Name: Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Keşfedin, LC-MS/MS kullanarak plazmadan N-glikan ve proteinlerin eşzamanlı saflaştırılması ve nicelendirilmesi için yüksek verimli bir protokol. Bu yöntem, glikomik ve proteomik araştırmalarda doğruluğu artırır ve biyobelirteç keşfini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, NIH NCI IMAT Program Hibesi R33 (CA147988-02), NC State Grant'te (T32GM008776) NIH NIGMS Moleküler Biyoteknoloji Yüksek Lisans Eğitimi, NC State Grant (P200A140020) ABD Eğitim Bakanlığı GAANN Moleküler Biyoteknoloji Burs Programı, WM Keck Vakfı ve Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi tarafından cömertçe finanse edilmiştir. Tavuk plazması, NC State Üniversitesi Kanatlı Hayvanları Bilimi Bölümü'nden Dr. James N. Petitte ve Rebecca Wysocky'nin yardımıyla elde edildi.

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+carbohydrate+determinants+in+regulating+hemostasis%3A+insights+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities.</a> Blood. 121, 3801-3810 (2013).</li>
<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
<li>Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and glycomics.</a> Omics. 14, 401-418 (2010).</li>
<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glycopeptides+for+glycan+structure+and+attachment+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification.</a> Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).</li>
<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
<li>Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+LC-MS%28n%29%3A+technical+design+and+applications+to+peptide+and+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein.</a> J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).</li>
<li>Apweiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniProt%3A+the+Universal+Protein+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">UniProt: the Universal Protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).</li>
<li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).</li>
<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
<li>Kronewitter, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+retrosynthetic+glycan+libraries+to+profile+and+classify+the+human+serum+N-linked+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome.</a> Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).</li>
<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

P2GPN reaktifini ve teknolojisini bir ürün (GTK-1000) biçiminde daha geniş bilimsel topluluğa yaymak için Cambridge İzotop Laboratuvarları (CIL) ile işbirliğine dayalı bir ilişkimiz var. Ancak, bu ürünün satışından herhangi bir gelir elde etmiyoruz.

Rutin glikan analizini kolaylaştırmak için yüksek verimli kantitatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Son otuz yıldır, glikozik analizi, hastalık, klinik uygulamalar ve farmasötiklerdeki önemine rağmen, araştırma gruplarının bir alt kümesiyle sınırlı kalmıştır. Glikozikler ve proteomikler için FANGS-P2GPN saflaştırma ve etiketleme yöntemi, aynı analizi tek bir numune alikotunda gerçekleştirerek malzeme maliyetini ve ihtiyaç duyulan malzeme miktarını azaltır (özellikle insan ve fare çalışmalarında önemlidir). Ayrıca, hazırlıklardaki değişkenliği en aza indirme çabaları kritik öneme sahiptir, çünkü her ek adım hataya katkıda bulunur ve vaka kontrol çalışmalarındaki önemli ancak düşük miktarda değişiklikleri potansiyel olarak maskeler. FANGS'nin hidrofobik hidrazid etiketlemesine bağlanması, protein ve glikan numunelerinin aynı RPLC kolonu üzerinde çalıştırılmasına izin verir, glikan iyonizasyonunu arttırır, nispi miktar tayini sağlar ve plazmaya kantitatif olarak uygulanabilir.
N-glikan analizi için, tam de-glikosilasyon elde etmek için önerilen PNGase F seviyesinin kullanılması kritik öneme sahiptir. Glikanlar çözücüye maruz kalsa da, proteinlerin ve fazla enzimin denatürasyonu, verimli ve tam bölünmenin sağlanmasına yardımcı olur. Glikanların doğru miktar tayini için, NAT ve SIL türlerini karıştırırken reaksiyonu söndürmek ve çapraz reaksiyonları önlemek için türevlendirmeden sonra tamamen kurutulmalarını sağlamak gerekir. Son olarak, iş akışını glikozit analizine genişletirken, spesifik olmayan deamidasyonu en aza indirmek için adımların zamanlaması kritik öneme sahiptir. Kombine glikozik ve proteomik analiz için sağlanan değiştirilmiş protokoller, uygun şekilde yapıldığında tutarlı bir şekilde çalışır.
