Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi

Bu, plazma analizi için örnek hazırlama protokolüdür. Bütünlüklerini korumak için tüm örneklerin ve standartların toplama ve işleme sırasında 2 ila 8 °C'de tutulması gerektiğini lütfen unutmayın. İşlemler tamamlandıktan sonra tüm örnekleri -20 °C'de saklayın.

Standart hazırlama için, her bir anilid, ivacaftor, M1 metaboliti, M6 metaboliti ve lumacaftor'ün metanol içinde 100 µg/mL ve 10 µg/mL konsantrasyonlarında iki bağımsız stok çözeltisini hazırlayın. Bileşiklerin oda sıcaklığında 10 gün sonra miyadının dolduğunu lütfen unutmayın. Standartlar için, 1,5 mL'lik polipropilen mikro santrifüj tüplerine 100 µL insan plazması aktarın.

Diğer tüm numuneleriniz için aynı işlemi tekrarlayın. Ardından, her tüpe iç standart ekleyin. Örneğin, hazırlanmış standarttan 0.01 µg/mL seçiyoruz.

Şu anda bu tüp, iç standart eklenmiş plazma içermektedir. Diğer tüm standartlar için de aynı şekilde devam edin. Standartlarınızı alın ve tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için birkaç saniye boyunca santrifüjleyin.

Buna tüm 40 standart için devam edin. Hasta örnekleri için, hasta örneği tüpünden 100 µL'yi mikro santrifüj tüpüne aktarın. Gerçek hasta örneğine iç standart eklenmez.

Tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için hasta örneğini birkaç saniye boyunca santrifüjleyin. Sonraki adımlar hem örnekler hem de standartlar için tasarlanmıştır. Plazma proteinlerini çöktürmek için her bir örnek tüpüne 200 µL %0,1 formik asit içeren acetonitrile ekleyin.

Tüm standartlar ve hasta örnekleri için aynı işlemi tekrarlayın. Her örneği yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Tüm standartlar ve gerçekleşmiş örnekler (incurred samples) için bu işlemi sürdürün.

Çökelmeyi kolaylaştırmak için buzdolabında 10 dakika bekletin. Gösterim amaçlı olarak, yalnızca bir örneği ve bir standardı santrifüj edeceğim. Eppendorf Centrifuge 5430 cihazında, dört derecede, 10.000 rpm hızda 10 dakika boyunca santrifüjleme yapıyoruz.

Şimdi süpernatantı Phenomenex viallerine filtreleyeceğiz. Bunun için ABD'den satın alınan 0,45 mikrometre naylon Grace filtreli 13 milimetrelik şırınga filtresi kullanıyoruz ve 1,5 mililitre hacmindeki HPLC viallerine filtrasyon yapıyoruz. Filtrasyon sonrası, LC/MS analizi için 100 mikrolitre süpernatantı LC/MS viallerine aktaracağız.

Bu örnek artık analiz için hazırdır. Şimdi tüm örneklerinizi tüp rafına yerleştirmeniz yeterlidir. Üçlü kuadrupol kütle spektrometresi ile entegre edilmiş bir Shimadzu 8030 LC/MS sistemi kullanıyoruz.

Analizden önce sistemin dengelenmesini bekleyin. Yaklaşık 15 dakika süren dengeleme işlemi tamamlandığında, Start düğmesine basın. Her bir metabolit için, anilidlerin pik alanı oranlarını kalibrasyon standartlarının nominal konsantrasyonuna karşı grafikleyerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.

Örnekteki anilid konsantrasyonlarını hesaplamak için kalibrasyon eğrisinin regresyon denklemini kullanın. Tipik bir kromatogram bu şekilde gösterilmiştir. Phenomenex Kinetex C8 kolonunda, %100 asetonitril ve su içinde %0,1 formik asitten oluşan bir mobil faz ile gradyan elüsyon kullanılarak optimize edilmiş kromatografik çözünürlük elde edilmiştir.

LC alıkonma süreleri şu şekildeydi. M6 için bir dakika. M1 için 1,3 dakika.

Ivacaftor için 1,55 dakika, lumacaftor için 2,3 dakikadır. Tüm boş plazma örneklerinde, anilidlerin alıkonma sürelerinde herhangi bir girişim gözlenmediği gibi, ivacaftor ile lumacaftor kombinasyonundan kaynaklanan bir girişim de saptanmamıştır.

Çok sayıda hasta örneğinin yüksek kapasiteli analizi sayesinde, mevcut izokratik elüsyon yerine daha küçük gözenek boyutuna sahip bir ters faz kromatografi kolonu olan Phenomenex C8 kolonu ve gradyan çözücü sistemi kullanarak raporladığımız yöntemi optimize ettik. Bu işlem, yıkama aşaması dahil olmak üzere örnek başına çalışma süresini altı dakikaya indirmektedir. Güvenilir ve özgün olan bu yöntem; ivacaftor ve ivacaftor-lumacaftor kombinasyonunun biyolojik sıvılardaki terapötik ilaç izlemi için basit, hassas ve hızlı bir yaklaşım sunmaktadır.

İlaç etkinliğini maksimize etmek ve sağlık hizmetleri maliyetlerini kontrol altında tutmak için maruz kalma-yanıt ilişkileri geliştirme ihtiyacı göz önüne alındığında, CF hastası olan hastalarda kanıta dayalı tedavilerin ve yüksek kapasiteli analitik tekniklerin kullanımı konusunda klinisyenlere yardımcı olacak daha hassas araçların geliştirilmesi ve valide edilmesi gerekmektedir. Önerilen analitik yöntemin klinik farmakokinetik ve farmakodinamik çalışmalara uygulanmasıyla, ivacaftor veya ivacaftor-lumacaftor kombinasyonunun farmakokinetik parametrelerinin daha geniş bir hasta grubu üzerinde daha detaylı araştırılmasına olanak sağlanacaktır.