Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu
June 30th, 2017
Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.
Bu metodolojinin genel amacı, alt popülasyonlar arasında ayrım yaparken heteroselüler popülasyonların pertübasyonlara dinamik fenotipik tepkilerini nicel olarak değerlendirmektir. Fizyolojik etkileşimlerin çoğu, birden fazla hücre tipinin varlığında gerçekleşir. Bu yöntem, hücre biyologlarının heterojen hücrelerin aynı çevresel baskılara nasıl tepki verdiğini ve farklı olanların birbirini nasıl etkilediğini değerlendirmesine yardımcı olabilir.
Bu tekniğin çeşitli avantajları vardır, birden fazla hücre tipi arasında ayrım yapar, doğum ve ölüm oranları ve morfolojik dinamikler dahil olmak üzere alt popülasyonlar üzerinde eşzamanlı analize izin verir. Bu protokol birçok biyolojik süreci incelemek için kullanılabilirken, H3255 tümör hücrelerini ve kemoterapötik bir ilaç olan Erlotinib ile tedavi edilen CCD19LU fibroblast hücrelerini kullanarak iş akışını göstereceğiz. Başlamak için, metin protokolüne göre tüplerde hücre süspansiyonları hazırladıktan sonra, tohumlamayı standartlaştırmak için hücreleri çözelti içinde karıştırmak için tüpleri ters çevirin.
Daha sonra her hücre süspansiyonundan 10 mikrolitreyi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 mikrolitre tripan mavisi ekleyin. Çözeltinin 10 mikrolitresini bir hücre sayma slaytına pipetleyin ve slaytı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin. Hücre sayımını en az üç kez veya elde edilen sayımlar tutarlı olana kadar tekrarlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında 100 mikrolitre RPMI'de toplam 1.500 hücre tohumlayın. Her hücre süspansiyonunu, her zaman noktası için aynı plaka kurulumları ile üç kopya halinde plakalayın. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
10 milimolar Erlotinib stok çözeltisi yapmak için Erlotinib tozuna DMSO ekleyin. Daha sonra, ilacı 10 mikromolar olan en yüksek nihai konsantrasyonun iki katına seyreltmek için hücre kültürü ortamını kullanın. İlacı 1: 10 oranında dört kez seri olarak seyreltin, toplam beş ilaç konsantrasyonu ve ilaç kontrolü yok.
100 mikrolitre ilaç çözeltisini, ortamda seyreltilmiş 1x'lik bir nihai ilaç konsantrasyonu için 96 oyuklu hücre plakasının uygun kuyucuklarına pipetleyin. Daha sonra, floresan bazlı sınıflandırma için hücreleri boyamak için, PBS'de mililitre nükleer leke başına beş mikrogram ve beş mikromolar ölü hücre boyası hazırlayın. Morfolojiye dayalı sınıflandırma için, PBS'de mililitre nükleer leke başına beş mikrogram, beş mikromolar ölü hücre boyası ve beş mikromolar hücre boyası hazırlayın.
Her oyuğa 20 mikrolitre boya çözeltisi ekleyin. Ardından, numuneleri 30 dakika boyunca ışıktan korunarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Görüntü elde etmek için, plakanın altını silmek için %70 etanol kullanın ve plakayı görüntüleme odasına yerleştirin.
Kanal seçimi altındaki kurulum sekmesinde, görüntüye uygun kanalları eklemek için artı düğmesine tıklayın. Düzen seçimi altında, odak düzlemini tanımlamak için her iki mikronda bir, sıfır mikrondan başlayıp 20 mikronla biten bir z test görüntüsü yığını ayarlayın. Yoğunlukları değerlendirmek ve pozlama sürelerini optimize etmek için her kanalın altındaki anlık görüntüye tıklayın.
Zaman alanına gerektiği gibi daha yüksek veya daha düşük değerler girin. Aşağı akış analizinin doğruluğunu sağlamak için hücrelerdeki çekirdekler odakta olmalıdır. Plaka şemasında uygun kuyuları vurgulayın.
