Name: Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, fare hipokampal kesilerinde sinaptik yoğunluğu değerlendirmek için immünofloresan tekniklerini. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklardaki sinaptik değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser MRC, AB FP7, ARUK, Wellcome Trust ve Parkinson İngiltere tarafından desteklenmiştir. Biz de onun katkı confocal görüntülerin ve el yazması ve metodoloji yapıcı kendi giriş için laboratuara üyeleri için Bayan Johanna Buchler teşekkür etmek istiyorum.

tüm fare ve sıçanlar kullanarak deneyler kabul edildi ve programı 1 yordamları kullanarak yapılan kapalı ev ofis hayvanlar (bilimsel yordamlar) Yasası 1986. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) tarifi-ebilmek bulunmak Tablo 1 ' de.
 1. akut Hipokampal dilim hazırlık <ol><li>fare beyin bir spatula kullanarak, mümkün olduğunca hızlı bir şekilde kaldırmak ve keskin makas kafatası kesip içinde buz gibi yer, (% 95'i O 2, % 5 CO 2), oksijenli yüksek-Sükroz ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Fare beyin üzerinde Petri kabına yerleştirin ve beyincik ve frontal korteks beynin orta hat aşağı hemisecting önce bir neşter ile küçük bir bölümünü kaldırmak.</li>
	<li>İki hemisferlerin sadece kesildi yanına koyun ve bir vibratome sahneye her hemisphere tutkallayın.</li>
	<li>200-300 µm kalınlığında kesitler ilgi tam bölgesinin kesti. Hippocampus söz konusu olduğunda, yaklaşık 3-4 dilim başına Yarımküre alınmalıdır.</li>
	<li>Plastik Pasteur pipet kullanarak oksijenli (% 95'i O 2 ' de, % 5 CO 2) batık bir odasına dilimleri transfer ACSF. 30 dk. 34 ° C'de korumak 
	Not: Dilimleri tedavi rekombinant Dkk1 proteinler gibi etkin farmakolojik ajanlar ile bu aşamada dilim odasına aracıları ekleyerek gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Dilimleri bir fırça kullanarak odasından kaldırın, onları 24-şey plaka yerleştirin ve düzeltmek için % 4 paraformaldehyde içinde 1 h 20 min (PFA)/4% Sükroz, oda sıcaklığında (RT). 
	Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Yıkama dilimleri üç kez 1 X PBS (10 dk her). 
	Not: dilimleri 1 X PBS 4 ° C'de tutulur sürece protokol burada 1-2 gün boyunca, duraklatılmış.</li>
</ol> 2. Sinaptik işaretçileri için ayirt Not: kullanılan tüm arabellekleri tarifleri Tablo 2 ' de bulunabilir.
<ol><li>Dilim wells PBS engelleme/permeabilizing arabellek (Tablo 2) ile değiştirin ve RT için 4-6 h., kuluçkaya</li>
	<li>VGlut1 adlı bir 1:2,000 seyreltme engelleme/permeabilization tampon karşı poliklonal eskiden şiling şimdi domuz antikor sulandırmak. 
	Not: vGlut1 önceden sinaptik uyarıcı terminal görüntüleme için bir belirtecidir. Post sinaptik uyarıcı synapse kimlik için PSD-95 ve seyreltik 1:500 karşı poliklonal antikor aynı çözüm içinde kullanın. 300 µL en küçük bir birim her kuyuya kullanın. Hipokampüs anatomik konumunu belirlemek için de MAP2 veya tübülin gibi nöronal yapıyı tanımlayabilir bir antikor kullanın. İş dışarı doğru seçim (öncesi ve sonrası sinaptik) sinaptik işaretçileri için tüm birincil antikorlar konsantrasyonları ve taze engelleme/permeabilizing tampon seyreltik.</li>
	<li>Birincil antikor çözüm dilimleri gecede (veya 1-2 gün) 4'te kuluçkaya ° C. kullanım titreyen bir platform ile beraber güçlü hareket.</li>
	<li>Dilimleri üç kez PBS (10 dk her) yıkayın.</li>
	<li>Uygun ikincil antikorlar 1:500 engelleme arabelleği sulandırmak. Örneğin, vGlut1 eskiden şiling şimdi domuz antikor kullanırken, belirli bir fluorophore Birleşik eskiden şiling şimdi domuz bileşeni (Örneğin, eşek anti-guinea-pig) tanır ikincil bir antikor geçerlidir. PSD-95 tavşan antikor kullanırken, farklı bir özel fluorophore için Birleşik tavşan bileşeni (Örneğin, eşek Anti-tavşan) tanır ikincil bir antikor geçerlidir.</li>
	<li>İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu gibi 2-3 h RT. dilimleri gelen ışık, korunmasını sağlamak için bu çözüm dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Dilimleri üç kez PBS (10 dk her) yıkayın.</li>
	<li>Dikkatle dilimleri bir fırça kullanarak 24-şey plaka kaldırmak ve eşit olarak önceden etiketli cam slaytlar koyun. Montaj orta her dilimin üzerine bir damla ekleyin ve sonra yavaşça dilimlerin üstünde bir cam coverslip yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek. Yeterli montaj orta (300-400 µL), kullanmak için yeterli bir miktar dilim kurumaya yol açabilir gibi dikkat.</li>
	<li>İçin en az 1-2 gün RT, Kuru ve ışıktan korunan slaytlar tutmak için bırakın.</li>
	<li>Kısa vadeli, ancak uzun süreli depolama için slaytları 4 ° C, depolama, -20 et ° C.</li>
</ol> 3. Confocal resim alma ve analiz <ol><li>confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak Imaging.
