Name: Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin fare bağırsak organoidlerinin manyetik nanopartikül destekli viral vektörlerle genetik mühendisliğini ve dondurulmuş kesit hazırlama yöntemini. Bu teknik düşük sitotoksisite ile yüksek verimli transdüksiyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık Ulusal Enstitüsü (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland kök hücre araştırma fonu (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Amerikan Akciğer Derneği, Allegheny Sağlık Ağı-Johns tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Hopkins Araştırma Fonu ve Hopkins sindirim hastalıkları temel araştırma çekirdek merkezi.

Bu protokol Johns Hopkins Tıp Kurumları hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıTUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol daha önce yayımlanan yöntemlerden10,11,12,13değiştirilir.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Yeni 293T orta birkaç saat önceden hazırlayın ve sıcak için 37 ° c bir su banyosunda en az 10 dakika önce kullanmadan (Tablo 1).</li>
	<li>Viral paketleme için Plasmid DNA2,13,14 hazırlayın. (Tablo 2).</li>
	<li>Diğer tüm gerekli materyalleri (malzeme tablosu) edinin.</li>
</ol>2. Lentivirus veya retrovirus parçacık üretimi
<ol><li>İnsan embriyo böbreği (HEK) 293T hücre tohumlama (1. gün)
	<ol>
<li>1 150 mm Kültür tabağı ile kaplama ile hazırlamak 50 μg/mL Poly-D-lizin fosfat tamponlu tuz içinde çözülmüş (PBS; 10 mL/yemek) Oda sıcaklığında 1 saat (RT).</li>
		<li>Fosfat tamponlu tuz (PBS)/Poly-d-lizine çıkarın ve kaplanmış tabağı 5 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>(Tablo 1) 293t Orta (8 \ u201210 x 106) tohum 293t hücreleri 15 ml toplam hacmine.</li>
		<li>Kültür 293T hücreler bir gecede standart doku kültürü kuluçta (37 °C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>HEK 293T hücre transfeksiyon (2. gün)
	<ol>
<li>Hücreleri% 70-80 konfluence ulaştığında transfeksiyon gerçekleştirin (genellikle yaklaşık 24 saat tohumlama sonra 8 \ u201210 x 106 hücreler).</li>
		<li>Transfeksiyon karışımı, ticari katyonik lipozom formülasyonu gibi verimli bir yaklaşım kullanarak hazırlayın (Tablolar 1 \ u20122, malzeme tablosu)2.<ol>
<li>Seyreltme Lentivirus DNA oluşturur12 (Toplam ~ 24 μg PLAZMID DNA, Tablo 2) içinde 1,2 ml transfeksiyon orta ve inkük 5 dk RT 1,5 ml tüpler (malzeme tablosu).</li>
			<li>Transfeksiyon Orta (malzeme tablosu) 1,2 ml 'de (36 μL) dilüt transfeksiyon Regent ve üreticinin talimatlarına göre 5 dk Için 5 ml tüplerde inkübe.</li>
			<li>Lentivirus reaktif (adım 2.2.2.1) transfeksiyon reaktif (adım 2.2.2.2) ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı 5 mL pipet kullanarak yavaş pipetleme ile karıştırın.</li>
			<li>Karışımı RT 'de 20 dakika boyunca inkübe etme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>5 mL transfeksiyon orta ile 293T hücreleri yavaşça yıkayın ve 10 mL transfeksiyon orta ile değiştirin.</li>
		<li>DNA-lipid kompleksleri (adım 2.2.2.3) 293T hücrelerin orta dropwise ekleyin ve dikkatle her çanak DNA-lipid kompleksleri eşit dağılımı sağlamak için yatay ve dikey yönde hareket ederek kültür yemeklerinde medya karıştırın.</li>
		<li>Standart doku kültürü kuluçta 6 h için inkübe (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Kuluçdan sonra, 20 mL taze virüs toplama Orta (Tablo 1) ile medyayı değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Virüs toplama (gün 3 \ u20125)
	<ol>
<li>50 mL tüplerde virüs ortamını toplayın ve daha fazla konsantrasyon için 4 °C ' lik buzdolabında saklayın.</li>
		<li>20 mL taze virüs toplama orta her 24 saat ve kültür gecede (~ 24 saat) değiştirin. Sonraki 2 gün (gün 4 \ u20125) üzerinden medya koleksiyonunu yineleyin.</li>
		<li>5 gün sonra toplanan orta toplam hacminin ~ 60 mL (20 mL/gün x 3 gün) olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Virüs konsantrasyonu (5. gün)
	<ol>
<li>Toplanan medyayı (60 mL) 400 x g 'de 5 dakika santrifüjün. Daha sonra, herhangi bir hücresel enkaz kaldırmak için bir filtre (0,45 μm gözenekler) üzerinden süpernatant geçirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Santrifüj filtre ünitesinde (malzeme tablosu) 15 mL filtrelenmiş virüs ortamı ekleyerek virüslere konsantre olun. 2.500 x g 'de 4 °c ' de 15 dakika Santrifüjü. Virüs bu filtreden geçemez çünkü, filtre üst odasında konsantre edilecektir.