Ardından kuyu şemasında, benzer şekilde görüntülenecek 25 alanı vurgulayın. Deneyi çalıştır altında, plaka adında plakayı tanımlayın, ardından, seçilen kanallarda gri tonlamalı TIFF görüntüleri oluşturmak için 10x hedefli görüntü elde etme protokolünü çalıştırmak için başlat düğmesine tıklayın. Açık kaynaklı yazılımları, CellProfiler ve CellProfiler analizini yükledikten sonra, CellProfiler'ı açın, Dosya, İçe Aktar, Dosyadan Boru Hattı'na tıklayın ve uygun dosyayı seçin.
Hücreleri EGFP yoğunluğuna göre H3255 veya CCD19LU olarak sınıflandırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için floresan tabanlı sınıflandırma hattını seçin. Çıktı ayarlarını görüntüle'ye tıklayın, ardından analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve çıkarılan verilerin hedefini seçin. Analizi çalıştırmadan önce, parametre değerlerini kontrol etmek için protokol test modunda test edilmelidir.
Nükleer ve hücresel segmentasyonun doğru olması önemlidir. Bu protokol, değişen çekirdek lekesine sahip hücreleri tanımlamak, çekirdeklerin genişlediği piksel değerinin, en yüksek DNA lekesine sahip çekirdekleri maskeleyecek kadar büyük, ancak çevredeki çekirdekleri maskelemeyecek kadar küçük olmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Popülasyonları floresansa göre sınıflandırmak için önce GFP yoğunluk aralığını yeniden ölçeklendirin, ardından tanımlanan her çekirdeğin GFP yoğunluğunu ölçün ve nesneleri kullanıcı tanımlı bir eşiğe göre sınıflandırın.
Ardından, analize başlamak için görüntüleri analiz et'e tıklayın. Analiz tamamlandığında, hesaplanan verileri görüntülemek için varsayılan çıktı klasörüne gidin. Morfoloji tabanlı sınıflandırma için, tüm hücre morfolojisi özelliklerini oluşturmak için hücre profilleyicide uygun protokolü çalıştırın.
Cell Profiler Analysis yazılımını açın, Cell Profiler'da oluşturulan veritabanı özellikleri dosyasını seçin ve açın. Ekranın sol üst kısmındaki Sınıflandırıcı sekmesine tıklayın. Denemeden rastgele hücre görüntülerini çağırmak için getir'i tıklayın, görüntüler sınıflandırılmamış pencerede görünecektir.
Hücreleri manuel olarak pozitif veya negatif olarak sınıflandırın, bu burada hücreleri seçip uygun bölmeye sürükleyerek H3255 veya CCD19LU temsil eder. Alt popülasyon başına en az 50 hücreyi sınıflandırdıktan sonra, Sınıflandırıcıyı Eğit'e tıklayın ve ardından İlerlemeyi Kontrol Et'e tıklayın. Son olarak, her alt popülasyon için hücre sayılarını içeren bir tablo oluşturmak için Tümünü Puanla'yı tıklayın.
H3255 tümörü ve CCD19LU fibroblast hücrelerinin heterosellüler soğuk kültüründe, çekirdekler DNA boyamaya dayalı olarak tanımlandı ve segmentlere ayrıldı. Hücre popülasyonları, morfoloji farklılıklarına dayalı hücre tiplerini tanımlamak için yapay olarak indüklenen floresan veya makine öğrenimi algoritmasında eğitim ile sınıflandırıldı. Floresan ve morfoloji temelli metodolojiler arasında yüksek bir uyum vardır.
İki sınıflandırma yöntemi aynı görüntülere bağımsız olarak ima edildi ve tedavi edilmemiş ve tedavi edilen popülasyonlarda sırasıyla% 97.4 ve% 92.5 üzerinde anlaştı. Burada hücre morfolojisindeki değişiklikler ve Erlotinib tedavisine yanıt araştırıldı. Üç günlük ilaç tedavisinden sonra, H3255 hücrelerinden çekirdek alanında bir azalma ve bir hücresel alanda bir artış gözlendi.