	<ol><li>Yansıması Hipokampus bölgesi tanımlamak (Örneğin, 1 ve 3 (CA1, CA3) cornu ammonis veya dentat gyrus (DG)) 10 x veya 20 x hedefi.</li>
		<li>Değişim 40 x veya 63 x petrol-daldırma amaç dilim anatomi sürekli neurites belirleyerek sağlamdır ve yapısı düzenlenmiş emin olmak için. MAP2 gibi nöronal bir işaretleyici ( şekil 1A) başvurmak.</li>
		<li>Daha sonra petrol-daldırma amaç x 60 geçin (NA ~1.3 - 1.4 =) ve en iyi sinyal ve kontrast elde etmek için her kanal ayarlarını. Bir yüksek- / düşük kontrast seçeneğini kullanarak herhangi bir piksel doygunluk kaçınmak için her lazer yoğunluğunu ayarlamak. 
		Not: Bu ayar kullanılan mikroskobunun bağlıdır ancak Şekil 2 ' de, şekil 3, kullanılan lazer güç ayarlarını için Malzemeler tablo bakın ve Şekil 4. En iyi sonuçlar için 1024 x 1024 piksel çözünürlük kullanın. Ayarları aynı deneyi farklı koşullar sabit kalması gerekir. Gerekirse ek zum yöneticilerini.</li>
		<li>Boyama nerede bile derinliği değerlendirmek ve görüntü yığınları en az 8 eşit uzaklıkta edinme (250 nm) uçaklar. O zaman dilim başına ilgi aynı alan 3 bitişik temsilcisi görüntüleri yığınları almak. 
		Not: Derinlik bir dilimden diğerine farklı olabilir ama her zaman dilimi yüzeyinden yaklaşık 2-5 µm olmalıdır.</li>
		<li>En az 3 dilim koşul başına ve tedavi grubu başına 6-8 hayvanlardan edinme yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>Görüntü analizi. 
	Not: otomatik görüntü analiz yazılımı kullanın (bkz. Tablo malzeme). Diğerleri gibi ImageJ ücretsizdir, ancak Not bazı sistemleri bir lisans gerektirir. Kullanılan yazılım görüntüsü yığının tüm uçaklar dikkate alarak görüntüleri 3D analiz gerekir. Görüntü analizi ( şekil 1) kullanılan yazılım ayrıntıları için Malzemeler tablo bakın.
	<ol>Tüm sinaptik puncta ve el ile en iyi duruma getirilmiş ve yazılım içinde seçili nöronal işaretleyicileri tanımlamak için <li>kullanım yoğunluğu özel tabanlı eşik Protokolü [Bu içinde kullanılan belirli yazılımlar için Tablo malzemeleri görmek protokol]. 
		Not: Yazılımın her fluorophore için bir minimum ve maksimum yoğunluk tanımlar ve yoğunluk tanınan her nesne için bir yüzdesi ilişkilendirir. Yoğunluk yüzdesi kullanılan fluorophore göre değişiklik gösterir Not ve sinaptik marker karşı antikor.</li>
		<li>Sinaptik işaretler için boyut filtreleri olun (&#62; 0.1µm 3 ve &#60; 0.8µm 3) yazılım içinde seçilir ve görüntüye uygulanan. Seçili nesneleri değil örtüşen emin olmak için parametreleri ayarlayın. Çok büyük veya çok küçük sinaptik puncta dikkate alınması gereken herhangi bir nesne hariç (bkz. şekil 2B). 
