Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.

Organoidler doğal yapısal organizasyonu ve bağırsak epitelinin birçok moleküler özelliğini in vivo olarak özetlediği için, bu teknik laboratuvarda normal biyoloji ve hastalık durumlarını incelememizi sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük sitotoksisite ile çok yüksek verimli bir transdüksiyon yaklaşımı kullanarak organoidleri genetik olarak tasarlama yeteneğidir, böylece bu genetik olarak manipüle edilmiş organoidlerin fonksiyonel çalışmalarına olanak sağlar. Bu tekniğin etkileri bağırsak hastalığı için tedaviye doğru uzanır, çünkü bağırsak organoidlerini ilaçlara ve diğer ajanlara veya müdahalelere maruz bırakabiliriz.

Bu yöntem, meme dokuları gibi organoid kültürlere veya standart 2D koşullarda büyüyen hücrelere uygun diğer sistemlerde gelişimsel ve patolojik süreçlerin incelenmesinde uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler zor mühendislik organoidler veya diğer hücrelerde transdüksiyon ile başarılı olacaktır. Bu yöntem için ilk fikri ilk olarak organoidlerimizi ve kök hücrelerimizi aktarmada zorluklarla karşılaştığımızda bulduk.

Bu yöntemin görsel gösterimi, kriyoding için bodrum matrisine katıştırma işlemi sırasında numunelerin düzgün bir şekilde tedavi edilmediği takdirde organoidlerin yapısal kaybı nın meydana gelebileceği için önemlidir. Viral transdüksiyon için organoidler büyümek için, 48-iyi plaka da iyi başına transdüksiyon orta 200 mikrolitre ile tohum organoid hücre kültürleri, ve standart doku kültürü kuluçka kuluçka. Transdüksiyon için virüs erime şişeleri, 48-iyi plakalar her kuyunun transdüksiyon için konsantre virüs yaklaşık 50 mikrolitre için izin.

1.5 mililitrelik bir tüpte, virüsü manyetik nanopartikül çözeltisinin 12 mikrolitresiyle karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, transeolacak hücrelere manyetik nanopartikül çözeltisi ve virüs karışımı ekleyin. 48 kuyulu plakayı manyetik bir plakaya yerleştirin ve en az iki saat boyunca standart doku kültürü kuluçka makinesine koyun.

Viral transfeksiyon tamamlandığında, enfekte organoid hücre kümeleri ve transdüksiyon orta her kuyudan 1.5 mililitrelik tüp içine aktarın. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj. Hafif emme ile supernatant atın ve beş dakika buz üzerinde pelet içeren tüpleri soğutun.

Her tüpe 120 mikrolitre bodrum membran matrisi ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak peleti yeniden askıya alın. Yeni bir 48-kuyu plaka içine matris-hücre karışımı tohum 30 mikrolitre damla. Matris katılanına kadar plakayı 37 derecede 5 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.

Her kuyuya transdüksiyon ortamı ekleyin ve standart doku kültürü kuluçka makinesinde üç ila dört gün kuluçkaya yatırın. Üç ila dört gün sonra, organoid yapılar içine hücre kümelerinin düzenlenmesini sağlamak için 10x büyütme bir ışık mikroskop altında kültürleri inceleyin. Her kuyudaki transdüksiyon ortamını 250 mikrolitre organoid kültür ENR ortamı ile hafifçe değiştirin.

Tabağı kuvöze geri ver. Bu prosedürü, enr ortasını nazik emme ile çıkararak, temel membran matrisini rahatsız etmemeye dikkat ederek başlatın. 500 mikrolitre PBS ile hafifçe yıkayın.

Organoidleri kuyu başına %4 paraformaldehit çözeltisi bir mikrolitre ekleyerek düzeltin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra, emiş ile paraformaldehit çözeltisi çıkarın. Yavaşça iyi başına PBS bir mikrolitre ekleyin ve sonra nazik emme ile PBS kaldırın.

Bu şekilde, PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi ikinci yıkamadan çıkarın ve her numuneye %30 sakaroz tamponu bir mikrolitre ekleyin. Örnekleri susuz kalım için sakarozdaki sabit organoidleri dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.

Emme ile sakaroz tampon çıkarın ve her kuyuda matris tabakası kapsayacak kadar gömme bileşik ekleyin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Daha sonra, numuneleri eksi 80 derecelik bir dondurucuya 10 dakika veya katıştırma bileşiği katı ve beyaza dönene kadar yerleştirin.

Kenarları boyunca bileşiğin en az erime sağlamak için oda sıcaklığında dondurulmuş gömme bileşik ile plaka yerleştirin. Kuyunun duvarlarından blok ayırmak için bir neşter veya spatula kullanın. Matris katıştırma bileşik bloğunu kaldırmak ve bir numune bloğuna yerleştirmek için forceps kullanarak erimeyi önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.

Kalıbı gömme bileşimi ile tamamen doldurun. Kesit için bloğu kullanmadan önce eksi 80 derecede 30 dakika dondurun. Bu protokol, gfp'ye bağlı merceksi viral vektörler ile ilk bağırsak organoidlerinin transducing tarafından optimize edildi.

GFP organoid gelişimin her aşamasında görselleştirilmişti, kripto hücrelerin kist benzeri yapılar halinde organize olduğu zaman veya organoidler tomurcukları oluşturduğunda daha sonraki zaman noktalarında da dahil olmak üzere. Başarılı bir şekilde transekte intestinal organoidler daha sonra formalin-sabit, kriyokesit, ve immünoresans görüntüleme ile analiz edildi. Bu resimde çekirdekler maviye boyanmıştır ve yeşil, hücre sınırlarını çizen epitel hücre yapışma moleküllerini gösterir.

Kırmızı Paneth hücrelerini tanımlamak için lizozom lekelenme gösterir. Bir kez hakim, transducing organoidler yaklaşık üç saat içinde yapılabilir, ve organoidler crysection gömme yaklaşık 2 1 /2 saat içinde yapılabilir. Bu yordamı denerken, bodrum matris reaktifleri kullanırken buz üzerinde çalışmayı unutmayın.

Bu işlemi tamamladıktan sonra, lokalizasyon veya göreceli bolluğu değerlendirmek için immünofloresan analizi ve protein veya organelleri tespit etmek için diğer yöntemler yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların normal biyoloji ve hastalık durumlarını in vitro olarak keşfetmelerinin ve ayrıca transdükse organoidlerin veya hücrelerin farelere yerleştirilmesi durumunda in vivo çalışmalarının yollarını açar. Bu videoyu izledikten sonra, kriyokesit için genetik olarak organoidler tasarlamak için manyetik etiketli virüslerin nasıl kullanılacağıkonusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu giysilerin takılması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.