Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi
October 15th, 2017
Ivacaftor ve ivacaftor-lumacaftor iki yeni CF ilaç bileşimidir. Ancak, hala bir kıtlık PK/PD ve Farmakoloji anlayış yoktur. Biz ivacaftor ve onun büyük metabolitleri ve lumacaftor aynı anda analizi için en iyi duruma getirilmiş bir HPLC-MS tekniği mevcut.
Bu, plazma tahlili için numune hazırlama protokolüdür. Bütünlüklerini sağlamak için, tüm numunelerin ve standartların toplama ve işleme sırasında iki ila sekiz santigrat derecede tutulması gerektiğini lütfen unutmayın. İşlem tamamlandıktan sonra tüm numuneleri eksi 20 derecede saklayın.
Standart hazırlık için, mililitre başına 100 mikrogram ve mililitre başına 10 mikrogram metanol içinde her anilid, ivacaftor, M1 metaboliti, M6 metaboliti ve lumacaftor'dan iki bağımsız stok çözeltisi hazırlayın. Lütfen, bileşiklerin tezgah üstünde 10 gün sonra sona erdiğini unutmayın. Standartlar için, 100 mikrolitre insan plazmasını 1.5 mililitrelik polipropilen mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Diğer tüm numuneleriniz için bunu yapmaya devam edin. Ardından her tüpe dahili standardı ekleyin. Örneğin, hazırlanan standarttan mililitre başına 0.01 mikrogram seçiyoruz.
Şimdi bu tüp, iç standartla çivilenmiş plazma içeriyor. Diğer tüm standartlarda bu şekilde ilerleyin. Standartlarınızı alın ve tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için birkaç saniye aşağı çevirin.
40 standardınızın tümü için bunu yapmaya devam edin. Hasta numuneleri için, hasta numune tüpünden 100 mikrolitreyi mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gerçek hasta numunesi dahili standartla çivilenmez.
Tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için hasta örneğini birkaç saniye aşağı döndürün. Sonraki adımlar hem numuneler hem de standartlar için tasarlanmıştır. Plazma proteinlerini çökeltmek için her numune tüpüne asetonitril içinde 200 mikrolitre %0.1 formik asit ekleyin.
Tüm standartlar ve hasta numuneleri için bunu yapmaya devam edin. Her numuneyi yaklaşık 15 saniye kuvvetlice girdaplayın. Tüm standartlar ve tahakkuk eden numuneler için bunu yapmaya devam edin.
Çökeltmeyi kolaylaştırmak için buzdolabında 10 dakika bekletin. Göstermek amacıyla, sadece bir numune ve bir standardı santrifüjleyeceğim. Dört derecede bir Eppendorf Santrifüj 5430 üzerinde 10 dakika boyunca 10.000 rpm'de santrifüjleme yapıyoruz.
Şimdi süpernatanı Phenomenex şişelerine filtreleyeceğiz. Bunun için ABD'den satın alınan 0.45 mikrometre naylon Grace filtreli 13 milimetrelik bir şırınga filtresi kullanıyoruz ve 1.5 mililitre içerebilen HPLC şişelerine filtreleme yapıyoruz. Filtrasyondan sonra, LC / MS analizi için LC / MS şişelerine 100 mikrolitre süpernatan aktaracağız.
Bu örnek artık analiz için hazırdır. Şimdi tüm numunelerinizi flakon rafına koyun. Üçlü dört kutuplu kütle spesifikasyonu ile birleştirilmiş bir Shimadzu 8030 LC/MS sistemi kullanıyoruz.
Analizden önce sistemin dengelenmesine izin verin. Yaklaşık 15 dakika süren dengelendikten sonra, Başlat düğmesine basmanız yeterlidir. Her metabolit için, kalibrasyon standartlarının nominal konsantrasyonuna karşı anilidlerin tepe alan oranlarını çizerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
Oluşan numunedeki anilid konsantrasyonlarını hesaplamak için kalibrasyon eğrisi için regresyon denklemini kullanın. Bu şekilde tipik bir kromatogram gösterilmiştir. Optimize edilmiş kromatografik çözünürlük, bir Phenomenex Kinetex C8 kolonu üzerinde bir gradyan elüsyonu ile suda %100 asetonitril ve %0.1 formik asidin mobil fazı kullanılarak elde edildi.
LC tutma süreleri aşağıdaki gibidir. M6 için bir dakika. M1 için 1,3 dakika.
İvacaftor için 1.55 dakika. Lumacaffor için 2,3 dakika. Tüm boş plazma örneklerinde, anilidlerden herhangi birinin alıkonma süresi ile herhangi bir girişim gözlenmedi ve ivacaftor'un lumacaftor ile kombinasyonundan kaynaklanan bir girişim tespit edilmedi.
Büyük miktarda hasta numunesinin yüksek verimli analizi sayesinde, mevcut izokratik elüsyon yerine daha küçük gözenek boyutlu ters fazlı kromatografi kolonu Phenomenex C8 kolonu ve gradyan çözücü sistemi kullanarak raporlanan yöntemimizi optimize ettik. Bu, yıkama aşaması da dahil olmak üzere çalışma süresini numune başına altı dakikaya düşürür. Bu güvenilir ve yeni yöntem, ivacaftor ve ivacaftor-lumacaftor kombinasyonu ve biyolojik sıvıların terapötik ilaç izlemesi için basit, hassas ve hızlı bir yaklaşım sunar.