		Not: en iyi duruma getirilmiş bir kez aynı eşik değerleri daha sonra verilen deney içinde tüm görüntüleri uygulanır.</li>
		<li>Ölçmek ortalama sayısı, yoğunluk ve bireysel sinaptik puncta (öncesi ya da sonrası sinaptik) hacmi yazılım içinde seçilen en iyi duruma getirilmiş eşik protokolleri kullanarak. Resim alanı (kabaca 16,928 µm 3 ' te burada kullanılan sistem) hacmi puncta sayıya normalleştirmek. Sinaptik puncta yoğunluğu için başvuru nöronal marker yoğunluğunu normalleştirmek. 
		Not: Sinapslarda öncesi ve sonrası sinaptik işaretçileri arasındaki ortak yerelleştirme olarak tanımlanır. Bir kez öncesi ve sonrası sinaptik puncta h eşik iletişim kurallarıAve oldu kurulmuş, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı sinaptik puncta co lokalizasyonu örtüşme 1 piksel veya daha fazla tek bir uçağı olarak belirlemelidir. 
		Not: istatistiksel analiz için tüm örnekleri kümesi normallik ve varyans, polimerlerin takip Lilliefords ve χ2 testleri, sırasıyla belirlenen onaylayın. Bir normal dağılım ve varyans polimerlerin gösteren örnekleri aşağıda açıklandığı gibi parametrik testler ile analiz edilmelidir. Örneğin, bir tek yönlü ANOVA kullanarak engelleme ve çoğaltma eksitatör sinaptik puncta analiz yapılmalıdır. Her bireysel deney bir taşı olarak düşünülmesi gereken; genellikle, çoğu üç bağımsız deneyler, her biri 1-3 fareler her durum.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Resim 1: sinaptik puncta görüntü analizi kullanılarak analizi yazılım. (a) Screenshot yoğunluğu eşik Protokolü özelleştirme. PSD-95, seçili puncta tanımlı bir boyutu var örnek verilmiştir olduğunu &#62; 0,1 µm 3 ve &#60; 0.8 µm 3 ve mevcut simge durumuna küçültülmüş örtüşen nesneler. Görüntü gösterilen bir confocal uçak daha kolay görsel olarak sinaptik puncta ve doğru parametre seçimi etkinleştirmek olduğunu unutmayın. (B) (en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı yelpazesi aşağıdaki) yazılım çıktı analizi ekran görüntüsü. Ham sinaptik puncta numara ölçümleri birim üzerinde temel bir örnek. Bu değerler daha sonra bir elektronik tablo yazılımı ihraç edilmektedir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Şekil 2: kalite kontrol sinaptik puncta dilim ve parametre ayarları. (A) temsilcisi confocal görüntüleri (40 x amaç) bölgenin ilgi: CA1 stratum radiatum (sr) ve tabaka oriens (yani) Hipokampal bir dilim tanımlanır MAP2 boyama tarafından. Ölçek çubuğu 2 µm. (B) Confocal resim = (60 x amaç ve bir ek 1.3 X büyütme edinme yazılım) CA1 stratum radiatum uyarıcı işaretler-vGlut1 (yeşil) ve PSD-95 (kırmızı),-Hipokampal dilimleri üzerinden. Net öncesi ve sonrası sinaptik puncta tanımlaması unutmayın. Puncta 0.8 µm 3 daha büyük miktar (beyaz ok) hariç. Ölçek çubuğu 2 µm (C) Confocal resim = (60 x amaç ve bir ek 1.3 X büyütme edinme yazılım) CA1 stratum radiatum uyarıcı işaretler-vGlut1 (yeşil) ile-tüm beyin üzerinden cryostat kesimli Hipokampal bölümlerden PFA içinde sabit. Büyük delikler ve düzensiz, olmalı vGlut1 boyama varlığını unutmayın. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+and+LTD%3A+an+embarrassment+of+riches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li>
<li>Arendt, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19390859">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li>
<li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694(2012).</li>
<li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+an+excitatory+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li>
<li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synapse+dynamics%3A+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li>
<li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li>
<li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li>
<li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory%2C+accumulation+of+Abeta%2C+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li>
<li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44(2016).</li>
<li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li>
<li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li>
<li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Dickkopf-1%2C+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway%2C+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer%27s+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li>
<li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li>
<li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li>
<li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li>
<li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302(2015).</li>
<li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnts+in+action%3A+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162(2013).</li>
<li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li>
<li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sinaps sayısı kesin değerlendirilmesi Nörolojik alana esastır. İşte, sinapslarda Hipokampal dilimleri CA1 stratum radiatum bölgede yoğunluk bir modeli sistem olarak değerlendirileceği nasıl göstermektedir. Mevcut yöntemler açısından önemi bizim son araştırma makalesinde Wnt eksikliği oluşur ve nerede Ayrıca synapse sayı değerlendirilip etkisi tek bölüm EM10tarafından gösterilmiştir. Sinaps zarar büyüklüğü tek bölüm EM ve beyin dilimli arasında benzer yöntem açıklanan burada10. Böylece, bu bulgu doğruluk ve güvenilirlik-in teknik gösterir.
