Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

Bu protokolün genel amacı, birden fazla kılavuz RNA'yı tek bir CRISPR-birleştirici vektöre klonlamak ve birden fazla genin aynı anda nakavt edilmesini sağlamak için fare bağırsak organoidlerinde yüksek verimli elektroporasyon elde etmektir. Bu yöntem, paralel kompanzasyonun potansiyel etkisinin üstesinden gelmeyi mümkün kılarak işlev kaybı etütlerinin verimliliğini büyük ölçüde artırabilir. CRISPR birleştirici stratejimizin ana avantajı, tek bir klonlama adımının rahatlığı ve dört farklı genin aynı anda nakavt edilmesini gerçekleştirme olasılığıdır.

Prosedürün gösterilmesi, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Alessandra Merenda tarafından yapılacaktır. Kılavuz RNA'ların veya gRNA'ların CRISPR-birleştirici vektörüne klonlanması, her bir gRNA oligonükleotidi için üst ve alt iplikleri tavlamak ve uçlarını fosforile etmek için tek bir reaksiyonla başlar. Reaksiyon karışımını buz üzerinde hazırlayın, üç birleştirici için, üç mikrolitre üst iplikli gRNA, üç mikrolitre alt iplikli gRNA, iki mikrolitre T4 DNA ligaz tamponu, bir mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ve toplam 20 mikrolitre hacme kadar su kullanın.

Aşağıdaki ayarları kullanarak termocycler'ı pipetleyerek ve çalıştırarak iyice karıştırın, 30 dakika boyunca 37 santigrat derece, beş dakika boyunca 95 santigrat derece, dakikada 0,3 santigrat derecede 25 santigrat dereceye kadar rampa ve dört santigrat derecede tutun. Bir sonraki adım, önceden tavlanmış gRNA oligonükleotidlerinin birleştirici vektörün uygun konumuna dahil edildiği Bbs1 karıştırma reaksiyonudur. Üç ve dört gRNA birleştirici vektörü oluşturmak için reaksiyon karışımını DNA, RNA içermeyen suda bir ila 100 oranında seyreltin.

Bbs1 karıştırma reaksiyonlarını buz üzerinde birleştirin. 100 nanogram CRISPR-birleştirici vektör, 10 mikrolitre oligo karışımı, bir mikrolitre kısıtlama enzimi tamponu, bir mikrolitre DTT, bir mikrolitre ATP, bir mikrolitre Bbs1 enzimi, bir mikrolitre T7 ligaz ve toplam 20 mikrolitre hacme kadar su kullanın. Pipetleme ile iyice karıştırın, vektörü içeren negatif bir kontrol ekleyin.

Üç ve dört gRNA birleştiricisini klonlamak için aşağıdaki ayarları kullanarak reaksiyonları bir termocycler'da çalıştırın, beş dakika boyunca 37 santigrat derecede ve beş dakika boyunca 21 santigrat derecede 50 döngü çalıştırın, 37 santigrat derecede 15 dakika tutun ve ardından süresiz olarak dört santigrat derecede tutun. İki gRNA birleştirici için, aynı ayarları 25 döngü birinci adımla çalıştırın. Bbs1 karıştırma reaksiyonu tamamlandığında, her ligasyon karışımından 11 mikrolitre alın ve toplam 15 mikrolitre hacme 1.5 mikrolitre eksonükleaz tamponu, 1.5 mikrolitre ATP, bir mikrolitre DNA eksonükleaz ve su ekleyin.

37 santigrat derecede 30 dakika, ardından 70 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, reaksiyon karışımı, standart bir protokolü izleyerek kimyasal olarak yetkin E.Coli bakterilerini dönüştürmek için kullanılır. CRISPR birleştirici vektöründe gRNA eklerinin varlığını doğrulamak için, bir aşılama halkası ile bakteri kolonilerini seçin ve her birini dört mililitre LB ortamında aşılayın.

Klonları bir orbital çalkalayıcıda gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre bir plazmid mini hazırlık kiti kullanılarak DNA ekstrakte edilir. Her DNA örneğinin yaklaşık 200 nanogramını 10 mikrolitrelik bir reaksiyonda 10 birim EcoR1 ve beş birim BglII ile karıştırın.

Boyut karşılaştırması için pozitif bir kontrol olarak karşılık gelen orijinal vektörle ayrı bir reaksiyon karışımı ekleyin. Reaksiyonları üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sindirim reaksiyonlarını yaklaşık 20 dakika boyunca 90 voltta% 1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın.

Doğru kesici uç boyutuna sahip klonları tanımlamak için bir UV transilluminatörü kullanarak jeli görselleştirin. gRNA'ların doğru konuma klonlandığını ve sonuç olarak tüm Bbs1 tanıma bölgelerinin kaybolduğunu doğrulamak için, seçilen klonları beş birim Bbs1 ile sindirin. Kontrol olarak karşılık gelen orijinal vektörle birlikte ayrı bir reaksiyon karışımı ekleyin.