İlaç etkinliğini en üst düzeye çıkarmak ve sağlık hizmeti maliyetlerini kontrol altına almak için maruziyet-yanıt ilişkilerinin geliştirilmesi ihtiyacı göz önüne alındığında, klinisyenlere acı çeken hastalar için kanıta dayalı tedavi ve yüksek verimli analitik teknikleri kullanmada yardımcı olmak için daha hassas araçların geliştirilmesi ve doğrulanması gerekmektedir CF.By önerilen analitik yöntemi klinik farmakokinetik ve farmakodinamik çalışmalara uygulamak, ivacaftor'un farmakokinetik parametrelerini daha fazla araştırma fırsatı ortaya çıkmaktadır. Daha büyük bir hasta kolektifinde ivacaftor-lumacaftor kombinasyonu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, ivakaftor ve önemli metabolitlerinin yanı sıra lumacaftor'un eşzamanlı analizi için optimize edilmiş bir HPLC-MS tekniği sunmaktadır. Bu yeni kistik fibrozis ilaçlarının farmakokinetik ve farmakodinamiği iyi anlaşılmamıştır ve bu da gelişmiş analitik yöntemlere olan ihtiyacı vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Farmakoloji
- Analitik Kimya
- Kistik Fibrozis Araştırması
Arka Plan
- Ivakaftor ve lumacaftor, kistik fibrozis için yeni ilaçlardır.
- Onların farmakokinetik ve farmakodinamiği hakkında sınırlı bilgi bulunmaktadır.
- İlaç analizinin optimize edilmiş yöntemleri, etkilerini anlamak için gereklidir.
- HPLC-MS, ilaç analizi için güçlü bir tekniktir.
Çalışmanın Amacı
- Ivakaftor ve lumacaftor'u analiz etmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Ivakaftor ve metabolitlerinin farmakokinetiklerini değerlendirmek.
- İlaç etkileşimleri ve etkinliği hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Plazmada analiz için numune hazırlanması.
- Numnelerin kontrollü sıcaklıklarda saklanması.
- Metanol içinde stok çözeltilerinin hazırlanması.
- Eşzamanlı analiz için HPLC-MS kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Optimize edilmiş bir HPLC-MS tekniğinin başarılı bir şekilde geliştirilmesi.
- Ivakaftor ve metabolitlerinin analizi gerçekleştirilmiştir.
- Yöntem, farmakokinetik çalışmalar için güvenilirlik göstermiştir.
- Kistik fibrozis ilaçlarının farmakolojisi hakkında içgörüler elde edilmiştir.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş yöntem, ilaç davranışını anlamada yardımcı olabilir.
- Farmakodinamiği araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
- Gelişmiş analitik teknikler, ilaç geliştirme için kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accelerated pharmacokinetic profiling of CFTR modulators is critical for optimizing dosing regimens and understanding exposure-response relationships in cystic fibrosis. This high-throughput LC-MS/MS method enables rapid quantification of ivacaftor, its metabolites, and lumacaftor, supporting larger-scale clinical studies and de-risking translational development. Reduced analysis time from 15 to 6 minutes per sample enhances laboratory throughput, facilitating population PK/PD investigations and portfolio-level decision-making for CF therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of drug and metabolite concentrations to interrogate CFTR modulation mechanisms and pathway engagement.
- Operational Value: Provides reproducible quantitative outputs for assessing target exposure in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers sensitive, selective detection of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological matrices.
- Operational Value: Gradient elution on sub-2µm C8 column ensures chromatographic resolution and assay robustness for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports exposure-response modeling by generating reliable PK data from CF patient samples.
- Operational Value: Enables scalable sample processing for clinical PK studies, bridging discovery to clinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-translational continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and quantitative readouts for preclinical and clinical PK evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates target engagement assessment through accurate metabolite profiling in biological systems.
- Screening: Ensures assay standardization and reproducibility for reliable compound evaluation across sample sets.
- Analytics: Provides peak area ratio-based quantification and calibration curves for precise concentration determination.
- Translational Research: Connects analytical output to clinical exposure metrics, enabling PK/PD correlation in patient populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for CFTR modulator programs, reducing method redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in drug exposure assessment, reduction of PK uncertainty in CFTR modulator studies.
- Operational Value: High-throughput capability, method sensitivity, and rapid turnaround for large sample cohorts.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on exposure data, improved capital efficiency in clinical development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of CF drug candidates using robust PK/PD datasets.
Implementation Considerations
- Expertise in LC-MS/MS method development and biological sample handling.
- Access to triple-quadrupole mass spectrometry and gradient HPLC systems.
- Standardization of sample preparation, protein precipitation, and filtration protocols.
- Adaptation considerations for different biological fluids (e.g., plasma, sputum) and stability monitoring.
- Requirement for controlled storage conditions (−20°C) and fresh standard preparation within 10-day stability window.
