Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Bu metodolojinin genel amacı, alt popülasyonlar arasında ayrım yaparken, heterohücresel popülasyonların pertürbasyonlara karşı verdiği dinamik fenotipik yanıtları nicel olarak değerlendirmektir. Fizyolojik etkileşimlerin çoğu, birden fazla hücre tipinin varlığında gerçekleşir. Bu yöntem, hücre biyologlarının, heterojen hücrelerin aynı çevresel baskılara nasıl yanıt verdiğini ve farklı hücrelerin birbirlerini nasıl etkilediğini değerlendirmelerine yardımcı olabilir.

Bu tekniğin birkaç avantajı vardır; birden fazla hücre tipi arasında ayrım yapar, doğum ve ölüm oranları ile morfolojik dinamikler dahil olmak üzere alt popülasyonların eş zamanlı analizine olanak tanır. Bu protokol birçok biyolojik süreci incelemek için kullanılabilse de, biz iş akışını kemoterapötik bir ilaç olan Erlotinib ile işlem görmüş H3255 tümör hücreleri ve CCD19LU fibroblast hücrelerini kullanarak göstereceğiz. Başlamak için, metin protokolüne uygun olarak tüplerde hücre süspansiyonlarını hazırladıktan sonra, ekimi standart hale getirmek için hücreleri çözeltide karıştırmak üzere tüpleri ters çevirin.

Ardından, her bir hücre süspansiyonundan 10 µL'yi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 µL trypan blue ekleyin. Çözeltiden 10 µL'yi bir hücre sayım lamına pipetleyin ve lamı otomatik bir hücre sayıcıya yerleştirin. Hücre sayımını en az üç kez veya elde edilen sayımlar tutarlı olana kadar tekrarlayın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, 100 microliter RPMI içinde toplam 1.500 hücre ekleyin. Her bir hücre süspansiyonunu, her zaman noktası için özdeş plaka düzenekleri kullanarak üç paralel (triplicate) şeklinde plakaya yerleştirin. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.

10 millimolar Erlotinib stok çözeltisi hazırlamak için Erlotinib tozuna DMSO ekleyin. Ardından, ilacı 10 micromolar olan en yüksek final konsantrasyonun iki katına seyreltmek için hücre kültürü ortamı kullanın. Toplam beş ilaç konsantrasyonu ve bir ilaçsız kontrol elde etmek için ilacı 1:10 oranında dört kez seri seyrelteyin.

Besiyerinde 1x seyreltilmiş nihai bir ilaç konsantrasyonu elde etmek için, hücrelerin bulunduğu 96 kuyucuklu plakanın uygun kuyucuklarına 100 µL ilaç çözeltisi pipetleyin. Ardından, floresan tabanlı sınıflandırma için hücreleri boyamak amacıyla, PBS içerisinde 5 µg/mL nükleer boya ve 5 µM ölü hücre boyası hazırlayın. Morfoloji tabanlı sınıflandırma için ise PBS içerisinde 5 µg/mL nükleer boya, 5 µM ölü hücre boyası ve 5 µM hücre boyası hazırlayın.

Her kuyuya 20 µL boya çözeltisi ekleyin. Ardından, örnekleri ışıktan koruyarak 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Görüntüleri elde etmek için, plaka tabanını %70 etanol ile silin ve plakayı görüntüleme haznesine yerleştirin.

Kurulum sekmesindeki kanal seçimi altında, görüntüye uygun kanalları eklemek için artı düğmesine tıklayın. Yerleşim seçimi altında, odak düzlemini belirlemek için sıfır mikrondan başlayıp 20 mikronda sona eren, her iki mikronda bir test görüntülerinden oluşan bir z yığını ayarlayın. Şiddetleri değerlendirmek ve pozlama sürelerini optimize etmek için her kanalın altındaki anlık görüntü seçeneğine tıklayın.

Zaman kısmına gerektiği gibi daha yüksek veya daha düşük değerler girin. Sonraki analizlerin doğruluğunu sağlamak için hücrelerdeki çekirdekler odakta olmalıdır. Plaka şemasında uygun kuyucukları vurgulayın.

Ardından kuyucuk şemasında, görüntülenecek 25 alanı benzer şekilde vurgulayın. Deneyi çalıştır (run experiment) kısmında, plaka adını (plate name) belirleyin, ardından seçilen kanallarda gri tonlamalı TIFF görüntüleri oluşturmak için 10x objektif ile görüntüleme protokolünü başlatmak üzere başlat (start) düğmesine tıklayın. Açık kaynaklı yazılımlar olan CellProfiler ve CellProfiler analysis kurulduktan sonra CellProfiler'ı açın, Dosya (File), İçe Aktar (Import), Dosyadan Boru Hattı (Pipeline from file) seçeneklerine tıklayın ve uygun dosyayı seçin.

