Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Bu prosedürün genel amacı, insan periferik kandan türetilmiş pluripotent kök hücrelerden veya IPS hücrelerinden kondrojenik soy hücreleri üretmektir. Bu yöntem, kıkırdak onarımı için IPS hücrelerinin oluşturulması için hastadan türetilmiş periferik kan hücrelerinin C hücreleri olarak kullanılmasıyla ilgili kıkırdak rejenerasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, kolayca tekrarlanabilir olması ve kondrosit farklılaşmasının serum ve kseno içermeyen koşullarda meydana gelmesidir.

İnsan IPS hücrelerini dört mililitre insan IPSC ortamında, ışınlanmış fare embriyonik fibroblast besleyici hücrelerinden oluşan bir tek tabaka içeren 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına kaplayarak başlayın. Hücreleri 37 santigrat derecede yüzde beş karbondioksit içinde kültürleyin. Kök hücreler yüzde 80 ila 90 oranında birleştiğinde, hücreleri alt kültürleme için dispace çözeltisi ile ayırın.

İki ila üç geçişten sonra, yüzde 80 ila 90 oranında birleşen farklılaşmamış IPSC kolonisini daha küçük parçalara ayırmak için ateşle çekilmiş bir cam iğne kullanın ve 100'den fazla hücre kültürü parçasını, 10 mililitre embriyoid vücut oluşturma ortamı içeren yeni bir yapışmaz 100 milimetre petri kabına aktarın. Mekanik ayrışma, otomatik sindirimden daha iyidir, çünkü yeni kültür kabına aktarılacak küçük hücre parçalarına hücre hasarını azaltır ve insan IPS hücre farklılaşmasını baskılayan besleyici hücrelerin manuel olarak atılmasını duyurur. İnsan IPS hücrelerini hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

İki gün sonra, embriyoid cisimciklerinin yerleşmesine izin vermek için tabağı eğin ve embriyoid cisim oluşum ortamının üç mililitresini dört mililitre taze bazal kültür ortamı ile dikkatlice değiştirin. 10 gün sonra embriyoid cisimler oluşmuş olacaktır. 100 milimetrelik yeni bir tabağı 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca dört mililitre yüzde 0.1 jelatin ile kaplayın.

Embriyoid cisimciklerini süpernatan ile birlikte 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve cisimlerin dört ila beş dakika oturmasına izin verin. Son 0.5 mililitre ortam hariç hepsini aspire edin ve embriyoid cisimciklerini 10 mililitre taze bazal kültür ortamında yeniden süspanse edin. Jelatin katılaştığında jelatini atın.

Daha sonra hücreleri jelatin kaplı tabağa tohumlayın ve tabağı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kültürde 10 gün sonra, embriyoid cisimler fibroblastik hücre büyümelerine farklılaşmış olacaktır. Kondrosit farklılaşmasını indüklemek için, kültürü DPBS ile yıkayın ve hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat derecede üç mililitre yüzde 0.25 tripsin EDTA ile ayırın.

Hücreler plakanın altından kaldırıldığında, reaksiyonu dört mililitre taze bazal kültür ortamı ile nötralize edin ve kültürü beş ila 10 kez nazikçe titre edin. Hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir naylon ağ süzgecinden süzün ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra hücreleri, 10 mililitre taze bazal kültür ortamında jelatin kaplı, 100 milimetrelik yeni bir plakaya tohumlayın.

Kültür yüzde 90 ila 100 birleşmeye ulaştığında, hücreleri saymak için gösterildiği gibi üç mililitre yüzde 0.25 tripsin EDTA ile hasat edin. Santrifüjleme için 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe üç kez 10 ila beşinci hücre alikotunu aktarın. Ve peleti bir mililitre kondrojenik farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve tüpü, peleti bozmadan 21 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kondrojenik hücreler in vitro olarak bir araya gelebilir ve yüksek yoğunluklu kültür koşulları altındayken karakteristik hücre dışı metrikler üretebilir. Kültürde 21 gün sonra, bir insan IPS hücresi kondrojenik pelet oluşmuş olacaktır.

21 günlük kültürden sonra, insan IPSC kondrojenik hücreleri, mavi boyamada alcian mavisi ve toluidin için pozitiftir, bu da HIPSC peletinin başarılı bir kondrojenik farklılaşmasını gösterir. Kollajen iki ve kollajen 10 için immünohistokimyasal analiz, kondrosit benzeri fenotiplerini daha da doğrular. Sülfatlanmış glikozaminoglikan analizi, hücrelerin sülfatlanmış glikozaminoglikan içeriğinin, insan IPSC fibroblastik benzeri hücrelere, embriyoid cisimlere ve farklılaşmamış insan IPS hücrelerine kıyasla, insan IPSC kondrojenik peletlerinde önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini ortaya koymaktadır.

Ayrıca, insan IPSC kondrojenik hücreleri, kondroprogenitör soyunun yüksek bir gen ekspresyon seviyesini ve tamamen farklılaşmış kondrosit belirteçlerini gösterir, bu da başarılı bir kondrojenik farklılaşmanın başarıldığını düşündürür. EB oluşumu yoluyla spontan farklılaşma, EB'lerden hücre büyümesi, hücre kültüründen sonra tek katmanlı hücre kültürü ve 3D pelet kültürü dahil olmak üzere insan IPSC'lerini kondrositlere ayırmak için kullanılan çok aşamalı bir kültür yöntemi. Kondrosit fenotipi, histolojik analiz, biyokimyasal analiz ve kondrojenik gen ekspresyonu ile değerlendirilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan IPS hücresinin kondrositlere farklılaşmasını indüklemek için çok aşamalı bir kültür yönteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik daha hastaya özgü ve uygun maliyetli olabilir.