İş akışı, altın standart SPE yöntemine kıyasla plazmadan N-glikanların doğru nispi miktar tayinini sağlar. Moleküler ağırlık, hidrofiliklik ve bileşim yapısı açısından ekstrakte edilen glikan türlerinde belirgin bir önyargı yoktur. O-bağlı glikanların kalitatif analizini araştırmamış olsak da, FANGS'nin N-bağlı glikanların PNGase F sindirimi sonrası bir β-eliminasyon adımının eklenmesini sağlayabileceğini umuyoruz. Bununla birlikte, prosedürler, kütle spektrometrisinden önce reaktif temizliği için önemli değişiklikler gerektirecek ve peptit analizi önemli ölçüde etkilenecektir. Proteomik için, geleneksel FASP yöntemlerine kıyasla aynı derinlikte proteom kapsamı elde edilir. Daha da önemlisi, yöntemler N-glikan deamidasyonu için minimum yanlış keşif oranı elde eder. Yöntem, PNGase sindirim adımı22,23 sırasında Asn'nin 18O etiketlemesi ile uyumlu olsa da, düşük glikosilasyon bölgesi yanlış keşif oranı, bunun gerekli olmayabileceğini ve maliyetleri ve karmaşıklığı daha da azaltabileceğini düşündürmektedir.
Hem avantajları hem de dezavantajları olan bu yöntemde proteom glikoproteinler için zenginleştirilmemiştir. Bazı düşük bol glikoproteinler analizde tespit edilemeyebilir. Bununla birlikte, protein başına glikosile edilmiş bölgelerin doluluğu, biyolojik numuneler arasında karşılaştırılabilir. Ek olarak, lektin afinitesinin saflaştırılmasından veya kimyasal zenginleştirmeden kaynaklanan hata ve önyargı ortadan kaldırılır. Sonuç olarak, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken FANGS'nin bireysellik normalizasyonuna bağlanması, klinik vaka kontrol çalışmalarında uygulama için büyük potansiyele sahip glikoz ve proteomun tandem analizi için basitleştirilmiş, nicel, yüksek verimli bir yöntemle sonuçlanır.

Proteomik alanında, filtre destekli numune hazırlama (FASP), yaygın olarak, başlangıç ​​malzemesinin miktarını en aza indirmek örnek hazırlama eserler azaltmak ve numune sayısını en üst düzeye çıkarmak 1 kabiliyeti için kabul edilmiştir. Bununla birlikte, bu tür bir yöntem henüz ortaya çıkmakta ve Glikomik alanında için çekiş gücü elde etmek için yer alır. Yüksek verimlilik gelişimi, nicel iş akışları nedeniyle ayrılmaz biyolojik savunma glycoslasyonun rolü ve kanser veya hastalıkların 2,3 ederek modülasyon ihtiyaç vardır. Memelilerde, N -glycans bir çekirdek yapısı dekore sakarit birimi (heksozlar (Hex), hekzoaminler (HexNac), sialik asitleri (NeuAc) ve fucoses (Fuc)), (Hex 3 HexNac 2) 4 kovalent olarak bağlı tekrar oluşur asparajin. Izomerleri sayılır zaman glycospace oldukça geniş olmasına rağmen (&gt; 10 ila 12), bu gibi bir bileşim olarak oldukça küçük ve moleküler ağırlıkları tipik olarak 1,000-8,000 da 5 &lt;arasında değişir/ Sup&gt;. Sınıfının kompozisyon homojenliği ve glıkanların hidrofiliklik saflaştırma, ayırma özel bir sorun teşkil ve kütle spektrometrisi (MS) 6 akışları. Geleneksel olarak, N -glycans F (PNGase F) ile Peptid N protein veya peptidlerden glikosidaz sindirilir ve daha sonra hidrazid boncuklar 8 ile lektin afinite kromatografisi 7 ile zenginleştirilmiş yakalanan veya katı faz ekstraksiyonu (SPE), 9,10 ile saflaştırılmıştır. Bu yöntemlerin hepsi son derece etkili olsa da, tuzsuzlaştırma için ekstra adımlar tanıtmak ve örnek sayısı aynı anda işleme sınırlamak. Son on yılda, Glikomik için yüksek verimli platformlar bir dizi önerilmiştir. Kim ve ark., Bir vakum çalışan, SPE 96 oyuklu plaka 11 ile, bir yarı-otomatik bir yöntem yayınlanmıştır. Alternatif olarak, bir afinite filtre yöntemi (N -glyco-FASP) fi ilk türetme gerekli Mann grubu tarafından geliştirilenLektinlerin 12 bir kompozit ile ltresi. Son olarak, Thomas-Oates grup glycospace 13 dar kompozisyon boyutunu sömürülen bir yarı-kantitatif bir yöntem, N -Glycan Ayırma (dişleri) Destekli Filtre, önerdi. Molekül ağırlığı kesme filtreleri dayanarak küçük kirletici maddeler ilk atık için yıkandı ve daha sonra N -glycans sindirilir ve yıkandı. Deglikolize proteinler Bu protokol filtre üzerinde kalır ve hat FASP tabi tutulabilir. Tanımlama ve elektrosprey iyonizasyon ile glıkanların miktar (ESI) MS düşük miktardaki türlerinin tespiti için izomerleri ve türetme (kısmen) çözümlemesi için off-line ayrımları gerektirir. Bireysellik etiketleme glikan hidrazit etiketleri stratejisi ile normalize ters-faz sıvı kromatografisi (RPLC) 14,15 ile uyumluluğu bahşeder. 