Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Bu metodolojinin genel amacı, alt popülasyonlar arasında ayrım yaparken heteroselüler popülasyonların pertübasyonlara dinamik fenotipik tepkilerini nicel olarak değerlendirmektir. Fizyolojik etkileşimlerin çoğu, birden fazla hücre tipinin varlığında gerçekleşir. Bu yöntem, hücre biyologlarının heterojen hücrelerin aynı çevresel baskılara nasıl tepki verdiğini ve farklı olanların birbirini nasıl etkilediğini değerlendirmesine yardımcı olabilir.

Bu tekniğin çeşitli avantajları vardır, birden fazla hücre tipi arasında ayrım yapar, doğum ve ölüm oranları ve morfolojik dinamikler dahil olmak üzere alt popülasyonlar üzerinde eşzamanlı analize izin verir. Bu protokol birçok biyolojik süreci incelemek için kullanılabilirken, H3255 tümör hücrelerini ve kemoterapötik bir ilaç olan Erlotinib ile tedavi edilen CCD19LU fibroblast hücrelerini kullanarak iş akışını göstereceğiz. Başlamak için, metin protokolüne göre tüplerde hücre süspansiyonları hazırladıktan sonra, tohumlamayı standartlaştırmak için hücreleri çözelti içinde karıştırmak için tüpleri ters çevirin.

Daha sonra her hücre süspansiyonundan 10 mikrolitreyi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 mikrolitre tripan mavisi ekleyin. Çözeltinin 10 mikrolitresini bir hücre sayma slaytına pipetleyin ve slaytı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin. Hücre sayımını en az üç kez veya elde edilen sayımlar tutarlı olana kadar tekrarlayın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında 100 mikrolitre RPMI'de toplam 1.500 hücre tohumlayın. Her hücre süspansiyonunu, her zaman noktası için aynı plaka kurulumları ile üç kopya halinde plakalayın. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.

10 milimolar Erlotinib stok çözeltisi yapmak için Erlotinib tozuna DMSO ekleyin. Daha sonra, ilacı 10 mikromolar olan en yüksek nihai konsantrasyonun iki katına seyreltmek için hücre kültürü ortamını kullanın. İlacı 1: 10 oranında dört kez seri olarak seyreltin, toplam beş ilaç konsantrasyonu ve ilaç kontrolü yok.

100 mikrolitre ilaç çözeltisini, ortamda seyreltilmiş 1x'lik bir nihai ilaç konsantrasyonu için 96 oyuklu hücre plakasının uygun kuyucuklarına pipetleyin. Daha sonra, floresan bazlı sınıflandırma için hücreleri boyamak için, PBS'de mililitre nükleer leke başına beş mikrogram ve beş mikromolar ölü hücre boyası hazırlayın. Morfolojiye dayalı sınıflandırma için, PBS'de mililitre nükleer leke başına beş mikrogram, beş mikromolar ölü hücre boyası ve beş mikromolar hücre boyası hazırlayın.

Her oyuğa 20 mikrolitre boya çözeltisi ekleyin. Ardından, numuneleri 30 dakika boyunca ışıktan korunarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Görüntü elde etmek için, plakanın altını silmek için %70 etanol kullanın ve plakayı görüntüleme odasına yerleştirin.

Kanal seçimi altındaki kurulum sekmesinde, görüntüye uygun kanalları eklemek için artı düğmesine tıklayın. Düzen seçimi altında, odak düzlemini tanımlamak için her iki mikronda bir, sıfır mikrondan başlayıp 20 mikronla biten bir z test görüntüsü yığını ayarlayın. Yoğunlukları değerlendirmek ve pozlama sürelerini optimize etmek için her kanalın altındaki anlık görüntüye tıklayın.

Zaman alanına gerektiği gibi daha yüksek veya daha düşük değerler girin. Aşağı akış analizinin doğruluğunu sağlamak için hücrelerdeki çekirdekler odakta olmalıdır. Plaka şemasında uygun kuyuları vurgulayın.

Ardından kuyu şemasında, benzer şekilde görüntülenecek 25 alanı vurgulayın. Deneyi çalıştır altında, plaka adında plakayı tanımlayın, ardından, seçilen kanallarda gri tonlamalı TIFF görüntüleri oluşturmak için 10x hedefli görüntü elde etme protokolünü çalıştırmak için başlat düğmesine tıklayın. Açık kaynaklı yazılımları, CellProfiler ve CellProfiler analizini yükledikten sonra, CellProfiler'ı açın, Dosya, İçe Aktar, Dosyadan Boru Hattı'na tıklayın ve uygun dosyayı seçin.

