Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Bu prosedürün genel amacı, karmaşık proteomlarda endojen glutamin ve asparagin deamidasyon ürünlerini karakterize etmek ve ölçmek için av tüfeği proteomiklerini kullanmaktır. Bu yöntem, spontan ve antimatik işlemcilerin glutamin izometrik ürünü gluteo ve asparaji deaminasyonu üzerindeki etkisi gibi biyokimyadaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, glutamin deaminasyon izomerlerinin uzun uzunlukta bir iyonik değişim kılcal kolon üzerinde ayrılması ve peptitleri izomatik noktalara göre ayırma yeteneğini en üst düzeye çıkarmasıdır.

Kolon yapımına başlamak için, 50 miligram zayıf anyon değişim paketleme malzemesini 3,5 mililitre %90 izopropanol içinde suda askıya alın. İç çapı 200 mikrometre olan 50 santimetre uzunluğundaki tepe borusunun bir ucunda dişiden dişiye bağlantı parçası, bir mikroferal ve bir dişi somunu sabitleyin. Mikroferal içindeki borunun ucuna bir mikrometre gözenekli 1/16 inçlik bir ekran yerleştirin.

4.500 psi'ye ayarlanmış basınç pompasını kullanarak, anyon değişimini malzeme üstte görünene kadar kılcal damara yerleştirin. Kolonun montajını bitirmek için diğer uçtaki paketlenmiş kılcal damarın üstüne başka bir dişiden dişiye bağlantı parçası, mikroferal ve dişi somun takın. 50 ila 100 miligram dokuyu fosfat tamponlu tuzlu su ile beş dakika boyunca yıkayın.

Bu yıkamayı iki kez tekrarlayın ve ardından yıkanmış mendili güvenlik kapaklı tüplere yerleştirin. Her tüpe bir ağırlık eşdeğeri paslanmaz çelik boncuk ve hacimce 2.5 eşdeğeri sulu 100 milimolar amonyum asetat çözeltisi% 1 sodyum deoksikolat ekleyin. Dokuyu dört santigrat derecede beş dakika boyunca maksimum yoğunlukta homojenize edin.

Daha sonra homojenatı 10.000 x g ve dört santigrat derecede on dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Doku peletini homojenleştirmeye ve santrifüjlemeye devam edin, her seferinde süpernatanları birleştirerek pelet gözlenene kadar devam edin.

Kombine süpernatantlardaki protein konsantrasyonunu bir bikinkoninik asit tahlili ile ölçün. Daha sonra, numunede on milimolar ditiotreitol konsantrasyonu elde etmek için homojenata 100 milimolar amonyum asetat içinde bir molar ditiyotreitol çözeltisi ekleyin. Homojenatı 60 santigrat derecede bir su banyosunda otuz dakika inkübe edin.

Numunede 20 milimolar iyodoasetamid konsantrasyonu elde etmek için homojenata 100 milimolar amonyum asetat içinde bir molar iyodoasetamid çözeltisi ekleyin. Homojenatı oda sıcaklığında ışık yokluğunda 45 dakika inkübe edin. Daha sonra homojenatı, 100 milimolar amonyum asetat içinde on milimolar ditiotreitol çözeltisinin iki hacim eşdeğeri ile seyreltin.

Homojenatı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Numunede ağırlıkça 1 ila 50 protein enzim oranı elde etmek için homojenata 100 milimolar amonyum asetat içinde yeterli hacimde sıralama dereceli modifiye tripsin ekleyin. Homojenatı sindirmek için numuneyi gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Sodyum deoksikolat tuzlarını çökelterek sindirimi formik asidin numune ağırlığının %0,5'i ile söndürün. SDC tuzları içeren numuneleri nazikçe girdaplayın ve ardından numuneleri 12.000 x g ve dört santigrat derecede on dakika santrifüjleyin. SDC tuzlarının peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı yeni bir tüpe boşaltın.

Tuzları hacimce% 0.5 sulu amonyum hidroksit çözeltisi içinde yeniden çözün ve kuvvetlice girdaplayın. Bir gram C-18 sorbent kartuşunu 5 mililitre asetonitril ve ardından suda beş mililitre% 0.1 trifloroasetik asit ile koşullandırın. Ardından, sindirilmiş numuneyi kartuşa yükleyin.

Numuneleri üç ila beş kez% 0.1 TFA'nın beş mililitrelik kısımlarıyla yıkayın. Daha sonra peptitleri beş mililitre% 75 asetonitril ve% 0.1 formik asit içeren sulu bir çözelti ile seyreltin. Sıvıyı bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun.

Kalıntıya %0.1 formik asit içeren 200 mikrolitre %75 asetonitril ekleyin. Karışımı en az on dakika boyunca vorteksleyin ve ardından kuru peptitleri yeniden oluşturmak için karışımı en az 30 dakika boyunca sonikleştirin. Numuneyi gerektiği gibi seyreltin, böylece enjekte edilen numune bir ila üç mikrogram protein içerir.

LAX kılcal kolonunu ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografi cihazına bağlayın. Su ve asetonitrilde% 0.1 formik asit çözeltileri hazırlayın. Akış hızını dakikada 0,4 mikrolitreye ayarlayın ve 1.200 dakikalık bir gradyan çalışması ayarlayın.

Kütle spektrometresi tarama olaylarını, tam Fourier dönüşümü kütle spektrometrisi ve Fourier dönüşümü tandem kütle spektrometrisi arasında alternatif veri toplama için yapılandırın. Peptitleri ayırmak ve karakterize etmek için LERLIC MS/MS uygulayın. Bir protein veritabanı araması yapmak için elde edilen verileri ve proteomik yazılımı kullanın.

Veritabanı arama sonuçlarını elektronik tablo yazılımına aktarın. Deamide edilmiş peptitlerin listesini ve karşılık gelen deamide edilmemiş peptitleri tanımlayın ve çıkarın. Bu peptitlerin her birinin iyon kromagramlarını milyonda beş parça kütle toleransı ile çıkarın.

Ekstrakte edilen iyon kromagramlarını, izomerik ürünlerin ayrılmış çift tepe yanılsaması açısından inceleyin. LERLIC MS/MS kullanılarak, glutamin ve asparajinin deamidlenmiş izoformları ayrıldı ve iki farklı alıkonma süresinde bir protein örneğinden tanımlandı. Ters çevrilmiş bir gama alfa glutamil oranı gösteren enzimatik olarak modifiye edilmiş transamidasyon ara glutamin kalıntıları tanımlandı.

Asparagin kalıntılarındaki süksinimid ara maddesi de bu yöntemle tanımlanmıştır. Hafif asidik numune işleme koşulları süksinamid ara maddesini stabilize ettiğinden. Bu, LERLIC MS/MS tekniğinin, süksinimid ara ürünlerinin proteom çapında incelenmesine uygulanabileceğini düşündürmektedir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyokimya araştırmacılarının arkeolojiden biyomedikal araştırmalara kadar çeşitli bağlamlarda protein deamidasyonunu karakterize etmelerinin yolunu açtı.