	<ol>
<li>Tüp (alt oda) gelen akışı aspirate ve aynı santrifüj filtre ünitesine kalan viral toplama medya süpernatant başka 15 ml ekleyin. Yukarıdaki santrifüjün (2.500 x g Için 4 °c ' de 15 dk) supernatant 'tan ek virüsü konsantre etmek.</li>
		<li>İstenen konsantrasyon (~ 100-kat) ulaşılana kadar tek bir transed plakadan 60 mL medya için aynı filtreyi kullanarak işlemi tekrarlayın. Not: Biz genellikle ~ 600 μL için virüs toplama ortamı ~ 60 mL konsantre.</li>
		<li>1 ml pipet kullanarak filtre üst odasından konsantre virüs çıkarın, sonra kısım ve 1,5 ml tüpler (50 \ u201260 μL/tüp) at-80 °c daha sonra kullanmak için saklayın. 6 \ u201212 ay kadar konsantre parçacıklar saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. izolasyon Crypts
<ol><li>Yerel ıAŞUC yönergelerine göre CO2 kullanarak ötenize fareler.</li>
	<li>Geri ötenize hayvan yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürterek karın yıkayın.</li>
	<li>Sternum 'dan kasık 'ye kadar uzunlamasına orta çizgi kesi gerçekleştirin, önce deriyi ve ardından subkutan dokusunu yakın.</li>
	<li>İnce bağırsak karnından çekum çıkarın.</li>
	<li>İnce bağırsak içindeki ilgi bölgelerini tanımlayın; kript duodenum, jejunum ve ileum izole edilebilir.</li>
	<li>10 ml 'lik bir şırınga kullanarak, 10 cm 'lik doku kültürü yeminde (1 mm ditiyotreitol (DTT), 1% penisilin/streptomisin (No CA2 + ve mg2 +) içeren ön soğutulmuş PBS) ile izole ince bağırsak (masa 1)</li>
	<li>Periferik yağ dokusu çıkarın ve açık veya steril bir cam plaka (15 cm x 15 cm) üzerinde uzunlamasına bağırsak dokusu "radyus".</li>
	<li>Bir hücre sıyırıcı kullanarak bağırsak epitelyal Villi yavaşça kazıyın.</li>
	<li>2 \ u20123 cm uzunluğunda-Wise bölümler içine ince bağırsak kes.</li>
	<li>Dokuyu, düz forseps (116 mm) kullanarak önceden soğutulmuş PBS içeren 15 ml 'lik bir tüpe aktarın. ~ 30 s (ters yönde tüp hareketli ~ 60 kez) için şiddetle elle sallayarak doku parçalarını yıkayın.</li>
	<li>PBS 'i yenileyin ve PBS temizlenene kadar tekrar yıkayın. Not: Biz genellikle 2 \ u20123 kez parçaları yıkayın.</li>
	<li>PBS açık olduğunda orta hızda orbital Shaker üzerinde 4 °c ' de 10 dk için 10 ml Crypt ayrışma Buffer (Tablo 1) içeren 15 ml konik tüpte dokuyu inkübasyon yapın.</li>
	<li>Şiddetle ~ 30 s (tersi yönde ≈ 60 kez) için elle tüp sallayın ve başka bir 15 ml konik tüp içeren düz forseps kullanarak doku aktarmak 10 crypt ayrışma tampon ml. Bu fraksiyonu buzun üzerine ininin. Öncelikle Villi içerdiğinden nevuslardır kültürü için ilk kesir kullanmayın.</li>
	<li>Her kesir toplama ve buz üzerine yerleştirerek, 3 \ u20124 kez için 3.11 \ u 20123.13 adımları yineleyin.</li>
	<li>Tersine çevrilmiş bir mikroskop (4X) altında her bir fraksiyondan 200 μL numuneleri tarayarak, en yüksek intestinal kript yüzdesi ile zenginleştirilen kesir seçin. Daha önce açıklandığı gibi tipik morfoloji tarafından kript tanımlamak (Şekil 1a)10. Not: Onlar yuvarlak veya oval şeklinde görünür ve granüle Paneth hücreleri içerir. Buna karşın Villi, granül Paneth hücrelerinin bulunmayan parmak benzeri yapılardır (Şekil 1B).</li>
	<li>Gerekirse, benzer boyutta kript almak için bir 40 μm hücre süzgeci aracılığıyla seçilen kesir geçirin. Alternatif olarak, Lgr5 + kök hücreleri yeşil floresan protein (GFP) için Akış sitometrisi dayalı izole Eğer fareler EGFP-Lgr5 + arka plan veya Lgr5 + hücreler2tanımlaması sağlayan başka bir uygun model üzerine geçti.</li>
	<li>Seçili kesir içindeki toplam kript sayısını aşağıdaki gibi say.