4-fenetil-benzohidrazid (P2PGN) hidrofobik etiketi enh, glıkanların hidrofilikliğini aracılıkortalama ile iyonizasyon ancing, 16 dört kat. Basit şartlarda stoikiometrik 1: örneğin permethylation 17 ya da amin-reaktif etiketleme kimyaları 18 gibi diğer teknikler, benzer avantajlar sunmaktadır rağmen, hidrazid reaksiyonda, glikanlar 1 tepkimeye sokulur. Rölatif ölçümü yerli (NAT) veya 13 C 6 stabil izotop etiket (SIL) ile derive edilmiş numunelerin ikili analizi ile elde edilmektedir. Aşağıdaki yöntem doğru göreceli ölçümü için P2GPN hidrofobik etikete plazma uygulamaları ve çiftler bunu için dişlerini geliştikçe. Ayrıca, bu analizler bütünlüğünden ödün vermeden, numunenin tek alikot üzerinde atış-silah proteomik, deamidasyon profilleme ve kantitatif Glikomik gerçekleştirmek için tasarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Asetik Asit (%50)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril, HPLC sınıfı</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reaktifi</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>B6916</td><td>Alternatif: Bikinkoninik asit kiti (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr> <tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>14.000 x g'a ulaşan alternatif santrifüjler uygundur</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol, 1&nbsp; Çözümdeki M</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>Alternatif nano veya ultra yüksek basınçlı LC'ler, aşağıdakiler gibi benzer veriler üretecektir: 1. Dionex UltiMate & Ograve; 3000 LC (Termo Bilimsel); 2. Beraat UPLC (Sular).</td></tr><tr><td>Yüzer Tüp Rafı</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp Standart Laboratuvar Fırınları</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>56&nbsp'ye ulaşan alternatif inkübatörler; &deg; C uygun</td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE Mikrodalga Fırın</td><td>General Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>Ayarlanabilir güç ayarlarına sahip herhangi bir mikrodalga uygundur</td></tr><tr><td>INLIGHT Glikan Etiketleme Kiti&nbsp;</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>GTK-1000</td><td>INLIGHT kiti, P2GPN reaktifinin NAT ve SIL versiyonlarını sağlar.</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &Aring;, C18 toplu sabit faz</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>Toplu Medya</td><td>Alternatifi: Herhangi bir C < alt > 18 < / alt> sabit faz 5 & nbsp; mM</td></tr><tr><td>Maskot Daemon Yazılımı ve Sunucu</td><td>Matrisi Bilim</td><td></td><td>Alternatifi: Proteome Discoverer Yazılımı (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>Metanol, HPLC sınıfı</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Kendi Kendine Paket Sütunu: 360&nbsp; &#956; m, OD 75&nbsp; &#956; m Kimliği, 15&nbsp; &#956; m uç, kaplamasız, kutu başına 5 adet, 50 cm</td><td>Yeni Hedef</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (gliserol içermez), 75.000&nbsp; birim / ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hibrit Dört Kutuplu Orbitrap Kütle Spektrometresi</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td>Alternatif yüksek kütle doğruluğu (5 &nbsp; ppm) kütle spektrometreleri benzer veriler sağlayacaktır</td></tr><tr><td>RNase B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td>Domuz Pankreası Sigma Aldrich'ten <td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Konsantratörü Savant SPD131DDA SpeedVac Konsantratör</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>Alternatif vakum konsantratörleri uygundur</td></tr><tr><td>Vivacon 500 30 kDa Filtreler&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>VN01H22</td><td>Alternatifi: Amicon Ultra 0.5 Ultracel-10&nbsp; kDa Membran (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>Su, HPLC sınıfı</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Su, 18O</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>OLM-240-97-1</td><td>PNGase F özetleme adımına 18O ilavesi isteğe bağlıdır ve %95 güvenle tamamlanan deamidasyon çalışmaları için gerekli olmayabilir</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kiti</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

nicel glycomics ve proteomik kombine arıtma stratejisi

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Biyolojik ve klinik bilimlerde, biyolojiyi çözmek, yolları tanımlamak, tedaviyi iyileştirmek, hastalıkları anlamak ve biyobelirteç keşfine yardımcı olmak için birden fazla biyomolekül sınıfını entegre etmek ve ilişkilendirmek için artan bir istek var. N-bağlı glikozilasyon, proteinler üzerindeki en önemli ve sağlam translasyon sonrası modifikasyonlardan biridir ve sinyalleşme, yapışma ve enzimatik fonksiyon gibi kritik hücre fonksiyonlarını düzenler. N-glikanları saflaştırmak ve analiz etmek için analitik teknikler son on yılda nispeten statik kalmıştır. Doğru ve etkili olsalar da, genellikle önemli uzmanlık ve kaynaklar gerektirirler. Bazı yüksek verimli saflaştırma şemaları geliştirilmiş olsa da, bunlar henüz yaygın bir şekilde benimsenmemiştir ve genellikle glikopeptitlerin zenginleştirilmesine dayanır. Thomas-Oates ve arkadaşları tarafından geliştirilen umut verici bir yöntem olan filtre destekli N-glikan ayırma (FANGS), dokular üzerinde kalitatif olarak gösterilmiştir. Burada, sıvı kromatografi kütle spektrometresi ve gelişmiş elektrosprey iyonizasyonu ile doğru nispi miktar tayini elde etmek için FANGS'yi plazmaya uyarladık ve glikan hidrazid etiketleri stratejisiyle etiketleme yaparken bireysellik normalizasyonu ile birleştirdik. Ayrıca, tavuk plazması üzerinde tandem, av tüfeği proteomiği ve glikozilasyon bölgesi analizi yaparak protokole yeni işlevler tasarladık. Filtrede saflaştırılan ve hidrofobik hidrazid etiketleri ile türetilen N-glikanların, bolluk ve sınıf açısından katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile olanlarla karşılaştırılabilir olduğunu gösterdik; İkincisi, bu alanda altın standart olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, iki protokoldeki değişkenlik istatistiksel olarak farklı değildi. Glikomik verilerle uyumlu olarak toplanan proteomik veriler, standart bir tripsin sindirimine kıyasla aynı derinliğe sahipti. Protokolde peptit deamidasyonu en aza indirilerek glikozilasyon motiflerinde tespit edilen spesifik olmayan deamidasyonu sınırlar. Bu, doğrudan glikozilasyon bölgesi analizine izin verdi, ancak protokol 18O site etiketlemesini de barındırabilir. Genel olarak, kantitatif glikomikler ve proteomik analizler için yeni bir hat içi yüksek verimli, tarafsız, filtre tabanlı protokol gösterdik.

<img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> Şekil 1:. Kombine proteomik ve Glikomik analizi için dişleri-P2GPN hidrofobik etiketleme birleştiğinde yöntemin şeması (Yöntem A) verilen glikozilasyon sitesi tanımlama ile Glikomik sadece işleme ve tandem Glikomik ve proteomik analizi arasında farklılık adımlar, vurgulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Içinde hat proteomik ve Glikomik, filtre tabanlı P2GPN hidrofobik etiketleme yöntemi (Yöntem A) toplanmış tavuk plazma örnekleri (Şekil 1) kullanılarak belirlenmesi, kantitatif ve molekül ağırlığı önyargı için