Önemlisi, bir tek-bölüm EM ve burada anlatılan gibi immunostaining sinapslar, belirli beyin bölgesi için mutlak synapse numarası doğru tahmin yetersizlik kısıtlamasıdır. Gerçekten de, Toplam hacim değişiklikleri sinaptik numarası etkileyebilir gibi Genel morfolojik değişiklikleri belirlemek önemlidir. Belirli antikor olduğu gibi beyin bölgeleri, sinaptik bağlantıları aşırı yoğunluk nedeniyle kısmen boyama daha az verimli başka bir kısıtlamadır. Biz vGlut1 ve gephyrin en fazla 1 h, hemen tüm beyin PFA (şekil 2C) ve fiksasyonu ile karşılaştırıldığında bu dilim hazırlık ve sonraki PFA fiksasyon kullanarak daha yüksek kalitede boyama deneyimli. İkincisi olmalı sinaptik, delik doku ile boyama için yol açtı. Yine de, vGlut1 antikor penetrasyon hala her iki yöntem (mikron onlarca birkaç) sınırlıdır. Biz bu sınırlamayı aşmak değil, bile ile artan antikor kuluçka ama antikor penetrasyon sağlayarak yansıma toplam derinlik büyük, sonuç üzerinde herhangi bir etkisi olmalı. Ayrıca, özel boyama bile tüm alınan yığını olması için özen gösterilmelidir.
Bizim çalışmada, ayırt etmek inhibitör sinapslarda gelen eksitatör istedik. Bu proteinler yüksek yetişkin fare Hipokampus ifade edilir ve her synapse alt türü4,5' e özgü sonuç olarak, biz vGlut1/PSD-95 ve vGAT/gephyrin, sırasıyla, seçti. Diğer eksitatör ve inhibitör sinaptik işaretleri NMDA ve AMPA reseptör için de dahil olmak üzere her sinaps, zenginleştirilmiş reseptörleri gibi ilgili her synapse tanımlamak için kullanılan eksitatör ve inhibitör sinapslarda GABAA reseptörleri. Diğer nörotransmitter veya neuromodulators da belirli antikor dopaminerjik sinapslarda striatum22için gösterildiği gibi kullanılabilir, sağlamak bizim protokol ile tespit edilebilir. Ayrıca, 120 µm için her dilim kalınlığı azaltmak kısmen düşük miktar olan amigdala gibi küçük beyin yapıları araştırmaları zorunludur akut dilimleri ile elde edilen örneklerin üstesinden gelebilir.
Bizim Protokolü'nün gelecekteki uygulamalar farklı beyin bölgeleri ve bozuklukları çalışmada uygulamaya olabilir. Örneğin, striatum (Parkinson hastalığı ile ilişkili beyin bölgesi), vGlut2/PSD-95 veya vGlut1/PSD-95 afferents korteks veya talamus gelen gelen eksitatör sinapslarda arasında ayırt etmek için kullanılabilir, sırasıyla22.
Sonuç olarak, biz bir synapse tanımlamak için öncesi ve sonrası sinaptik işaretçileri kullanarak beyin dokularında sinapslarda sayısını incelemek için güvenilir bir yöntem göstermiştir. Kritik adımlar iyi Hipokampal dilimler, en fazla 1 saat PFA, yeterli montaj orta uygulanması, güvenilir antikor, uygun görüntü alma ayarları ve sıkı sinaptik puncta algılama kullanımı bir fiksasyon zaman hazırlanması içerir. Sonuçta, bu yöntem nispeten hızlı ve confocal mikroskop erişiminiz olan herhangi bir laboratuar tarafından kolayca tekrarlanabilir.