	<ol>
<li>Pipet 50, seçilen fraksiyonunun μL değerini bir hemokytometreye çevirir ve ters ışık mikroskobu (4X) kullanarak kriptolar sayısını sayar. Yer ~ 100 kripts iyi bir 48-iyi plaka kullanarak hangi 3 \ u20126 kuyuları gen susturma veya overexpression için deneysel koşul başına transilme olacak dönüştürücü deneyler için izin vermek.</li>
		<li>50 μL başına kript sayısına göre, gerekli Crypt ayrışma tampon hacmi hesaplamak ve bir 1,5 ml tüp içine bu hacmi aktarmak. Not: Örneğin, 50 μL başına 10 kript sayılır, 300 kript için 6 x 50 μL veya 300 μL gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>1,5 mL 'Lik tüplerde 5 dakika boyunca 300 x g 'de şifreli santrifüj yapın.</li>
	<li>Üst sıvı katmanını hafifçe pipetleme ve 100 μL 'de Pelet artışını, buz üzerindeki Bodrum membran matrisini (malzeme tablosu) küçültülür.</li>
	<li>Matris içeren kript 'ı 37 °c ön ısıtılmış 48-kuyu plakasına (30 μL/Well, ~ 100 kript/Well) yerleştirin. Matris jelleşme (37 °c, 5% Co2) için izin vermek için 5 \ u201215 dakika için standart bir doku kültürü kuluçta plaka inkübe.</li>
	<li>Her bir Jeli 250 μL nevuslardır kültürü (ENR) Orta (Tablo 1) ile yerleştirin ve 48-kuyu plakalarını standart doku kültürü kuluçta (37 °c,% 5 Co2) içine yerleştirin. 24 saat sonra küçük, yuvarlak, kistik şekiller içine Crypt organizasyon için kültürler kontrol edin; tomurcuklar 2 \ u20125 gün sonra oluşturacaktır.</li>
	<li>ENR medyasını her 3 günde bir hafifçe değiştirin. Eski ENR medyasını nazik emiş ile çıkarın, medyayı değiştirirken matrise dokunmayın.</li>
	<li>Passage nevuslardır kültürler her 4 \ u20127 gün daha önce açıklandığı gibi11.</li>
</ol>4. organoid parça hazırlama
<ol><li>Bir kez (1 \ u20122 hafta içinde) veya pasaj olduktan sonra formu transduce organoids. Tek bir dönüştürücü deney için, hazırlamak 2 \ u20123 kuyuları kültürlü organoids bir 48-iyi plaka ile koşul başına ~ 100 \ u2012200 organoids/iyi veya ~ 200 \ u2012600 organoids deneysel dönüştürücü durumu başına.</li>
	<li>250 μL dönüştürücü medyası (Tablo 1) ve 3 veya daha fazla gün veya organoids bir kistik morfoloji benimsemeye kadar dönüştürücü medyada kültür ile Exchange ENR. Kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırmak için dönüştürücü ortamda Wnt3a ve ROCK inhibitörü (Y27632) hem de dahil; Nikotinamid (Nic) kültür verimliliğini geliştirir ( Tablo 1' de dönüştürücü ortamına bakın).</li>
	<li>1 mL 'Lik pipet kullanarak kubbe benzeri Bodrum membran matris yapısını medya ve pipet ucu ile mekanik olarak yırtılması.</li>
	<li>Orgoidleri ve medyayı steril 1,5 mL tüpüne aktarın.</li>
	<li>200 μL pipet ~ 10 \ u201215 kez pipetleme ile matrisi mekanik olarak daha da bozar.</li>
	<li>500 x g 'de 5 dakika boyunca RT 'de nevuslardır parçaları Santrifüjü.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak dikkatle süpernatant atın ve 1 ml dmem/F12 Orta (Tablo 1) Pelet pelletini.</li>
	<li>Dispase ı (10 mg/mL 'de 6 μL) ve DNase ı (2,5 μL 'de 10 mg/mL) ekleyin. 1 mL pipet kullanarak yavaşça pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>1,5 mL 'Lik tüpte 20 dakika boyunca 37 °C ' de organoidleri kulküat.</li>
	<li>Ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için 500 μL ENR medyası ekleyin; ENR 'deki serum reaksiyonu sonlandırır.</li>
	<li>Orgoid hücrelerini 20 μm hücre süzgeci ile geçirin ve 400 x g 'de nevuslardır parçaları 5 dakika santrifüjler.</li>
	<li>150 μL dönüştürücü orta ile resuspend nevuslardır parçaları (Tablo 1).</li>
</ol>5. viral dönüştürücü tarafından Organoids veya Crypt hücrelerinin genetik mühendisliği
Not: Bkz. Şekil 2.
