Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Bu tek filtre tabanlı iş akışının genel amacı, kütle spektrometresi analizinden elde edilen biyolojik numunelerden N-glikanları ve proteinleri birlikte kolay ve kantitatif olarak saflaştırmaktır. Bu yöntemin ölçeklenebilirliği, hızı ve analitik tekrarlanabilirliği, biyolojik kütle spektrometresi laboratuvarlarına kaynaklar ve beceri setleri açısından doğrudan erişilebilir olmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların büyük ölçekli yüksek verimli biyolojik çalışmalarda glikomik, glikozilasyon bölgesi doluluğu ve proteomik sorularını aynı anda araştırmalarına izin vermesidir.

Bu yöntemi kütle spektrometresine özel bir türevleştirme stratejisine bağlayarak N-glikan ölçümlerinin zorluklarının üstesinden geldik ve bu da kanser ve kontrol durumları arasında doğru, göreceli niceleme ile sonuçlandı. Analitik değişkenliğin azalmasıyla, glisit ve proteom arasında yeni biyolojik etkileşimler açıklanabilir, bu da hastalık durumlarına ilişkin önemli bilgiler ve biyobelirteç keşfi için yeni fırsatlar sağlar. Başlamak için, bir filtreye 2,5 mikrolitre plazma yükleyin.

Ardından, filtredeki her numuneye 2 mikrolitre 1M ditiyotreitol çözeltisi ekleyin. Numuneyi 200 mikrolitre 100 mM Amonyum Bikarbonat PNGase sindirim tamponu ile seyreltin. Filtreyi kapatınample tüp ve filtreyi yuvasından rahatsız etmemeye dikkat ederek hafifçe girdap yapın.

Proteinleri ve glikoproteinleri denatüre etmek için numuneyi 56 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Numuneleri alkilleştirmek için, yaklaşık 200 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 50 mikrolitre 1M İyodoasetamid ekleyin. Ardından, 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

Denatüre glikoproteini, akışı atmadan önce numuneleri 14.000 x g'da 40 dakika santrifüjleyerek filtreye konsantre edin. Numuneyi 100 mikrolitre PNGase sindirim tamponu ile yıkayın. Glikoproteini filtreye konsantre edin ve akışı atın.

Yıkama ve konsantre etme adımını toplam üç kez olmak üzere iki kez tekrarlayın ve filtre ölü hacminde bir konsantre elde edin. Yıkamalar tamamlandıktan sonra tüm akışı ve toplama şişesini atın. Ardından, taze bir toplama şişesine aktardıktan sonra filtreye 2 mikrolitre gliserol içermeyen peptit N-glikosidaz F veya PNGase F ekleyin.

Toplam hacmi 100 mikrolitreye çıkaran 98 mikrolitre PNGase sindirim tamponu ekleyin ve karıştırmak için filtrenin üzerinde hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Sindirim protokolündeki ani artış için, numuneleri 50 santigrat derecede 2 saat inkübe edin. Hızlı bir şekilde çalışarak, numuneleri çıkarın ve ilave 2 mikrolitre gliserol içermeyen PNGase F'ye ekleyin. Karıştırmak için numuneleri 1 ila 2 saniye hafifçe girdaplayın.

Numuneleri 50 santigrat derecede 2 saat daha inkübe edin. Numuneyi 20 santigrat derecede santrifüjleyerek glikanlardan kurtulduktan sonra, filtreye 100 mikrolitre PNGase sindirim tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Kalan N'ye bağlı glikan içeren yıkamayı, eluent ile aynı toplama şişesinde toplayın.

İki kez tekrarladıktan sonra, filtreyi çıkarın ve proteomik hazırlık için yeni bir toplama şişesine yerleştirin. Daha sonra, glikan örneklerini 80 santigrat derece dondurucuda donana kadar 30 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında bir vakum yoğunlaştırıcıda 4 ila 6 saat boyunca kurutun.

Deanimated peptitleri içeren filtreyi 400 mikrolitre 8M üre tamponu ile durulayın. Toplama şişesini kapatın ve karıştırmak için hafifçe girdaplayın. Tüm akışı atmadan önce peptitleri filtreye konsantre edin.

Üre tamponu yıkamasını iki kez daha tekrarladıktan sonra, deanimasyonize peptitleri içeren filtreyi Tripsin sindirim tamponu ile durulayın. Toplama şişesini kapatın ve daha önce olduğu gibi filtreye tekrar konsantre olmadan önce karıştırmak için hafifçe girdap yapın. Tüm akışı atın ve toplam 3 Tripsin sindirim tamponu yıkaması için 2 kez daha tekrarlayın.

Gelecekteki tüm eluentleri ve yıkamaları yeni bir toplama şişesinde toplayın. Ardından, keşif proteomikleri için 1:50 Tripsin-protein oranında veya kantitatif proteomik deneyler için 1:5 Tripsin-protein oranında 50 mikrolitre domuz modifiye Tripsin ekleyin. Toplama şişesini kapatın ve karıştırmak için hafifçe girdaplayın.

Numuneleri 37 santigrat derecede 2 saat inkübe ettikten sonra, numuneleri çıkarmak için hızlı bir şekilde çalışın ve uygun Tripsin-protein oranında 50 mikrolitre daha Tripsin ekleyin. Karıştırmak için numuneleri 1 ila 2 saniye hafifçe girdaplayın. Ardından, 2 saat daha 50 santigrat derecede inkübe edin.