İnsan beyni yaklaşık 1014 sinapslarda oluşur. SYNAPSE numarası sıkı bir şekilde geliştirilmesi ve merkezi sinir sistemi (MSS) olgunlaşma sırasında düzenlenir. Geliştirme sinaps sayısı modüle synaptogenesis ve işlevsel nöron ağları oluşturmak için budama. Öğrenme ve hafıza synapse numarası ve gücü, sinaptik kullanılmasının muhtemelen ve depresyon1bilinen bir işlem Yönetmeliği tarafından desteklenir. Önemlisi, olgun sinapslarda istikrar nöronal ağ bağlantıları korumak için önemlidir. Ayrıca, açıkları synapse yoğunluğundaki nörodejeneratif koşulları Alzheimer hastalığı (Ah)2gibi erken aşamalarında bildirilmiştir. Bu nedenle, doğru bir şekilde belirlemek ve synapse numarası değerlendirmek için yetenek değerlendirme beyin fizyolojisi ve patoloji esastır.
Aşırı yoğunluk ve kompakt sinapslarda doğası yapmak o sağlam beyin alanlarda onların kesin sayısını tahmin etmek zor. MSS kimyasal sinapslar yakın appozisyon, bir sinaptik yarık3tarafından ayrılmış iki nöronlarda yapılır. Önceden sinaptik terminal veya sinaptik bouton, bir akson ortaya çıkar ve bir synapse özgüllük tanımlamak nörotransmitter içeren birikmiş veziküller oluşur — Yani, Glutamat ve gama - aminobütirikasit (GABA) için uyarıcı ve inhibitör synapses, anılan sıraya göre. Veziküller zarı veziküler taşıyıcılar için her nörotransmitter belirli içerir: Glutamat ve GABA veziküler GABA ışınlama (vGAT) için veziküler Glutamat ışınlama (vGlut). Post sinaptik terminal reseptörleri, adezyon molekülleri ve İskele proteinler de dahil olmak üzere birden çok proteinlerin oluşan son derece yoğun bir yapıdır. Eksitatör sinapslarda içinde post sinaptik yoğunluğu-95 protein (PSD-95) eksitatör N-methyl-D-aspartate(NMDA-) ve α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA-) reseptör modülasyonlu en bol iskele protein4olur işlev, ise inhibitör Post sinaptik terminal5inhibitör reseptörler gephyrin tutturur. Genel olarak, öncesi ve sonrası sinaptik bölmeleri protein özgüllük yardım farklılaşma ve synapse alt türlerinden tanımlaması.
Sinaps sayısı değerlendirilmesi farklı teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Elektron mikroskobu (EM), kompakt ve sağlam beyin alanlarda yüksek büyütme ve çözünürlük ile sinaps analizini sağlayan kullanımı yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu teknik çok pahalı, karmaşık numune hazırlama için ve çok zaman alıcıdır. Diğer teknikleri Çözümlemeyi gerçekleştirmek için özel ve pahalı donanımları gerektirir ki büyük bir dezavantajı vardır dizi tomografi6, kullanımını içerir. Ayrıca, transgenik hatları belirli sinaptik işaretleri ifade synapse sayı7, değerlendirilmesi yararlı, ancak yeni satırlar nesil kısıtlayıcı ve pahalı olabilir ve proteinlerin overexpression istenmeyen off-hedefini neden olabilir fenotipleri.
Bu sınırlamalar nedeniyle ve basitlik için pek çok araştırmacı sinaps sayısı toplam sinaptik protein düzeyleri incelenerek değerlendirin. Ancak, sinaps kaybı protein, önemli değişiklikler önce öncesi ya da sonrası sinaptik appozisyon, dağılma sinaptik proteinler hiçbir bozulma ile sinaptik remodeling sonuçlarında yapısal olarak görülebilir. Ayrıca, reklam, azaltılmış aşağıdaki synapse dejenerasyonu veya nöronal ölüm8,9sinaptik protein düzeyleri vardır. Toplam düzeyleri miktar bu ayrım etkinleştirmez. Böylece, beyin sinaps sayısında değerlendirilmesi için bir güvenilir, erişilebilir ve doğru yöntem geliştirmek için gerek yoktur.