doğrulandı. Yalnızca Glikomik deneyler için, N bolluk arası karşılaştırmalar Yöntemi ile ekstre -glycansBir SPE (altın standardı, Metot B) yapılmıştır (Şekil 2) carbograph için. İki yöntem arasındaki glukanlardır bolluk açısından anlamlı bir fark yoktu. aynı yöntemle ekstre glıkanların NAT oranı: içi değişkenliği de SIL nicelleştirilmesiyle tayin edilmiştir. Her iki yöntemin günlük 2 dağıtımı: sıfır merkezli, Gauss vardı ve (Şekil 3A-B) anlamlı olarak farklı değildi. Molekül ağırlığı filtresi N molekül ağırlığı aralığı ve hidrofil (Şekil 4) dayalı -glycans ayrımcılık olmadığını düşündüren, tamamen üst üste iki protokol arasında değişmektedir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> Şekil 2:. NAT ve SIL N eşdeğer moldeki bir karışımı Yöntem A veya Yöntem B ile ekstre -glycans 2.5 tavuk plazma ul (n = 4) Örnekler edildi anal hazırlandıHer NAT / SIL kanalında bölüm 6. Her glikan için bolluğu önerilen önerilen parametrelere göre UPLC-MS ile yzed, moleküler düzeltmek, çıkarılan iyon kromatogram (MMA = 3 ppm) altındaki alanların integrasyonu ile hesaplanmıştır TGNF ağırlık örtüşme ve ayarlama. Bu oranlar standart hata ile gösterilir. Yöntem B bolluğu. Yöntem A N -glycans (p&gt; 0.05) anlamlı bir fark yoktu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> Şekil 3, (A) yöntemi, bir içi değişkenliği (N = 133), ya da (b) Yöntem B (n = 123) stratejiler karşılaştırılmıştır. Aynı çıkarma düzeni N -glycans NAT ve SIL eşit molar karışımları,Üç teknik çoğaltır üzerinde analiz edildi. Günlük 2 dağıtımı: sıfır merkezli ve iki iş akışları arasında. Anlamlı fark edildi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> Şekil 4: Her stratejiden glıkanların molekül ağırlığı aralıkları karşılaştırıldı. İki iş akışları aynı molekül ağırlığı aralığı kapsayan glıkanları vermiştir. N, diğer sadece algılama (1 × 10 5 bolluk) sınırının üzerinde düştü karşı bir protokolde tespit -glycans ve sistematik önyargı yansıtmıyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.içinde sayfa = &quot;1&quot;&gt; proteom geniş analizi ve glikozilasyon sitesi tanımlama in-line etkin molekül ağırlığı filtresi tarafından deglycosylated proteinlerin Tutma. Glikanların ve proteinlerin bir araya saflaştırılması için birden çok protokol Deglikosilasyondan (Tablo 5) olmadan geleneksel FASP hazırlanması ile karşılaştırılmıştır. FASP tripsin sindirmek (Std protokolü) tarafından takip Bizim tipik 18 saat filtre tabanlı PNGase F sindirim, glycosites tanımlanması engelleyebilir non-spesifik deaminasyondan önemli düzeylerde sonuçlandı. Bu nedenle, yüksek bir sıcaklıkta (50 ° C) ve bir PNGase F başak aşama (SPI protokolü) de kısa bir kuluçkalama süresinde kullanan bir yöntem olup, bir mikrodalga sindirim protokolü (MD protokolü) ile birlikte, bir alternatif olarak araştırılmıştır, sivil en aza indirmek için belirli bir deamidasyon. Yeni sindirim yöntemleri gözlenen glıkanlar, standart 18 saat gelen kompozisyonlar ya da bolluk içinde anlamlı bir farklılık yoktu 37 ° C filtre PNGase F özeti ( <strong&gt; Şekil 5). Kısa bir tripsin inkübasyon ile birlikte, non-spesifik deamidasyon anlamlı glycosites &lt;% 5 (Tablo 5) için bir yalancı pozitiflik oranı ile azalmıştır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> proteinler </td><td></td><td colspan="4"> peptitler </td><td></td><td colspan="4"> amitsizleştirilmiş Peptitler </td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4"> glikoproteinler </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> MD </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> 10 </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . Tablo 5: Standart bir tripsin ile proteomik verilerin karşılaştırılması in-line dişleri-P2GPN etiketleme yöntemi yapılmıştır karşı sindirmek hazırlıklar ile gerçekleştirildi (+) ve olmayan (-) PNGase F non-spesifik deaminasyondan ve tahmin arka plan oranlarını belirlemek için yalancı pozitif oranları glycosite. Proteinler% 1 yanlış keşif oranı (FDR) ile tespit edilmiştir; peptidler Proteome Discoverer 1.4 &quot;yüksek&quot; peptid güvene dayalı filtre edildi (q &lt;0.01); glycosites saptanmasına edildied korunmuş glikosilasyon motifi (NXS / T) deamidasyonu içeren benzersiz dizilerinin dayalı; ve glikoproteinler, en az bir tespit glycosite ihtiva tanımlanan proteinler olarak tanımlandı. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> Şekil 5: glikanlara kısaltılmış protokoller örneklerde deaminasyonu en aza indirmek için geliştirilmiş ve 18hr dişleri PNGase F Digest karşılaştırılmıştır. bollukları ortalama farklılıklar% 10 ve sırasıyla MD (2.2.3) ve SPI (2.2.2) protokolleri,% 5 idi. Tespit 48 glukanlardır,% 90 daha az 1,5 kat varyasyon daha. Görüntülenen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Tek filtre tabanlı bu iş akışının genel amacı, kütle spektrometrisi analizi için biyolojik örneklerdeki N-glikanları ve proteinleri tandem şeklinde kolayca ve kantitatif olarak saflaştırmaktır. Bu yöntemin ölçeklenebilirliği, hızı ve analitik tekrarlanabilirliği, onu kaynaklar ve beceri setleri açısından biyolojik kütle spektrometrisi laboratuvarları için doğrudan erişilebilir kılmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların büyük ölçekli, yüksek kapasiteli biyolojik çalışmalarda glikomik, glikozilasyon bölgesi doluluk oranı ve proteomik soruları eş zamanlı olarak incelemesine olanak tanımasıdır.Bu yöntemi, kütle spektrometrisine uygun bir türevlendirme stratejisiyle birleştirerek N-glikan ölçümlerindeki zorlukların üstesinden geldik ve böylece kanserli ve kontrol durumları arasında doğru, bağıl kantifikasyon sağladık. Analitik değişkenliğin azaltılmasıyla, glikom ve proteom arasındaki yeni biyolojik etkileşimler aydınlatılarak hastalık durumlarına dair temel bilgiler elde edilebilir ve biyobelirteç keşfi için yeni fırsatlar sunulabilir. Başlamak için, bir filtreye 2.5 µL plazma yükleyin.Ardından, filtredeki her bir örneğe 2 µL 1M ditiyotreitol çözeltisi ekleyin. Örneği 200 µL 100-mM Amonyum Bikarbonat PNGaz sindirim tamponu ile seyreltin. Filtre örnek tüpünün kapağını kapatın ve filtrenin yuvasından kaymamasına dikkat ederek hafifçe vorteksleyin.Proteinleri ve glikoproteinleri denatüre etmek için numuneyi 30 dakika boyunca 56 °C'de inkübe edin. Numuneleri alkilleştirmek için, yaklaşık 200 mM final konsantrasyonu sağlayacak şekilde 50 µL 1M Iodoacetamide ekleyin. Ardından, 60 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.Süzüntüyü atmadan önce, örnekleri 40 dakika boyunca 14, 000 x g'de santrifüj ederek denatüre glikoproteini filtre üzerinde yoğunlaştırın. Örneği 100 µL PNGase sindirim tamponu ile yıkayın. Glikoproteini filtre üzerinde yoğunlaştırın ve süzüntüyü atın.Yıkama ve deriştirme adımını, filtre ölü hacminde bir konsantre elde edene kadar toplam üç kez olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın. Yıkama işlemleri tamamlandığında tüm akış sıvısını ve toplama tüpünü atın. Ardından, taze bir toplama tüpüne aktardıktan sonra filtreye 2 µL gliserolsüz peptid N-glikozidaz F veya PNGase F ekleyin.Toplam hacmi 100 µL'ye tamamlayacak şekilde 98 µL PNGase sindirim tamponu ekleyin ve karıştırmak için filtre üzerinde nazikçe pipetleme yapın. Sindirim sırasındaki ekleme (spike-in) protokolü için örnekleri 50 °C'de 2 saat inkübe edin. Hızlıca hareket ederek örnekleri çıkarın ve ek olarak 2 µL gliserolsüz PNGase F ekleyin. Karıştırmak için örnekleri 1 ila 2 saniye boyunca hafifçe vorteksleyin.Numuneleri 50 °C'de 2 saat daha inkübe edin. Numuneyi 20 °C'de santrifüj ederek glikanları elüye ettikten sonra, filtreye 100 µL PNGase sindirim tamponu ekleyin ve tekrar santrifüj edin. Geriye kalan N-bağlı glikanları içeren yıkama çözeltisini, elüent ile aynı toplama tüpüne toplayın.