Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Bu immün boyama protokolünün genel amacı, ex vivo beyin dilimlerinde sinaptik yoğunluğu değerlendirmektir. Bu yöntem, sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve nörodejeneratif hastalıklarda gözlemlendiği gibi sinaps yoğunluğu değişikliklerini incelerken yararlıdır. Bu tekniğin temel avantajı, aynı anda hazırlanan deneysel koşul arasında karşılaştırılabilen sinaps yoğunluğunun yarı kantitatif bir tahminini sağlamasıdır.

Fare beynini bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Ardından, beynin orta hattına yarım kesmeden önce beyinciği ve frontal korteksin küçük bir bölümünü bir neşterle çıkarın. Bir yarım küreyi az önce kesilen tarafa çevirin ve bir vibratom sahnesine yapıştırın.

Buz gibi soğuk ACSF'yi mikrotom odasına dökün ve çözeltiyi oksijenlendirin. İlgilenilen bölgenin tamamının 200 ila 300 mikron kalınlığında kesitlerini kesin. Hipokampus için, yarım küre başına yaklaşık üç ila dört dilim elde edilmelidir.

Dilimleri oksijenli ACSF'ye batırılmış sıcaklık kontrollü bir odaya aktarmak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın. 34 santigrat derecede 30 dakika koruyun. 30 dakika geçtikten sonra, dilimleri% 4 sakarozlu% 4 paraformaldehit içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve oda sıcaklığında 20 dakika ila bir saat sabitleyin.

Sabitlemeyi takiben, dilimleri her seferinde 10 dakika boyunca 1x PBS'de üç kez yıkayın. İmmünofloresan boyamaya başlamak için, dilim oyuklarındaki PBS'yi bloke edici ve geçirgen hale getirici tamponla değiştirin ve çalkalayıcı üzerinde dört ila altı saat oda sıcaklığında inkübe edin. Blokaj adımının sonuna doğru, antikoru bloke edici ve geçirgen hale getiren tamponda vGlut1 bir ila 2.000'e seyreltin.

Bu seyreltmenin şirkete ve kullanılan antikorun miktarına bağlı olarak değişebileceğini lütfen unutmayın. Dilimleri birincil antikor çözeltisinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Güçlü hareket eden sallanan bir platform kullanın.

Primer ve sekonder antikorların eşit dağılımı optimal boyama için önemlidir. Deneyimlerimize göre, kuvvetli çalkalama en iyi antikor penetrasyonunu sağlar. Primer antikorda inkübasyondan sonra, dilimleri daha önce olduğu gibi her seferinde 10 dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın.

Son yıkama sırasında, uygun ikincil antikorları bloke edici tamponda bir ila 500 oranında seyreltin. Daha sonra, dilimleri bu çözeltide oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe edin. İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu için dilimlerin ışıktan korunduğundan emin olun.

Dilimleri yıkadıktan sonra, daha önce olduğu gibi, dilimleri 24 oyuklu plakadan dikkatlice çıkarmak için bir fırça kullanın ve önceden etiketlenmiş cam slaytlara eşit şekilde yerleştirin. Her dilimin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkatli olarak dilimlerin üzerine nazikçe bir cam lamel yerleştirin.

Işıktan koruyun ve slaytların oda sıcaklığında en az üç ila dört gün kurumasını bekleyin. Slaytları kısa vadede dört santigrat derecede saklayın. Ancak uzun süreli depolama için eksi 20 santigrat derecede tutun.

Görüntülenecek hipokampus bölgesini, bu durumda CA1 piramidal nöronları ve Schaffer kollateral aksonları arasındaki sinapsları tanımlamak için 10x veya 20x'lik bir hedef kullanarak başlayın. 40x veya 63x yağa daldırma hedefine geçin ve sürekli nöritleri ve organize bir yapıyı tanımlayarak dilim anatomisinin sağlam olduğundan emin olun. Referans olarak MAP2 gibi bir nöronal belirteç kullanın.

1.024 x 1.024 piksel çözünürlükle optimum sinyal ve kontrast elde etmek için her kanalın ayarlarını yapın. Herhangi bir pikselin doygunluğunu önlemek için her lazerin yoğunluğunu ayarlayın. Lekelenmenin eşit olduğu derinliği değerlendirin ve ardından yazılımı en az sekiz eşit uzaklıkta 250 nanometre düzlemden oluşan görüntü yığınlarını elde edecek şekilde ayarlayın.

Ardından, her dilim için aynı ilgi alanından üç bitişik temsili görüntü yığını alın. Edinimi koşul başına en az üç dilimde ve tedavi grubu başına altı ila sekiz hayvanda tekrarlayın. Uyarıcı sinapslar, daha yüksek büyütme görüntüsündeki beyaz oklarla gösterildiği gibi, vGlut1 ve PSD95 arasındaki kolokalizasyon ile tanımlanabilir.

Wnt antagonisti Dkk1'i indükleyerek yetişkin hipokampusta Wnt sinyalinin blokajı, özellikle CA1 stratum radiatumunda uyarıcı sinaps kaybını tetikler. Kontrol ve iDkk1 fareleri arasındaki uyarıcı sinapsların yüzdesi ölçüldü ve iDkk1 transgenik hayvanlarda önemli ölçüde daha düşük bulundu. İnhibitör sinapslar, vGat ve Gephyrin arasındaki kolokalizasyon ile tanımlanabilir.

Kontrol ve iDkk1 fareleri arasındaki inhibitör sinapsların yüzdesi ölçüldü ve anlamlı bir fark tespit edilmedi. Bu prosedürü denerken, dilimlere mümkün olduğunca özen göstermeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, ex vivo beyin dilimlerinde sinaptik yoğunluğun nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.