Bu makalede, biz iyice tanımlamak ve Hipokampal kemirgen beyin dilimler halinde ayirt mikroskobu kullanılarak sinapslarda sayısını belirlemek nasıl açıklar. Sinapsların colocalization öncesi ve sonrası sinaptik işaretlerinin punctate bir dağıtım içinde görünen tarafından tanımlanır. Biz bu teknik Wnt sinyal beyinde incelenmesi yoluyla geçerliliğini göstermek. Wnts salgılanan proteinler önemli oluşumu, ortadan kaldırılması ve sinapslarda bakımı için önemlidir. Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), salgılanan antagonist vivo içinde indüksiyon Hipokampus10inhibitör sinapslarda koruyarak eksitatör sinaptik kaybına neden. Kimlik ve Dkk1 ifade bir yetişkin fareden Hipokampal dilimleri eksitatör ve inhibitör sinapslarda sayısını göstermek ve doku/kültür ürünleri diğer türleri için bu teknik Aktarılabilirliği vurgulayın.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Primer antikor</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Primer antikor</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Primer antikor</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Primer antikor</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Birincil antikor</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Eşek Anti-Kobay Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Eşek Anti-Tavşan Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 60x 1.35 sayısal açıklık (NA) yağ objektifi kullanan konfokal mikroskop. vGlut1 için,% 14 yüzde gücüne sahip bir 488 lazer kullanın. PSD-95 için% 20 yüzde gücüne sahip bir 559 lazer kullanın.</td></tr><tr><td>Analiz yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Süper Tutkal</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>%95 O2, %5 CO2</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>Silindir</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Cam kaydıraklar</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>08-1.0mm kalınlığında</td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1 fareleri</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fareler, tetO Dkk1 transgenik farelerin CaMKII & alfa; rtTA2 transgenik farelerle çaprazlanmasıyla elde edildi. TetO Dkk1 transgenik fareler ve CaMKII&alfa; rtTA2 heterozigot bir durumda çaprazlandı. Her iki fare hattı da C57BL/6J arka planında yetiştirildi. Kontrol olarak tek transgenik ve WT littermat kullanıldı.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Çözümler için reaktifler:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca2Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg2Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Kinürenik asit</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pirüvik asit</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Eşek</td><td>Serumu Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi synapse değerlendirilmesi

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Beyinde, sinapslar arasındaki güç ve nöronal sinyal yaymak belirlenmesi, özel kavşaklar vardır. Sinapsların sayısı sıkıca geliştirme ve nöronal olgunlaşma sırasında düzenlenir. Önemlisi, açıkları sinaps sayısı için bilişsel işlev bozukluğu neden olabilir. Bu nedenle, sinaps sayısı değerlendirilmesi Nörobiyoloji ayrılmaz bir parçasıdır. Ancak, sinapslarda sağlam beynini küçük ve çok sık olarak, mutlak sayı değerlendirilmesi zordur. Bu iletişim kuralı kolayca tanımlamak ve sinapslarda ayirt mikroskobu kullanılarak Hipokampal kemirgen dilimleri içinde değerlendirmek için bir yöntem açıklanır. Bu yüksek kaliteli confocal mikroskobu görüntülerde sinapslarda Hipokampal dilimleri öncesi ve postsinaptik proteinlerin co yerelleştirme analiz ederek değerlendirmek için üç adım yordam içerir. Nasıl analiz gerçekleştirilir ve eksitatör ve inhibitör sinapslarda temsilcisi örnekler verir da açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı sinapslarda analiz için sağlam bir temel sağlar ve araştırma yapısı ve işlevi beynin herhangi bir araştırma için uygulanabilir.

SYNAPSE kaybı oluşur AD gibi nörodejeneratif hastalıklarda erken ve Parkinson hastalığı2,11,12. Ancak, bu açıkları temel moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Wnt sinyal içinde eksiklikleri reklam13,14,15,16,17ile ilişkilendirilmiştir. Wnts salgılanan glikoproteinlerin ve synapse oluşumu ve sinaptik iletimi18,19,20,21modülasyon önemli bir rol oynamak. Son zamanlarda, Wnts olgun sinir sistemi10,22sinaptik bakım anahtar düzenleyiciler olarak tanımlanan. Doğru bir şekilde genetik fareler Hipokampus sinapslarda üzerinde Wnt sinyal etkisi çalışma için biz bir beyin dilim hazırlık ve confocal mikroskobu synapse numarasındaki değişiklik değerlendirmek için kullandı. Biz sağlıklı dilimleri yapısı iyi tespit (şekil 2A) korunmuş. Ayrıca, sinaptik puncta yelpazesi dikkatle, muhtemelen toplanan proteinler (şekil 2B) temsil eden büyük lekeli nesneleri dışlama ile tanımlanmıştır. Bu ölçüt tüm görüntülerle aynı sıkı analiz parametrelerini uygulandı.