<ol><li>200 μL dönüştürücü orta/iyi bir 48-kuyu plakalı tohum nevuslardır hücre kümeleri ve standart doku kültürü kuluçta (37 °c, 5% Co2) inküpleme. Alternatif olarak, bir 48-Well plaka içinde 200 μL dönüştürücü orta/iyi taze izole Crypt hücreleri (~ 1.000 Crypts) yerleştirin ve standart bir doku kültürü kuluçta (37 °C, 5% CO2) inküpleme.</li>
	<li>48-kuyu plakaları ya da ~ 100 μL her iyi, 24-kuyu plakaları başına konsantre virüs ~ 50 μL konsantre virüs için izin dönüştürücü için virüs çözülme şişeleri çözmek.</li>
	<li>1,5 mL 'Lik bir tüpte (Tablo 3) RT 'de 15 dakika boyunca 12 μL manyetik nanopmakale çözeltisi ile virüs inküye yapın.</li>
	<li>Manyetik nanopartikül çözeltisi/virüs karışımını hücrelere dönüştürücülere ekleyin.</li>
	<li>Hücre kültürü plakasını manyetik bir plakaya yerleştirin ve standart doku kültürü kuluçta (37 °C, 5% CO2) en az 2 h (ve ~ 6 h 'ye kadar) için inküye yapın.</li>
</ol>6. enfekte organoid parçaları tohumlama
<ol><li>Virüslü nevuslardır hücre kümelerini ve dönüştürücü medyasını her iyi bir 1,5 ml tüpüne aktarın.</li>
	<li>500 x g 'de 5 dakika Santrifüjü</li>
	<li>Nazik emiş ile süpernatant atın ve 5 dakika buz üzerinde Pelet içeren tüp serin.</li>
	<li>120 μL Bodrum membran matrisi ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile Pelet pelletini.</li>
	<li>Yeni 48-Well plaka içine matris hücre karışımı tohum 30 μL damla.</li>
	<li>Matris katılaşıncaya kadar 5 \ u201215 dakika için 37 °C ' de plakayı kulbe eder.</li>
	<li>Her bir kuyu için dönüştürücü orta ekleyin ve 3 \ u20124 gün (37 °C, 5% CO2) için standart doku kültürü kuluçta inkübe.</li>
	<li>3 \ u20124 gün sonra, hücre kümeleri nevuslardır yapılara organizasyonu sağlamak için bir ışık mikroskop (10X) altında kültürler inceleyin. Ardından, dönüştürücü medyasını 250 μL ENR medyası ile hafifçe değiştirin.</li>
	<li>Her 3 \ u20124 gün medya değiştirin.</li>
</ol>7. seçim (varsa)
<ol><li>Sonra 2 \ u20123 gün, ilgili antibiyotik veya hormon seçim için dönüştürücü orta uygunsa ekleyin. Not: Plazmids bir puromisin direnci gen2,14harbored çünkü lentivrial dönüştürücü seçimi için puromisin (2 μg/ml) kullanılır.</li>
</ol>8. başarılı dönüştürücü ve gen Ifadesi veya susturma onayı
<ol><li>Fugw Lentivirus2,14kullanıyorsanız, floresan mikroskop veya akış cytometri aracılığıyla Gfp sinyalleri ölçerek transtion verimliliği tahmin.</li>
	<li>Kontrol ve deneysel nevuslardır kültürlerde mRNA 'nın nicel karşılaştırması için nicel ters transcriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanarak gen ekspresyonu veya susturmayı doğrula.</li>
	<li>Protein kodlama gen ifadesi veya Batı Blot veya immünostasyonu2tarafından susturulması için protein düzeylerini onaylayın.</li>
</ol>9. Bodrum membran matrisinde organoid Kriyobölüm
Not: Bkz. Şekil 3.
