Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Bu görüntüleme protokolünün genel amacı, genetik olarak kodlanmış bir pH indikatörü kullanarak hücre içi pH'ın miktar tayinini tanımlamak ve bu yöntemin bir böcek böbrek yapısı modeli olan malpighian tübülde bazolateral proton taşınmasını değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu yöntem, spesifik taşıyıcı proteinlerin hücre içi pH regülasyonunda epitelyal proton hareketine nasıl katkıda bulunduğu gibi hücresel taşıma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücresel taşımanın, fonksiyonel olarak farklı sağlam epitel bölgeleri boyunca hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilebilmesidir.

Bu yöntem pH regülasyonu ve böcek epiteli hakkında bilgi sağlayabilse de, memeli nefronu ve kültürdeki epitel hücreleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, her iki tarafta bir kelepçe olacak şekilde görüntüleme mikroskobu aşamasına iki set lehimleme yardımcı el kelepçesi yerleştirin. Ardından, ilgili bükülmüş cam kılcal damarları ve giriş hattını ve vakumla bağlı çıkış hattını yerleştirin.

Daha sonra yardım ellerine monte edin ve bunları mikroskobun görüntüleme aşamasıyla hizalayın. Tavan bandının üzerine vakumlu gres sürün ve tabanı gresle kaplamak için yapışkan bolluk kuyusu bölücüyü bandın üzerine bastırın. Yapışkan perfüzyon kuyusu bölücüsünü soyun ve yağlı tarafı aşağı bakacak şekilde poli lizin kaplı bir sürgünün üzerine yerleştirin.

Bunu takiben, hidrofobik greste izlenen bireysel spesifik oyukları bırakmak için perfüzyon kuyusu bölücüsünü çıkarın. Bundan sonra, yağlanmış içine 200 mikrolitre oda sıcaklığında IPBS veya böcek fosfat tampon salin yerleştirin ve poli lizin kaplı slayt üzerinde iyice daire çizin. Daha sonra, slaytı steroskopun altına yerleştirin, buz gibi soğuk Schneider ortamını diseksiyon kabına dökün ve tek bir anestezi uygulanmış dişi sineği ona aktarın.

Sineği bir dizi forseps ile göğüs kafesinden tutun ve diğerini arka karın bölgesini nazikçe kavramak için kullanın. Sineğin arka ucunu kısa kasıtlı hareketlerle çekin. Arka koruma göründüğünde, distal ucu kavrayın ve tekrarlayan kısa çekişler yoluyla arka koruyucuyu vücuttan uzaklaştırarak bağırsağı ve anteleri alttaki trakeallerden kurtarın.

Daha sonra, ikinci antes seti karından serbest kaldığında, üreterin ön antesini ince forseps ile sıkıştırın. Tübüller her iki tarafa düşecek şekilde çubuğu üreterin altına kaydırarak kutup cam çubuğu ile serbest ön anteleri alın. Bunu takiben, anteleri düz bir şekilde yukarı kaldırın, çözeltiden çıkarın, bundan sonra cam çubuğu, antes ve üreter çubuğun alt tarafına yapışacak şekilde çevirin.

Üreteri düz bir şekilde kızağın üzerine indirin, ardından üreteri sabitleyin ve üreteri cam kızağa daha fazla bastırarak antesin distal uçlarını kapatın. Her bir tübülü slayt yüzeyi boyunca nazikçe süpürmek için cam çubuğun ince ucunu kullanın. Tübülün ezilmesini önlemek için çubuğu sürgüye karşı sıyırın ve her bir tübülün tam uzunluğunu poli lizin kaplı sürgünün yüzeyine tutturmak için distalden proksimale doğru hareket ederek çubuğu tübülün üst kısmına kaydırın.

Bu tekniğin başarısı tamamen anterior malpighian tübüllerinin doğru tanımlanmasına ve dikkatli bir şekilde kullanılmasına bağlıdır. Hasarlı tübüller tutarsız sonuçlar üretecektir. Ardından, monte edilmiş tübülün üzerine iyice doldurulmuş küçük bir sıvı oluşturmak için yapışkan füzyon kuyusu bölücüyü tekrar sürgünün üzerine yerleştirin.

Bundan sonra, numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Giriş ve çıkış kılcal damarlarını sırasıyla füzyon kuyusunun giriş ve çıkış açıklığının üzerine yerleştirin. Bu prosedürde mikroskobu, ışık kaynağını ve görüntüleme sistemini açın, ardından görüntüleme yazılımını açın.

Göz merceklerine bakın ve antesin lümeni iletilen ışık altında net bir şekilde görünene kadar odağı manuel olarak ayarlayın. Ardından, alım sekmesine tıklayın ve alım yükü bölümündeki karartma açılır menüsünde 2x2'yi seçin. Aydınlatma ışığını azaltmak ve foto ağartmayı en aza indirmek için ışık yoluna %5'lik bir nötr yoğunluk filtresi yerleştirin.

Kanallar menüsünde GFP kanalına tıklayın, ardından kamera aracılığıyla floresan sinyalini gözlemlemek için canlı'ya tıklayın. Bundan sonra, pozlama süresini ayarlamak için zaman kaydırıcısını, yoğunluk histogramındaki en parlak piksel değerleri maksimum değerin yaklaşık %40'ı olacak şekilde ayarlayın. Ardından aydınlatmayı durdurmak için durdur'a tıklayın.

RFP kanalındaki prosedürleri tekrarlayın ve anterior ante'nin genişlemiş başlangıç segmentinin varlığını ve doku hasarını veya aşırı ekspresyonunu gösteren sitosolid m kiraz agregatlarının yokluğunu onaylayın. Daha sonra, zaman serisi onay kutusunu tıklayarak hızlandırılmış bir görüntüleme protokolünü etkinleştirin. Maksimum görüntü yakalama ile toplam yakalama süresini ayarlamak için açılır menüde, zaman serisi bölümünde süreyi 10 dakikaya ve aralık kaydırıcısını sıfıra ayarlayın.