Hücreleri EGFP yoğunluğuna göre H3255 veya CCD19LU olarak sınıflandırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için floresan tabanlı sınıflandırma hattını seçin. Çıktı ayarlarını görüntüle seçeneğine tıklayın, ardından analiz edilecek görüntü dosyalarının konumunu ve çıkarılan verilerin kaydedileceği hedef yeri seçin. Analizi başlatmadan önce, parametre değerlerini kontrol etmek için protokol test modunda denenmelidir.

Nükleer ve hücresel segmentasyonun doğru olması önemlidir. Bu protokol, farklı çekirdek boyama düzeyine sahip hücreleri tanımlamak, çekirdeklerin genişletildiği piksel değerinin, en yüksek DNA boyamasına sahip çekirdekleri maskelemeye yetecek kadar büyük ancak çevredeki çekirdekleri maskelemeyecek kadar küçük olduğundan emin olmak için tasarlanmıştır. Popülasyonları floresan bazlı sınıflandırmak için öncelikle GFP yoğunluk aralığını yeniden ölçeklendirin, ardından tanımlanan her bir çekirdeğin GFP yoğunluğunu ölçün ve nesneleri kullanıcı tarafından tanımlanan bir eşik değere göre sınıflandırın.

Ardından, analizi başlatmak için görüntüleri analiz et (analyze images) seçeneğine tıklayın. Analiz tamamlandığında, hesaplanan verileri görüntülemek için varsayılan çıktı klasörüne gidin. Morfoloji tabanlı sınıflandırma için, tüm hücre morfoloji özelliklerini oluşturmak amacıyla Cell Profiler'da uygun protokolü çalıştırın.

Cell Profiler Analiz yazılımını açın, Cell Profiler tarafından oluşturulan veri tabanı özellikler dosyasını seçin ve aç'a tıklayın. Ekranın sol üst kısmındaki Sınıflandırıcı sekmesine tıklayın. Deneyden rastgele hücre görüntüleri çağırmak için getir'e tıklayın, görüntüler sınıflandırılmamış penceresinde görünecektir.

Hücreleri, uygun kutucuğa seçip sürükleyerek pozitif veya negatif (burada H3255 veya CCD19LU'yu temsil eder) olarak manuel olarak sınıflandırın. Her alt popülasyon için en az 50 hücreyi sınıflandırdıktan sonra, Train Classifier'a ve ardından Check Progress'e tıklayın. Son olarak, her alt popülasyon için hücre sayılarını içeren bir tablo oluşturmak üzere Score All'a tıklayın.

H3255 tümör ve CCD19LU fibroblast hücrelerinden oluşan heteroselüler bir soğuk kültürde, çekirdekler DNA boyamasına göre tanımlanmış ve segmente edilmiştir. Hücre popülasyonları, morfolojik farklılıklara dayanarak hücre tiplerini belirlemek için ya yapay olarak indüklenen floresans ile ya da makine öğrenimi algoritması eğitimi yoluyla sınıflandırılmıştır. Floresans ve morfoloji tabanlı metodolojiler arasında yüksek bir uyum bulunmaktadır.

İki sınıflandırma yöntemi aynı görüntülere bağımsız olarak uygulanmış olup, işlem görmemiş ve işlem görmüş popülasyonlarda sırasıyla %97,4 ve %92,5 oranında uyum göstermiştir. Burada, hücre morfolojisindeki değişiklikler ve Erlotinib tedavisine verilen yanıt araştırılmıştır. Üç günlük ilaç tedavisinin ardından, H3255 hücrelerinde çekirdek alanında azalma ve hücresel alanda artış gözlemlenmiştir.

Bu durum muhtemelen hücre ölümünden kaynaklanmaktaydı. Erlotinib'in hücreler üzerinde sitotoksik mi yoksa sitostatik bir etkiye mi sahip olduğunu test etmek için, propidyum iyodür boyamasına dayanarak ölü hücreler belirlendi. H3255 hücreleri üzerinde Erlotinib'in hem sitotoksik hem de sitostatik etkileri gözlemlendi; ilaç uygulamasını takiben ölüm sayısında artış ve doğum sayısında azalma saptandı.

Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığı takdirde birbirini takip etmeyen iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, fonksiyonel genomik üzerine ek soruları yanıtlamak amacıyla RA interferansı veya CRISPR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların birçok kanser türünde stromal hücrelerin tümör progresyonu üzerindeki etkilerini incelemelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, çevresel uyarılara karşı heteroselüler yanıtların nasıl çalışılacağını, özellikle de mikroskopi tabanlı görüntüleme verilerinin yüksek kapasiteli bir şekilde nasıl analiz edileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.