<ol><li>İnce emme ile ENR orta çıkarın, Bodrum membran matris Perturb dikkatli olmak ve yavaşça bir kez 500 μL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>1,0 ml 'lik 4% civarında formaldehite (PFA) çözeltisi (malzeme tablosu) ile 30 dakika boyunca RT 'de organoidleri düzeltin.</li>
	<li>PFA 'yı emiş ile çıkarın ve 1 mL PBS ile hafifçe iki kez yıkayın.</li>
	<li>PBS emme ile çıkarın ve her örneğe% 30 sakaroz tampon 1,0 ml ekleyin. Soğuk bir odada, buzdolabında veya buzda numuneleri susuz bırakmak için 1 saat 4 °C ' de sakaroz içinde sabit organoidleri inkük.</li>
	<li>Sükroz tamponunu emiş ile çıkarın ve her bir kuyunda matris katmanını (~ 300 μL/Well) kapsayacak kadar sadece yeterli gömme bileşiği (malzeme tablosu) ekleyin.</li>
	<li>RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Numuneleri a-80 °C ' ye 10 dakika boyunca veya gömme bileşik katı ve beyaz olana kadar yerleştirin.</li>
	<li>Kenarları boyunca bileşik en az erime için izin RT dondurulmuş gömme bileşik ile çanak yerleştirin. Kuyunun duvarlarından blok ayırmak için bir neşter kullanın.</li>
	<li>Matris katıştırma bileşik bloğunu forseps kullanarak çıkarın ve bir numune bloğuna yerleştirin (örn. cryomold), erime önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.</li>
	<li>Bileşiği gömme ile tamamen doldurun ve 30 dakika boyunca-80 °C ' de dondurunuz.</li>
	<li>Blok, daha fazla kullanım için-80 °C ' deki buzluğu kesme veya depolama için kullanılır.</li>
</ol>

<ol><li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li>
<li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li>
<li>Muñoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature%3A+robust+expression+of+proposed+quiescent+%27%2B4%27+cellmarkers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li>
<li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li>
<li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210(2013).</li>
</ol>

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Organoids olarak yetişkin intestinal epitelin primer kültürü, kök hücre fonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmalar, intestinal epitelyal homeostaz ve patoloji1,2,3, 4' ü yapın. CRISPR/Cas9 teknolojisi genetik mühendisliği organoids için kullanılabilir olsa da9, istenilen genetik değişiklikler için sıra analizi dayalı geniş tarama ve seçim için ihtiyaç ile sınırlıdır....

Kültür fare veya insan kript hücreleri üç boyutlu olarak (3D) küçük bağırsak veya kolon uzun süre boyunca organoids gibi hücreler büyük bir atılım sağladı çünkü bu kültürler intestinal epitelyum içinde vivo tanımlama özellikleri görüntüleme 1 , 2 , 3. organoids birincil kript türetilen kendi kendine yenileme ve kendi kendine organizasyon, cep fonksiyonları kökeni kendi dokularına benzer sergileyen yeteneğine sahiptir. Nitekim, organoids sadece kript in vivo yapısal organizasyonu değil, aynı zamanda birçok moleküler özellikleri, böylece normal biyoloji ve hastalık Devletler çalışmak için yararlı araçlar sağlayan reapitulate. Göstermek için, nevuslardır çalışmalar doku rejenerasyon dahil yeni moleküler yollar ortaya koydu1,2,3,4,5 yanı sıra fonksiyonu artırabilir ilaçlar patolojik ayarlar6,7.
İntestinal astar en son derece rejeneratif memeliler dokuları arasında olduğu için, her 3-5 gün içinde bakteri, toksinler ve diğer patojenlerden organizmayı korumak için kendini yenileyen bağırsak kök hücrelerinin çalışma özellikle ilgi bağırsak lümen. Bağırsak kök hücreleri (ISCs) bu olağanüstü rejeneratif yeteneği sorumludur ve böylece yetişkin kök hücre fonksiyonu1,2eğitim için benzersiz bir paradigma sağlar. Lineage-farelerde izleme denemeler izole Lgr5-pozitif kök hücreleri 3D organoids veya ' mini-cesareti ' in vitro oluşturmak için kültürlü olabilir gösterdi nerede yakından onların in vivo karşı ayna. Organoid kültürler Ayrıca progenitors oluşan bağırsak Crypt hücre yalıtımlarından elde edilebilir, ISCs, ve Paneth hücreleri, ikincisi epitel niş hücreleri oluşturmaktadır in vivo. Aslında, primer bağırsak Crypt hücrelerinden nevuslardır kültür yaygın olarak kullanılabilir reaktifler kullanarak çoğu laboratuvarlarda uygulanması kolay nispeten rutin bir teknik haline gelmiştir. Bu model aynı zamanda RNA sıralaması (RNA-seq) ve kütle spektrometresi, immünhistokimya veya immünofluorescent boyama2,4,8proteinleri tarafından Gen ifadesinin nicel analizine imkan tanır. Buna ek olarak, fonksiyonel genetik (gen aşırı ifade veya aktive mutant geni ifadesi) veya fonksiyon kaybı (gen susturma veya bir fonksiyon kaybı mutant ifade) yaklaşımlar2kullanılarak incelenebilir.