İşlemi iki kez tekrarladıktan sonra filtreyi çıkarın ve proteomik hazırlık için yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Ardından, glikan örneklerini donana kadar 30 ila 60 dakika boyunca 80 degrees Celsius dondurucuda inkübe edin. Daha sonra, vakumlu konsantratörde oda sıcaklığında 4 ila 6 saat boyunca tamamen kurutun.Deamine edilmiş peptitleri içeren filtreyi 400 µL 8M üre tamponu ile durulayın. Toplama tüpünün kapağını kapatın ve karıştırmak için hafifçe vorteksleyin. Tüm süzüntüyü atmadan önce peptitleri filtre üzerinde konsantre edin.Üre tamponuyla yıkama işlemini iki kez daha tekrarladıktan sonra, deamine edilmiş peptitleri içeren filtreyi Trypsin sindirim tamponu ile durulayın. Toplama tüpünün kapağını kapatın ve daha önce olduğu gibi filtre üzerinde tekrar konsantre etmeden önce karıştırmak için hafifçe vorteksleyin. Tüm süzüntüyü atın ve toplamda 3 Trypsin sindirim tamponu yıkaması olacak şekilde işlemi 2 kez daha tekrarlayın.Gelecekteki tüm elüentleri ve yıkama sıvılarını yeni bir toplama tüpünde toplayın. Ardından, keşif proteomiği için 1:50 tripsin-protein oranında veya kantitatif proteomik deneyler için 1:5 tripsin-protein oranında 50 µL porcine-modified Trypsin ekleyin. Toplama tüpünün kapağını kapatın ve karıştırmak için hafifçe vorteksleyin.Numuneleri 37 °C'de 2 saat inkübe ettikten sonra, numuneleri hızlıca çıkarın ve uygun tripsin-protein oranında ek 50 µL Trypsin ekleyin. Karıştırmak için numuneleri 1 ila 2 saniye hafifçe vorteksleyin. Ardından, 50 °C'de 2 saat daha inkübe edin.Peptitlerin daha önce yapıldığı gibi 20 dakika santrifüj edilerek elüsyonu tamamlandıktan sonra, filtrede kalan peptitleri Quench tamponu ile yıkayın. Daha önce yapıldığı gibi 15 dakika santrifüj ederek filtreden elüe edin. Örneklerdeki peptit konsantrasyonunu belirledikten sonra, peptit örneklerini donana kadar 80 derece Celsius dondurucuda inkübe edin.Ardından, bir vakum konsantratöründe oda sıcaklığında 4 ila 6 saat boyunca tamamen kurutun. Daha sonra, sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi veya LCMS analizi öncesinde tripsinle sindirilmiş proteinleri, istenen konsantrasyona ulaşana kadar Mobil faz A ile seyrelterek hazırlayın. 2.5 µL plazmadan elde edilen tripsinle sindirilmiş peptit konsantrasyonları 100 ile 300 ng/µL arasındadır.Glikan analizinden önce, kurutulmuş stabil izotopla işaretlenmiş 4-fenetil benzohidrazit reaktiflerini ve doğal P2GPN reaktiflerini, nihai konsantrasyonu 0,25 mg/mL olacak şekilde bir mililitre türevlendirme çözeltisi ile yeniden çözünür hale getirin. Reaktiflerin tamamen çözünmesi 10 dakikayı bulabilir. Tam çözünmeyi sağlamak için kuvvetlice vorteksleyin.Kurutulmuş N-glikanları 200 µL stabil izotopla işaretlenmiş veya doğal P2GPN reaktifi ile işaretleyin. Kurutulmuş glikanları yeniden süspande etmek için pipetle yukarı aşağı çekme işlemi yapın. Ardından, örnekleri vorteksleyin ve bir masaüstü santrifüjde yaklaşık 5 saniye boyunca çöktürün.Glikanları reaktifle 56 °C'de 3 saat boyunca reaksiyona sokun. Glikanları inkübatörden vakumlu konsantratöre hemen aktarın ve 55 °C'de 3 ila 5 saat boyunca tamamen kurutun. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrisi analizinden hemen önce, işaretlenmiş N-glikanı 25 ila 50 µL suda yeniden süspanse edin.N-glikanların tamamen çözünür olduğundan emin olmak için pipetle aşağı yukarı hareket ettirin. Örnekları daha önce yapıldığı gibi 5 dakika santrifüjledikten sonra, pipet ucunun santrifüj tüpünün tabanına değmemesine dikkat ederek süpernatanı uzaklaştırın. Rölatif kantifikasyon tandem analizi için bir adet doğal ve bir adet stabil izotopla işaretlenmiş örneği 1:1 oranında birleştirin.Proteomik ve glikomik iş akışları için 2 farklı LCMS yöntemi hazırlayın. Protein analizi için, NPA içerisinde yaklaşık 400 nanogram proteini kolona