Peptitlerin daha önce olduğu gibi 20 dakika santrifüj edilerek elüsyonunu takiben, kalan peptitleri filtreden Quench tamponu ile durulayın. Daha önce olduğu gibi 15 dakika santrifüj ederek filtreyi çıkarın. Numunelerdeki peptit konsantrasyonunu belirledikten sonra, peptit numunelerini donana kadar 80 derece dondurucuda inkübe edin.

Daha sonra, oda sıcaklığında bir vakum yoğunlaştırıcıda 4 ila 6 saat boyunca kurutun. Daha sonra triptik proteinler, sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi veya LCMS analizinden hemen önce Mobil faz A'da istenen konsantrasyona getirilir. 2.5 mikrolitre plazmadan triptik peptit konsantrasyonları, mikrolitre başına 100 ila 300 nanogram arasında değişir.

Glikan analizinden önce, 4-fenetil benzohidrazid reaktifleri olarak etiketlenmiş kurutulmuş stabil izotopu ve ayrıca mililitre başına 0.25 miligramlık bir nihai konsantrasyon için bir mililitre türevleştirme çözeltisi içinde doğal P2GPN reaktiflerini sulandırın. Reaktiflerin tamamen çözünmesi 10 dakika kadar sürecektir. Tam çözünürlüğü sağlamak için kapsamlı bir şekilde girdap.

Kurutulmuş N-glikanları 200 mikrolitre kararlı izotop etiketli veya doğal P2GPN reaktifi ile etiketleyin. Kurutulmuş glikanları yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, numuneleri girdaplayın ve bir tezgah üstü santrifüjde yaklaşık 5 saniye aşağı çevirin.

Glikanları reaktif ile 56 santigrat derecede 3 saat reaksiyona sokun. Glikanları hemen inkübatörden vakum yoğunlaştırıcıya aktarın ve 3 ila 5 saat boyunca 55 santigrat derecede tamamlanana kadar kurutun. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi analizinden hemen önce etiketli N-glikanı 25 ila 50 mikrolitre su içinde yeniden süspanse edin.

N-glikanların tamamen çözündüğünden emin olmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Numuneleri daha önce olduğu gibi 5 dakika santrifüjledikten sonra, pipet ucunun santrifüj tüpünün dibine temas etmemesine dikkat ederek süpernatanı çıkarın. Bağıl miktar tayini tandem analizi için bir çift doğal ve kararlı izotop etiketli numuneyi 1:1 oranında birleştirin.

Proteomik ve glikomik iş akışları için 2 farklı LCMS yöntemi hazırlayın. Protein analizi için, NPA'daki kolona yaklaşık 400 nanogram protein enjekte edin. Numuneyi dakikada 300 nanolitrede, 1 mikrolitre ön kolon dengelemesi ve 5 mikrolitre analitik kolon dengelemesi ile çalıştırın.

Proteinleri, metin protokolünde sağlanan MS koşulları altında iyonize edin. Glikan analizi için, 5 mikrolitre yeniden askıya alınmış P2GPN etiketli doğal ve kararlı izotop etiketli equi-M numunelerini kolona enjekte edin. Numuneyi 2 mikrolitre ön kolon dengelemesi ve 5 mikrolitre analitik kolon dengelemesi ile dakikada 300 nanolitrede çalıştırın.

Ardından, metin protokolünde sağlanan MS koşulları altında glikanları iyonize edin. Filtre bazlı saflaştırma protokolü, standart katı faz ekstraksiyon yöntemiyle karşılaştırıldı ve 2 protokol arasında tespit edilen plazma glikanlarının bolluğu önemli ölçüde farklı değildi. Her iki yöntemde de, aynı glikanlar, değişkenliğin arttığı tespit sınırına yakın bulundu.

Filtre bazlı veya standart katı faz ekstraksiyon protokolü ile saflaştırılan plazmanın equiM karışımları için karşılıklı değişkenlik değerlendirildi. Her iki protokol de ortalamaları sıfırdan önemli ölçüde farklı olmayan Gauss dağılımlarına sahipti. Glikanların yüzde 80'i iki kat değişim içinde düştü.

Yeni ve geleneksel saflaştırma protokollerinde tespit edilen glikanların moleküler ağırlık dağılımları önemli ölçüde farklı değildi ve aynı aralığı kapsıyordu. Niteliksel olarak, glikanlar arasında herhangi bir önyargı gözlenmedi. Plazma proteinleri, standart filtre destekli numune hazırlama ve çoklu hat içi protokollerle hazırlandı.

Tanımlanan proteinlerin sayısı çeşitli protokoller için benzerdi. Spesifik olmayan deamidasyon, mikrodalga sindiriminde kontrol edildi ve hazımsızlık protokollerini yüzde 10'un altına düşürdü. Bu prosedürü denerken, doğru glikozilasyon bölgesi doluluğunun ısı ve zamana maruz kalmayı en aza indirmeye bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, satır içi pecurikene N-glikan saflaştırması 2 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü izleyerek, doğru protein N-glikan miktar tayini ve glikozilasyon bölgesi doluluğu, daha yüksek dereceli istatistiksel teknikler kullanılarak entegre edilebilir ve modellenebilir. Bu teknik, kanser biyolojisinin konuştuğu karmaşık dili hızlı bir şekilde geri okuma, protein terapötiklerindeki farklılıkları nicel olarak karşılaştırma ve biyolojik bağlamda glikozilasyonun önemini gerçekten ortaya çıkarma yeteneği sağlar.