Hücreleri EGFP yoğunluğuna göre H3255 veya CCD19LU olarak sınıflandırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için floresan tabanlı sınıflandırma hattını seçin. Çıktı ayarlarını görüntüle'ye tıklayın, ardından analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve çıkarılan verilerin hedefini seçin. Analizi çalıştırmadan önce, parametre değerlerini kontrol etmek için protokol test modunda test edilmelidir.

Nükleer ve hücresel segmentasyonun doğru olması önemlidir. Bu protokol, değişen çekirdek lekesine sahip hücreleri tanımlamak, çekirdeklerin genişlediği piksel değerinin, en yüksek DNA lekesine sahip çekirdekleri maskeleyecek kadar büyük, ancak çevredeki çekirdekleri maskelemeyecek kadar küçük olmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Popülasyonları floresansa göre sınıflandırmak için önce GFP yoğunluk aralığını yeniden ölçeklendirin, ardından tanımlanan her çekirdeğin GFP yoğunluğunu ölçün ve nesneleri kullanıcı tanımlı bir eşiğe göre sınıflandırın.

Ardından, analize başlamak için görüntüleri analiz et'e tıklayın. Analiz tamamlandığında, hesaplanan verileri görüntülemek için varsayılan çıktı klasörüne gidin. Morfoloji tabanlı sınıflandırma için, tüm hücre morfolojisi özelliklerini oluşturmak için hücre profilleyicide uygun protokolü çalıştırın.

Cell Profiler Analysis yazılımını açın, Cell Profiler'da oluşturulan veritabanı özellikleri dosyasını seçin ve açın. Ekranın sol üst kısmındaki Sınıflandırıcı sekmesine tıklayın. Denemeden rastgele hücre görüntülerini çağırmak için getir'i tıklayın, görüntüler sınıflandırılmamış pencerede görünecektir.

Hücreleri manuel olarak pozitif veya negatif olarak sınıflandırın, bu burada hücreleri seçip uygun bölmeye sürükleyerek H3255 veya CCD19LU temsil eder. Alt popülasyon başına en az 50 hücreyi sınıflandırdıktan sonra, Sınıflandırıcıyı Eğit'e tıklayın ve ardından İlerlemeyi Kontrol Et'e tıklayın. Son olarak, her alt popülasyon için hücre sayılarını içeren bir tablo oluşturmak için Tümünü Puanla'yı tıklayın.

H3255 tümörü ve CCD19LU fibroblast hücrelerinin heterosellüler soğuk kültüründe, çekirdekler DNA boyamaya dayalı olarak tanımlandı ve segmentlere ayrıldı. Hücre popülasyonları, morfoloji farklılıklarına dayalı hücre tiplerini tanımlamak için yapay olarak indüklenen floresan veya makine öğrenimi algoritmasında eğitim ile sınıflandırıldı. Floresan ve morfoloji temelli metodolojiler arasında yüksek bir uyum vardır.

İki sınıflandırma yöntemi aynı görüntülere bağımsız olarak ima edildi ve tedavi edilmemiş ve tedavi edilen popülasyonlarda sırasıyla% 97.4 ve% 92.5 üzerinde anlaştı. Burada hücre morfolojisindeki değişiklikler ve Erlotinib tedavisine yanıt araştırıldı. Üç günlük ilaç tedavisinden sonra, H3255 hücrelerinden çekirdek alanında bir azalma ve bir hücresel alanda bir artış gözlendi.

Bu muhtemelen hücre ölümünden kaynaklanıyordu. Erlotinib'in hücreler üzerinde sitotoksik veya sitostatik bir etkiye sahip olup olmadığını test etmek için, propidyum iyodür boyamasına dayalı olarak ölü hücreler tanımlandı. Erlotinib'in H3255 hücreleri üzerindeki hem sitotoksik hem de sitostatik etkileri, ilaç tedavisini takiben ölüm sayısında artış ve doğum sayısında azalma ile gözlenmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa ardışık olmayan iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, fonksiyonel genomiği araştıran ek soruları ele almak için RA interferansı veya CRISPR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, stromal hücrelerin birden fazla kanser türünde tümör ilerlemesi üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, çevresel uyaranlara karşı heteroselüler tepkilerin nasıl çalışılacağını, özellikle mikroskopi tabanlı görüntüleme verilerinin yüksek verimli bir şekilde nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.