Bu muhtemelen hücre ölümünden kaynaklanıyordu. Erlotinib'in hücreler üzerinde sitotoksik veya sitostatik bir etkiye sahip olup olmadığını test etmek için, propidyum iyodür boyamasına dayalı olarak ölü hücreler tanımlandı. Erlotinib'in H3255 hücreleri üzerindeki hem sitotoksik hem de sitostatik etkileri, ilaç tedavisini takiben ölüm sayısında artış ve doğum sayısında azalma ile gözlenmiştir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa ardışık olmayan iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, fonksiyonel genomiği araştıran ek soruları ele almak için RA interferansı veya CRISPR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, stromal hücrelerin birden fazla kanser türünde tümör ilerlemesi üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, çevresel uyaranlara karşı heteroselüler tepkilerin nasıl çalışılacağını, özellikle mikroskopi tabanlı görüntüleme verilerinin yüksek verimli bir şekilde nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu çalışma, bozulmalara karşı heterosellüler popülasyon dinamiklerini araştırmak için yeni bir protokol sunar. Metodoloji, birden fazla hücresel fenotipin karakterizasyonu için nicel veri setleri oluşturmak üzere görüntüleme tabanlı bir platform kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
- Popülasyon Dinamikleri
Arka Plan
- Fizyolojik etkileşimler genellikle birden fazla hücre tipi arasında meydana gelir.
- Çeşitli hücrelerin çevresel baskılara nasıl yanıt verdiğini anlamak kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, farklı hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesine olanak tanır.
- Çeşitli biyolojik süreçlere uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Heterosellüler popülasyonların dinamik fenotipik yanıtlarını nicel olarak değerlendirmek.
- Özdeş koşullar altında alt popülasyonları ayırt etmek.
- Belirli hücre tipleri ve tedaviler kullanarak iş akışını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre süspansiyonlarının hazırlanması ve ekim standardizasyonu.
- Hücre sayımı ve otomatik analiz için tripan mavisi kullanımı.
- Sınıflandırma için Erlotinib ile ilaç tedavisi ve floresan boyama.
- CellProfiler yazılımı kullanılarak görüntü elde edilmesi ve analizi.
Ana Sonuçlar
- Floresan ve morfoloji tabanlı metodolojiler arasında yüksek uyumluluk.
- İşlenmemiş ve işlenmiş popülasyonlar için sırasıyla %97.4 ve %92.5 sınıflandırma doğruluğu.
- Boyama temelinde hücre çekirdeklerinin başarılı bir şekilde tanımlanması ve segmentasyonu.
Sonuçlar
- Protokol, birden fazla hücre tipini etkili bir şekilde ayırt eder.
- Doğum ve ölüm oranları dahil olmak üzere alt popülasyonların eşzamanlı analizini sağlar.
- Bu metodoloji çeşitli biyolojik çalışmalar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively dissect heterogeneous cell population responses to drug perturbations, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology and stromal-tumor interaction studies. By distinguishing subpopulations via fluorescence or morphology, it provides predictive confidence in compound effects on specific cellular compartments, informing go/no-go decisions in early discovery. The approach reduces assay variability and reagent consumption while increasing throughput for phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying subpopulation-specific responses to perturbations.
- Operational Value: Discriminates between cell types using fluorescence intensity or morphology, clarifying pathway contributions in co-culture systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential drug effects on tumor versus stromal compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts including morphology changes, proliferation, and apoptosis for each subpopulation.
- Operational Value: Standardizes seeding and staining protocols to ensure reproducibility across wells and time points.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and automated imaging for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase phenotypic responses to preclinical validation by tracking birth/death rates and morphological dynamics.
- Mechanistic De-risking: Isolates stromal influence on tumor progression, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-based morphology shifts with functional outcomes for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing subpopulation-resolved data that informs mechanistic understanding and compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how heterogeneous cells respond to identical environmental pressures and influence one another.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell counting, drug dilution, and staining protocols that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Outputs segmentation, classification, and feature extraction data (nuclei area, cellular area, death rates) that allow teams to compare conditions quantitatively.
- Translational Research: Connects early phenotypic responses to stromal-tumor interactions, informing preclinical models of cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable to diverse co-culture systems and perturbation types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through deconvolution of mixed population responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced reagent use versus traditional assays.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by revealing cytotoxic/cytostatic effects on specific subpopulations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on differential effects in tumor and stromal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and CellProfiler pipeline configuration.
- Dependent on automated imaging hardware capable of z-stack acquisition and multi-channel fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and classification thresholds for fluorescence or morphology-based methods.
- Adaptation to new model systems may require optimization of nuclear/cellular segmentation parameters and classifier training.
- Practical limitations include challenges in identifying populations with complex morphological features, necessitating troubleshooting as noted in the protocol.