Ardından, kanal bölümündeki hem GFP hem de RFP kutularını işaretleyin. Uygun kapak kontrol cihazını aktive ederek profüzyon sisteminin IPBS hattını açın ve tıklayarak görüntüleme protokolünü başlatın, deneyi başlatın. Bir dakika sonra, uygun vanayı açarak ve IPBS hattını kapatarak 20 saniye boyunca amonyum klorür sonrası çözeltiye geçin.

Ardından, amonyum klorür hattını kapatarak ve IPBS valfini yeniden açarak IPBS'ye dönün. İki noktalı bir kalibrasyon yapmak için, kuyu bölücüyü alttaki slayttan soyarak çıkarın ve kelepçelerdeki füzyon kılcal damarlarını görüntüleme kuyusundan çıkarın. Bunu takiben, pH 7.4'e kadar 200 mikrolitre kalibrasyon IPBS tamponu uygulayın.

Ardından, çözeltiyi görüntüleme kuyusundan çıkarın ve başka bir 200 mikrolitre kalibrasyon çözeltisi ile değiştirin. Tam çözüm değişimini sağlamak için bu işlemi dört kez tekrarlayın. Ardından, görüntülemeden önce hazırlama ve kalibrasyon çözeltisini 30 dakika inkübe edin.

Daha önce belirlenen aynı parametreleri kullanarak, yalnızca bir dakikalık görüntü yakalama değişikliği ile görüntüleme protokolünü tekrarlayın. Daha sonra pH dokuza 200 mikrolitre kalibrasyon IPBS tamponu ekleyin. Solüsyonu görüntüleme kuyusundan çıkarın ve başka bir 200 mikrolitre kalibrasyon solüsyonu ile değiştirin.

Daha sonra, preparatı görüntülemeden önce ikinci kalibrasyon çözeltisinde 10 dakika inkübe edin ve görüntüleme protokolünü tekrarlayın. Bundan sonra, kare kaydırıcısıyla görüntü yığınında gezinirken MeanROI'ye tıklayarak ve yoğunluk histogramında bildirilen hiçbir değerin algılanabilir maksimum değere ulaşmadığını doğrulamak için görüntü analiz yazılımında yığılmış yakalanan görüntüyü inceleyin. Daha sonra, floresan yoğunluğunu çizerek görüntü yığınını analiz edin ve floresan oranı zamanın bir fonksiyonudur, burada, indikatörün pH'a duyarlı ve pH'a duyarsız kanallarında amonyum klorür darbesine beklenen floresan tepkisini görüyoruz.

Bu sinyallerin oranı hücre içi pH geçişini ortaya koymaktadır. Bu analizi gerçekleştirmek için önce meanROI'ye tıklayın ve serbest form aracını seçin. 50 mikrometrelik bir MT izlemek için farenin sol tuşunu basılı tutun ve ROI'yi çizmeyi bitirmek için sağ tıklayın.

Ardından, arka plan yatırım getirisini tanımlamak için bunu MT'ye bitişik bir alanda tekrarlayın. Ardından, ölçümler altında ortalama yoğunluğa tıklayın, dışa aktar, veri tablosu, oluştur'a tıklayarak bir yoğunluk değerleri tablosu oluşturun. Konfigürasyon saat çarkı simgesine tıklayın ve zaman ve ortalama yoğunluk dışındaki tüm parametrelerin seçimini kaldırın.

Yeni oluşturulan veri tablosunun sekmesine sağ tıklayın, farklı kaydet'i seçin ve verileri bir csv dosyası olarak dışa aktarın. Burada gösterilen, geniş bir alan görüntüsü, prensip olarak ön ante hücreleri ve ön ante yıldız hücrelerinde süper eliptik bir flor floresansıdır. Yıldız hücrelerinin ilk segmentte çubuk şeklinde olduğunu, geçiş segmentinde değişken olduğunu ve ana segmentte farklı hücresel projeksiyonlar gösterdiğini unutmayın.

Bu grafik, ilgilenilen bölgelerde 20 saniye, 40 milimolar amonyum klorür darbesine yanıt olarak kalibre edilmiş hücreler arası pH değişikliklerini göstermektedir. Kesikli eğriler, amonyum klorür çekilmesini takiben asit geri kazanım aşamasına uygulanan tek üstel uyumları gösterir. Bundan, bozunmuş sabit değerler türetilir.

Bu grafik, hücre içi pH'ın bir fonksiyonu olarak çizilen asit ekstrüzyon hızını gösterir ve bu grafik, önceki şekildeki üstel uyumlardan türetilen hücre içi pH'ın bir fonksiyonu olarak çizilen asit akışını gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, malpighian tübül ekstraksiyonu, uygun şekilde yapılırsa 10 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, başarının tamamen diseksiyon kalitesine ve pH indikatörünün doğru kalibrasyonuna bağlı olduğunu unutmamak önemlidir.

Bu preparat, epitel hücrelerinde çözünen madde hareketini ve hücre içi sinyalleşmeyi incelemek için floresan kalsiyum ve halojenür indikatörleri gibi genetik olarak kodlanmış diğer biyosensörlerle birleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı drosophila malpighian tübüllerinin nasıl hazırlanacağını, genetik olarak kodlanmış bir pH indikatörünün nasıl görüntüleneceğini ve epitel hücrelerinde proton hareketinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Nitroize ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve müstahzarlara zarar verebileceğini unutmayın ve bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken, yeniden kullanılacak herhangi bir ekipmanı kirletmediğinden emin olmak için önlemler alınmalıdır.