Biz yetişkin salgılanan Wnt antagonisti Dkk1 ifadesi indükler bir transgenik modeli sistemi kullanılan fare (iDkk1) tetrasiklin altında kontrol (bakınız Tablo reçetesi)10,22. Biz yetişkin Hipokampus Wnt sinyal abluka eksitatör synapse kaybı özellikle bölgede CA1 stratum radiatum (şekil 3) tetikler gösterdi. Şekil 3A temsilcisi confocal görüntüleri eksitatör öncesi ve sonrası sinaptik işaretleri gösterilmektedir (vGlut1 ve PSD-95, sırasıyla) onların ilgili denetimlerin yanı sıra iki hafta için Dkk1 ifade iDkk1 farelerin Hipokampal dilimleri üzerinden satın aldı. Biz bu görüntüleri Volocity yazılım kullanarak analiz ve vGlut1 ve PSD-95-etiketli puncta takip iDkk1 farelerin Hipokampus CA1 bölgesindeki co yerelleştirme tarafından sayısal eksitatör sinapslarda sayısı önemli bir azalma gösterdi iki haftadır Dkk1, indüksiyon (şekil 3B, * p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 6 fare genotip başına). CA1 stratum radiatum eksitatör sinaps puncta numarası 1000 µm3 başına 500 denetim farelerde iDkk1 farelerde 300'e düşürüldü. Buna ek olarak, indüklenen Dkk1 ifade inhibitör sinapslarda (öncesi ve sonrası sinaptik işaretleri vGAT ve gephyrin, arasında ortak yerelleştirme sırasıyla, olarak tanımlanır) şekil 4A-B gösterilen sayısını etkilemez mi (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 3 fare genotip başına).
Önemlisi, dilimleri ve hayvanlar sağlam bu sonuçlar üretmek için gereken uygun sayısını tahmin etmek için bir istatistiksel güç analizi yapılır. R kullanarak, biz koşul başına yaklaşık olarak 35 dilimleri ihtiyaç vardı hesaplanır (3 resim x 3 dilim x 6 hayvanlar 36 =) bir büyük etkisi boyutu algılamak için (f = 0,4) % 80 güven ile (güç 0.8 =) engelleme ve çoğaltma ile tek yönlü ANOVA içinde açıklandığı gibi adım 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Şekil 3: iDkk1 fareler gelen Hipokampal dilimleri içinde eksitatör sinapslarda kaybı. VGlut1 ve PSD-95 (beyaz ok) arasında ortak yerelleştirme tarafından tanımlanmış CA1 stratum radiatum gösteri eksitatör sinapslarda,(a)temsilcisi confocal görüntüleri. Alt paneli daha yüksek büyütme vurgulu dikdörtgen temsil eder. Ölçek çubukları 2 µm denetimi ve iDkk1 arasındaki eksitatör sinapslarda yüzdesi sayısal Malzemeler tablo içinde belirtilen yazılım kullanarak. (B) = (* p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 6 fare genotip başına). Verileri temsil ± SEM vardır Bu rakam başvuru10değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Şekil 4: inhibitör sinapslarda iDkk1 fareler Hipokampal dilimler halinde değişmeden. (A)temsilcisi confocal görüntülerini inhibitör sinapslarda vGAT ve gephyrin (beyaz ok) arasında ortak yerelleştirme tarafından tanımlanmış CA1 stratum radiatum. Alt paneli daha yüksek büyütme vurgulu dikdörtgen temsil eder. Ölçek çubukları 2 µm. (B) = Volocity yazılımını kullanarak sayısal olarak kontrol ve iDkk1 fareler arasında inhibitör sinapslarda yüzdesi (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 3 fare genotip başına). Verileri temsil ± SEM vardır Bu rakam başvuru10değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yüksek Sükroz ACSF bileşenleri</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Notlar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic asit</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirüvik asit</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glikoz</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sükroz</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batık odası ACSF bileşenleri</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		
		<tr>
			<td>D-glikoz</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tablo 1: ACSF kompozisyon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabellek engelleme/permeabilizing</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Notlar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eşek serum</td>
			<td>% 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>% 0.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH 7,4 için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>%4 PFA/4% sükroz</td>
			<td></td>
			<td>pH 7,4 için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>10 x sulandırmak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İNGİLTERE'DE YILIN</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sükroz</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: immünfloresan boyama için kullanılan arabellekleri.