Önemlisi, düşük verimlilik ve standart plazmid DNA 'Sı yüksek toksisitesi veya polybrene ile viral iletim protokolleri alanında büyük bir engel kalır. CRISPR/Cas9 teknolojisi hassas genom düzenleme için izin verir, ancak bu yaklaşım sıra doğrulama9tarafından izlenen zaman alıcı seçim gerektirir. Burada, manyetik nanopartiküllere konjugasyon ve manyetik alanın uygulanması ile viral partiküllerin teslimatını optimize eden primer bağırsak organoidleri için viral bir dönüştürücü Protokolü sunuyoruz. Önceki protokollerde önemli değişiklikler4,5,10,11,12,13 ve önerileri verimliliği artırmak için sağlanır. Ayrıca immunohistokimya veya immünofluorescent boyama ile daha fazla analiz için 3D matrigel (bundan böyle Bodrum membran matris veya matris olarak da adlandırılır) kültürlü bozulmamış organoidlerden dondurulmuş bölümler oluşturmak için bir yaklaşım açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>293T hücreleri için temel ortam</td></tr><tr><td>DMEM / F12 +</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>Organoid kültür ortamı ve organoid sindirim tamponu için temel ortam</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>Virüs plazmitleri transfeksiyon ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td>Virüs toplama ortamı ve 293T ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Pen / Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni ve kript ayrışma tamponu</td></tr><tr><td>PBS (Ca 2 , Mg 2 + )</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Bir yıkama tamponu ve kript ayrışma tamponunun bir bileşeni</td></tr><tr><td>Mem-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>GlutamaxII</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 B</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>R& bileşeni, D</td><td>7150-RS-025 / CF</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>İnsan rekombinant insülin</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278-5ml</td><td>Organoid kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3376-100G</td><td>Transdüksiyon ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Wnt3A R</td><td>& D</td><td>5036-WN-010</td><td>İletim ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Y27632</td><td>Millipore Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td>İletim ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Kript ayrışma tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>DTT (ditiyotreitol)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Kript ayrışma tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>Dispase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4818-2MG</td><td>Organoid sindirim tamponu</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>Organoid sindirim tamponu</td></tr><tr><td>matrigel bileşeni (Büyüme faktörü azaltılmış)</td> <td>Corning</td><td>356231</td><td>Organoidleri gömmek için bir matris olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Viral üretimde transfeksiyon için ortam</td></tr><tr><td>ViralMag R/L</td><td>Oz Biosiences</td><td>RL40200</td><td>Viral transdüksiyonun manyetik parçacıkları</td></tr><tr><td>Manyetik plaka</td><td>Oz Biosiences</td><td>MF10000</td><td>Viral transdüksiyonu kolaylaştırmak için manyetik plaka</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Viral üretimde transfeksiyon ajanı</td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Millipore Sigma</td><td>A-003-E</td><td>293T hücreleri tohumlamadan önce plakalar için kaplama</td></tr><tr><td>% 4 Formaldehit Çözeltisi</td><td>Boster</td><td>AR1068</td><td>Organoidleri sabitlemek için çözelti</td></tr><tr><td>OCT gömme bileşiği</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4583S</td><td>Organoidlerin gömülmesi için</td></tr><tr><td>5 mL Falcon polistiren tüpler</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260250</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Ters mikroskop CK30</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td>kriptleri taramak ve saymak için</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 ters floresan</td><td>Nikon</td><td>Axiovert 200</td><td>kriptlerde floresan görüntülemek için</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Ultracel-100 membranlı Santrifüj Filtre ünitesi</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td>Virüsleri</td></tr> <tr><td>konsantre etmek içinpluriSüzgeç 20 ve mikro; m (Hücre Süzgeci)</td><td>pluriSelect</td><td>SKU 43-50020</td><td>Organoid fragmanları hazırlamak için</td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340</td><td>Kript izolasyonundan sonra benzer boyutta şifreler hazırlamak için</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp; çok kuyulu kültür plakaları 48 kuyu (TC kapakla muamele edilmiş)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>M8937-100EA</td><td>ForD2: D37 + D16: D37g organoid fragmanları</td></tr><tr><td>Hayvan suşu: C57BL / 6J</td><td>Jackson Lab</td> <td># 000664</td><td>Organoid kültür için</td></tr></tbody></table>

primer fare bağırsak organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için manyetik nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

İntestinal nevuslardır kültürler, bağırsak kök hücresini araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlar ve biyoloji içinde yer alan biyolojisi, organoidlerde gen ifadesini manipüle etmek için etkili yaklaşımlar bu arenada sınırlı ilerleme kaydetmesine karşın. Crispr/Cas9 teknolojisi, nevuslardır üretimi için hücrelerin hassas genom düzenlemesine izin verirken, bu strateji hem zaman alıcı hem de pahalı olan sıra analizi ile geniş seçim ve tarama gerektirir. Burada, intestinal organoidlerin verimli viral dönüştürücü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım hızlı ve son derece etkilidir, böylece CRISPR/Cas9 teknolojisinin doğasında zaman ve gider azalır. Ayrıca immünohistokimyasal veya immünofluorescent boyama ile daha fazla analiz için bozulmamış nevuslardır kültürlerden dondurulmuş bölümler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz, hangi gen ifadesi veya susturma onaylamak için kullanılabilir. Gen ifadesi veya susturulması için viral vektörler başarılı dönüştürücüden sonra elde edilir, bağırsak kök hücresi ve Crypt fonksiyonu hızla değerlendirilebilir. Çoğu nevuslardır etütler in vitro olarak çalışsa da, organoidler in vivo fonksiyonel analizler için farelere de teslim edilebilir. Dahası, şu anda mevcut tedaviler genellikle genomu değiştirmek yerine gen ifadesi veya protein fonksiyonuyla işlev gördükleri için ilaçlara yönelik terapötik tepkiler tahmin etmek için yaklaşımlarımız avantajlıdır.