37 santigrat derecede üç saat inkübe edin, sindirim reaksiyonlarını yaklaşık 20 dakika boyunca 90 voltta% 1 agaroz jel üzerinde çalıştırın. Bbs1 tarafından kesilmeyen vektörleri tanımlamak için bir UV transilaydınlatıcı kullanarak jeli görselleştirin. Elektroporasyon için organoidleri ayırırken, transveksiyon başına 48 oyuklu bir plakadan en az altı kuyu tohumlayın.

Organoidleri 20 mikrolitrelik bodrum matris damlalarına tohumlayın ve nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte oyuk başına 250 mikrolitre WENR artı nikotinamid ortamında büyütün. İkinci günde, WENR artı nikotinamid ortamını antibiyotiksiz 250 mikrolitre EGF artı noggin, GSK3 inhibitörü ve kaya inhibitörü ortamı ile değiştirin. Üçüncü günde, organoid ortamı EGF artı noggin, GSK3 inhibitörü, kaya inhibitörü ve% 1.25 dimetil sülfoksit antibiyotik olmadan değiştirin.

Dördüncü günde, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak bodrum matris kubbelerini bozun ve organoidleri 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 48 oyuklu bir plakanın dört kuyusunun içeriğini bir tüpe çekin. P200 pipeti ile yaklaşık 200 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri mekanik olarak küçük parçalara ayırın.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, ortamı tüm tüplerden çıkarın ve paletleri bir mililitre hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz içinde yeniden askıya alın. 37 santigrat derecede en fazla beş dakika inkübe edin.

Proteaz tedavisinin dikkatli bir şekilde izlenmesi önemlidir, çünkü elektroporasyonun başarısı, tek hücreler yerine hücre kümeleri içeren bir hücre süspansiyonu elde edilmesine bağlıdır. 50 mikrolitrelik bir numune damlasını, dört kez objektif olan ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında kontrol edin. 10 ila 15 hücreli kümeler arzu edilir, çünkü bu, elektroporasyondan sonra hücre sağkalımını arttırır.

Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve antibiyotiksiz dokuz mililitre bazal ortam ekleyerek ayrışmayı kontrol edin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve paleti bir mililitre azaltılmış serum ortamında yeniden askıya alın.

Burkes hazneli hücre sayısını sayın, elektroporasyon reaksiyonu başına en az bir kez 10 ila beşinci hücre gerekir. Bu prosedüre, hücre süspansiyonunu içeren 15 mililitrelik tüpe dokuz mililitre indirgenmiş serum ortamı ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Tüm süpernatanı çıkarın ve paleti bir elektroporasyon solüsyonunda yeniden askıya alın.

İki yeni tüpe toplam 10 mikrogram DNA ekleyin. Daha sonra, 100 mikrolitrelik son hacme elektroporasyon solüsyonu ekleyin ve hücre DNA karışımını buz üzerinde tutun. Hücre DNA karışımını elektroporasyon küvetine aktarın, küveti elektroporatör odasına yerleştirin.

Elektroporatör üzerindeki uygun düğmeye basarak empedansı ölçün ve 0,030 ila 0,055 ohm olduğundan emin olun. Metin protokolünde belirtilen ayarlara göre elektroporasyon gerçekleştirin. Küvete 400 mikrolitre elektroporasyon tamponu artı kaya inhibitörü ekleyin ve ardından tüm içeriğini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücrelerin iyileşmesini sağlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 400 kez G'de döndürün. Süpernatanı çıkarın ve paleti bodrum matrisinin kuyusu başına 20 mikrolitre olarak yeniden askıya alın.

48 oyuklu bir plakada oyuk başına yaklaşık bir kez 10 ila dördüncü ila bir kez 10 ila beşinci hücreye tohumlayın ve EGF artı noggin, GSK3 inhibitörü, kaya inhibitörü ve% 1.25 dimetil sülfoksit ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı EGF artı noggin, GSK3 inhibitörü ve kaya inhibitörü olarak değiştirin ve GFP ekspresyonunu gözlemleyerek transveksiyon verimliliğini kontrol edin.

Organoidleri 37 santigrat derecede tutun. İki gün sonra, ortamı taze ortamla değiştirin. Elektroporasyondan dört gün sonra, ortamı WENR artı nikotinamid ve kaya inhibitörü ortamı olarak değiştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin.

Birleştirici vektörde doğru sayıda gRNA ekinin varlığı, EcoR1 ve BglII ile çift kısıtlama sindirimi ile doğrulanır. Alt bandın beklenen boyutu, dört gRNA birleştirici vektör için yaklaşık 1.6 kilobaz ve üç gRNA birleştirici vektör için 1.2 kilobazdır. Ek olarak, Bbs1 ile sindirim, gRNA'ların doğru pozisyona klonlandığını ve sonuç olarak tüm Bbs1 tanıma bölgelerinin kaybolduğunu doğrular.

Onaylanan yapılar, GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi% 70'e varan transveksiyon verimliliği elde etmek için elektroporasyon yoluyla fare bağırsak organoidlerine iletilir. Bu videoyu izledikten sonra, aynı anda birden fazla genin nakavtını elde etmek için gRNA birleştirici vektörlerinin nasıl oluşturulacağını ve bunları elektroporasyon kullanarak 3D organoid kültürlere nasıl verimli bir şekilde ileteceğinizi iyi anlamış olmalısınız.