enjekte edin. Örneği, 1 mikrolitrelik ön kolon dengelemesi ve 5 mikrolitrelik analitik kolon dengelemesi ile dakikada 300 nanolitre akış hızında çalıştırın.Proteinleri, metin protokolünde belirtilen MS koşulları altında iyonize edin. Glikan analizi için, yeniden süspanse edilmiş P2GPN etiketli doğal ve stabil izotopla işaretlenmiş equi-M örneklerinden 5 µL'yi kolona enjekte edin. Örneği, 2 µL ön kolon dengelemesi ve 5 µL analitik kolon dengelemesi ile dakikada 300 nL akış hızında çalıştırın.Ardından, glikanları metin protokolünde belirtilen MS koşulları altında iyonize edin. Filtre tabanlı saflaştırma protokolü, standart katı faz ekstraksiyon yöntemi ile karşılaştırılmış ve iki protokol arasında tespit edilen plazma glikanlarının bollukları açısından anlamlı bir fark bulunmamıştır. Her iki yöntemde de aynı glikanlar, değişkenliğin arttığı tespit limitine yakın bölgelerde saptanmıştır.Filtre tabanlı veya standart katı faz ekstraksiyon protokolü ile saflaştırılan plazmaların equiM karışımları için değişkenlik değerlendirildi. Her iki protokolün de ortalamaları sıfırdan önemli ölçüde farklı olmayan Gauss dağılımları sergiledi. Glikanların yüzde 80'i iki katlık değişim sınırları içerisinde kaldı.Yeni ve geleneksel saflaştırma protokollerinde tespit edilen glikanların moleküler ağırlık dağılımları arasında anlamlı bir fark yoktu ve aynı aralığı kapsıyordu. Kalitatif olarak, glikanlar arasında herhangi bir yanlılık gözlemlenmedi. Plazma proteinleri, standart filtre destekli örnek hazırlama ve çoklu hat içi (in-line) protokoller kullanılarak hazırlandı.Tanımlanan protein sayısı çeşitli protokoller için benzerdi. Mikrodalga sindirimi ve spike sindirimi protokollerinde spesifik olmayan deamidasyon yüzde 10'un altına kontrol edildi. Bu prosedür uygulanırken, doğru glikozilasyon bölgesi doluluğunun ısı ve süre maruziyetinin minimize edilmesine bağlı olduğunu unutmamak önemlidir.Uzmanlaşıldığında, hat içi pecurikene N-glikan saflaştırma işlemi 2 günde tamamlanabilir. Bu prosedür izlenerek, doğru protein N-glikan kantifikasyonu ve glikozilasyon bölgesi doluluğu, yüksek dereceli istatistiksel teknikler kullanılarak entegre edilebilir ve modellenebilir. Bu teknik, kanser biyolojisinin konuştuğu karmaşık dili hızlıca okuma, protein terapötiklerdeki farkları nicel olarak karşılaştırma ve biyolojik bir bağlamda glikozilasyonun önemini gerçek anlamda ortaya çıkarma olanağı sağlar.

a-quantitative-glycomics-and-proteomics-combined-purification-strategy

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Bu videoda, karmaşık bir peptit karışımından kalan di-glisin peptitleri içeren ubikitinile peptitlerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, proteindeki orijinal ubikitinasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Mevcut protokol, kütle spektrometrisinden önce proteom numunelerinin sağlam ve hızlı geri kazanımı ve saflaştırılması için kontrollü koşullar altında çözücü bazlı protein çökeltmesini açıklamaktadır.

Kütle Spektrometrisinden Önce Sağlam Proteom Saflaştırması için Organik Solvent Bazlı Protein Yağışı

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Daha önce glikanların proteinler üzerinde otomatik ve hızlı analizi için bir sistem geliştirilmiştir. Bu makale, biyofarmasötikler ve diğer glikokonjugat malzemelerdeki glikan yapılarını analiz etmekle uğraşanlar gibi geniş bir kullanıcı yelpazesi için optimize edilmiş "gliko-kalitatif analiz" protokolünü sunmaktadır.

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Keşfedin, LC-MS/MS kullanarak plazmadan N-glikan ve proteinlerin eşzamanlı saflaştırılması ve nicelendirilmesi için yüksek verimli bir protokol. Bu yöntem, glikomik ve proteomik araştırmalarda doğruluğu artırır ve biyobelirteç keşfini kolaylaştırır.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Daha fazla video keşfet