Burada, bir manyetik alana maruz kalan manyetik Nanopartiküllerin ilgi hücrelerine Lentivirus teslim edilmesini sağlayan hızlı ve son derece verimli bir dönüştürücü tekniği açıklanmaktadır. Kolayca kullanılabilir araçlar ile, sadece taze izole Crypt hücreleri (Şekil 1a), aynı zamanda Organoids (Şekil 2) ve daha rutin dönüşüm yaklaşımlar refrakter diğer hücreler için değil, bu yaklaşım uyguladıysanız. Lentiviral parçacıklar kolayc...

Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Organoidler doğal yapısal organizasyonu ve bağırsak epitelinin birçok moleküler özelliğini in vivo olarak özetlediği için, bu teknik laboratuvarda normal biyoloji ve hastalık durumlarını incelememizi sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük sitotoksisite ile çok yüksek verimli bir transdüksiyon yaklaşımı kullanarak organoidleri genetik olarak tasarlama yeteneğidir, böylece bu genetik olarak manipüle edilmiş organoidlerin fonksiyonel çalışmalarına olanak sağlar. Bu tekniğin etkileri bağırsak hastalığı için tedaviye doğru uzanır, çünkü bağırsak organoidlerini ilaçlara ve diğer ajanlara veya müdahalelere maruz bırakabiliriz.Bu yöntem, meme dokuları gibi organoid kültürlere veya standart 2D koşullarda büyüyen hücrelere uygun diğer sistemlerde gelişimsel ve patolojik süreçlerin incelenmesinde uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler zor mühendislik organoidler veya diğer hücrelerde transdüksiyon ile başarılı olacaktır. Bu yöntem için ilk fikri ilk olarak organoidlerimizi ve kök hücrelerimizi aktarmada zorluklarla karşılaştığımızda bulduk.Bu yöntemin görsel gösterimi, kriyoding için bodrum matrisine katıştırma işlemi sırasında numunelerin düzgün bir şekilde tedavi edilmediği takdirde organoidlerin yapısal kaybı nın meydana gelebileceği için önemlidir. Viral transdüksiyon için organoidler büyümek için, 48-iyi plaka da iyi başına transdüksiyon orta 200 mikrolitre ile tohum organoid hücre kültürleri, ve standart doku kültürü kuluçka kuluçka. Transdüksiyon için virüs erime şişeleri, 48-iyi plakalar her kuyunun transdüksiyon için konsantre virüs yaklaşık 50 mikrolitre için izin.1.5 mililitrelik bir tüpte, virüsü manyetik nanopartikül çözeltisinin 12 mikrolitresiyle karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, transeolacak hücrelere manyetik nanopartikül çözeltisi ve virüs karışımı ekleyin. 48 kuyulu plakayı manyetik bir plakaya yerleştirin ve en az iki saat boyunca standart doku kültürü kuluçka makinesine koyun.Viral transfeksiyon tamamlandığında, enfekte organoid hücre kümeleri ve transdüksiyon orta her kuyudan 1.5 mililitrelik tüp içine aktarın. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj. Hafif emme ile supernatant atın ve beş dakika buz üzerinde pelet içeren tüpleri soğutun.Her tüpe 120 mikrolitre bodrum membran matrisi ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak peleti yeniden askıya alın. Yeni bir 48-kuyu plaka içine matris-hücre karışımı tohum 30 mikrolitre damla. Matris katılanına kadar plakayı 37 derecede 5 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.Her kuyuya transdüksiyon ortamı ekleyin ve standart doku kültürü kuluçka makinesinde üç ila dört gün kuluçkaya yatırın. Üç ila dört gün sonra, organoid yapılar içine hücre kümelerinin düzenlenmesini sağlamak için 10x büyütme bir ışık mikroskop altında kültürleri inceleyin. Her kuyudaki transdüksiyon ortamını 250 mikrolitre organoid kültür ENR ortamı ile hafifçe değiştirin.Tabağı kuvöze geri ver. Bu prosedürü, enr ortasını nazik emme ile çıkararak, temel membran matrisini rahatsız etmemeye dikkat ederek başlatın. 