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyokimya araştırmacılarının arkeolojiden biyomedikal araştırmalara kadar uzanan çeşitli bağlamlarda protein deamidasyonunu karakterize etmelerinin yolunu açmıştır.