500 mikrolitre PBS ile hafifçe yıkayın.Organoidleri kuyu başına %4 paraformaldehit çözeltisi bir mikrolitre ekleyerek düzeltin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra, emiş ile paraformaldehit çözeltisi çıkarın. Yavaşça iyi başına PBS bir mikrolitre ekleyin ve sonra nazik emme ile PBS kaldırın.Bu şekilde, PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi ikinci yıkamadan çıkarın ve her numuneye %30 sakaroz tamponu bir mikrolitre ekleyin. Örnekleri susuz kalım için sakarozdaki sabit organoidleri dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Emme ile sakaroz tampon çıkarın ve her kuyuda matris tabakası kapsayacak kadar gömme bileşik ekleyin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Daha sonra, numuneleri eksi 80 derecelik bir dondurucuya 10 dakika veya katıştırma bileşiği katı ve beyaza dönene kadar yerleştirin.Kenarları boyunca bileşiğin en az erime sağlamak için oda sıcaklığında dondurulmuş gömme bileşik ile plaka yerleştirin. Kuyunun duvarlarından blok ayırmak için bir neşter veya spatula kullanın. Matris katıştırma bileşik bloğunu kaldırmak ve bir numune bloğuna yerleştirmek için forceps kullanarak erimeyi önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.Kalıbı gömme bileşimi ile tamamen doldurun. Kesit için bloğu kullanmadan önce eksi 80 derecede 30 dakika dondurun. Bu protokol, gfp'ye bağlı merceksi viral vektörler ile ilk bağırsak organoidlerinin transducing tarafından optimize edildi.GFP organoid gelişimin her aşamasında görselleştirilmişti, kripto hücrelerin kist benzeri yapılar halinde organize olduğu zaman veya organoidler tomurcukları oluşturduğunda daha sonraki zaman noktalarında da dahil olmak üzere. Başarılı bir şekilde transekte intestinal organoidler daha sonra formalin-sabit, kriyokesit, ve immünoresans görüntüleme ile analiz edildi. Bu resimde çekirdekler maviye boyanmıştır ve yeşil, hücre sınırlarını çizen epitel hücre yapışma moleküllerini gösterir.Kırmızı Paneth hücrelerini tanımlamak için lizozom lekelenme gösterir. Bir kez hakim, transducing organoidler yaklaşık üç saat içinde yapılabilir, ve organoidler crysection gömme yaklaşık 2 1 /2 saat içinde yapılabilir. Bu yordamı denerken, bodrum matris reaktifleri kullanırken buz üzerinde çalışmayı unutmayın.Bu işlemi tamamladıktan sonra, lokalizasyon veya göreceli bolluğu değerlendirmek için immünofloresan analizi ve protein veya organelleri tespit etmek için diğer yöntemler yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların normal biyoloji ve hastalık durumlarını in vitro olarak keşfetmelerinin ve ayrıca transdükse organoidlerin veya hücrelerin farelere yerleştirilmesi durumunda in vivo çalışmalarının yollarını açar. Bu videoyu izledikten sonra, kriyokesit için genetik olarak organoidler tasarlamak için manyetik etiketli virüslerin nasıl kullanılacağıkonusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu giysilerin takılması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

genetic-engineering-primary-mouse-intestinal-organoids-using-magnetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar   model sistem.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Bu protokol, CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak çoklu gen nakavtları yaratmada özel olarak kullanılan bir kılavuz RNA konformemer vektörüne birden fazla tekli kılavuz RNA'yı klonlamak için gereken aşamaları açıklar. Bağırsak organoitlerinde çift nakavt üretimi bu yöntemin olası bir uygulaması olarak gösterilmiştir.

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Öğrenin fare bağırsak organoidlerinin manyetik nanopartikül destekli viral vektörlerle genetik mühendisliğini ve dondurulmuş kesit hazırlama yöntemini. Bu teknik düşük sitotoksisite ile yüksek verimli transdüksiyon sağlar.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma (Video) | JoVE Journal

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Daha fazla video keşfet