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Bu immünboyama protokolünün genel amacı, ex vivo beyin kesitlerindeki sinaptik yoğunluğu değerlendirmektir. Bu yöntem, nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve nörodejeneratif hastalıklarda gözlemlenen sinaps yoğunluğu değişikliklerini incelemede faydalıdır. Bu tekniğin temel avantajı, aynı zamanda hazırlanan deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilecek yarı kantitatif bir sinaps yoğunluğu tahmini sağlamasıdır.İşleme fare beynini bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Ardından, beynin orta hattı boyunca hemiseksiyon yapmadan önce, serebellumu ve frontal korteksin küçük bir bölümünü bir bistüri ile çıkarın. Yarım kürelerden birini yeni kesilen tarafı üzerine gelecek şekilde döndürün ve bir vibratom tablasına yapıştırın.Mikrotom haznesine buz gibi soğuk ACSF dökün ve solüsyonu oksijenlendirin. İlgi alanının tamamından 200 ile 300 mikron kalınlığında kesitler alın. Hipokampus için, her yarım küreden yaklaşık üç ila dört kesit elde edilmelidir.Kesitleri, oksijenle zenginleştirilmiş ACSF içine daldırılmış sıcaklık kontrollü bir hazneye aktarmak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın. 30 dakika boyunca 34 °C'de tutun. 30 dakika geçtikten sonra, kesitleri %4 sükroz içeren %4 paraformaldehit bulunan 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve oda sıcaklığında 20 dakika ile bir saat arasında sabitleyin.Fiksasyonun ardından, kesitleri üç kez 10'ar dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın. İmmünofloresan boyamaya başlamak için, kesit kuyucuklarındaki PBS'yi bloklama ve permeabilizasyon tamponu ile değiştirin ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında dört ila altı saat inkübe edin. Bloklama adımının sonuna doğru, vGlut1 antikorunu bloklama ve permeabilizasyon tamponu ile 1:2.000 oranında seyreltin.Lütfen bu dilüsyonun, kullanılan antikorun şirketine ve lotuna bağlı olarak farklılık gösterebileceğini unutmayın. Kesitleri bir gece boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta primer antikor solüsyonunda inkübe edin. Güçlü hareketli bir çalkalama platformu kullanın.Optimal boyama için primer ve sekonder antikorların eşit dağılımı önemlidir. Deneyimlerimize göre, güçlü şekilde çalkalama işlemi en iyi antikor penetrasyonunu sağlar. Primer antikor ile inkübasyonun ardından, dilimleri daha önce yapıldığı gibi her seferinde 10 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkayın.Son yıkama sırasında, uygun sekonder antikorları bloklama tamponu ile 1/500 oranında seyreltin. Ardından, kesitleri bu solüsyonda oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe edin. Sekonder antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, kesitlerin ışıktan korunduğundan emin olun.Kesitleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, bir fırça yardımıyla kesitleri 24 kuyucuklu plakadan dikkatlice çıkarın ve önceden etiketlenmiş cam lamlar üzerine eşit şekilde yerleştirin. Her kesitin üzerine bir damla montaj medyumu ekleyin. Ardından, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek kesitlerin üzerine nazikçe bir cam lamellek kapatın.Işıktan koruyun ve lamların oda sıcaklığında en az üç ila dört gün kurumasını bekleyin. Lamları kısa süreli saklama için 4 °C'de saklayın. Uzun süreli saklama için ise -20 °C'de muhafaza edin.Görüntüleme yapılacak hipokampus bölgesini, bu durumda CA1 piramidal nöronları ile Schaffer kollateral aksonları arasındaki sinapsları belirlemek için 10x veya 20x objektif kullanarak başlayın. 40x veya 63x yağ daldırma objektife geçin ve sürekli nöritleri ve organize bir yapıyı belirleyerek kesit anatomisinin bozulmamış olduğundan emin olun. Referans olarak MAP2 gibi bir nöronal marker kullanın.1.024 x 1.024 piksel çözünürlükle optimal sinyal ve kontrast elde etmek için her bir kanalın ayarlarını düzenleyin. Herhangi bir pikselin doyuma ulaşmasını önlemek için her bir lazerin yoğunluğunu ayarlayın. Boyamanın homojen olduğu derinliği değerlendirin ve ardından yazılımı, birbirine eşit uzaklıkta en az sekiz adet 250-nanometre düzlemden oluşan görüntü yığınları edinecek şekilde ayarlayın.Ardından, kesit başına aynı ilgi alanından yan yana üç temsilci görüntü yığını alın. Görüntüleme işlemini, koşul başına en az üç kesitte ve tedavi grubu başına altı ile sekiz hayvan arasında tekrarlayın. Eksitatör sinapslar, yüksek büyütmeli görüntüdeki beyaz oklarla belirtildiği gibi, vGlut1 ve PSD95 arasındaki kolokalizasyon ile tanımlanabilir.Wnt antagonisti Dkk1'in indüklenmesi yoluyla yetişkin hipokampüsünde Wnt sinyalizasyonunun bloke edilmesi, özellikle CA1 stratum radiatum bölgesinde eksitatör sinaps kaybını tetikler. Kontrol ve iDkk1 fareler arasındaki eksitatör sinaps yüzdeleri nicelleştirilmiş ve iDkk1 transgenik hayvanlarda anlamlı derecede daha düşük olduğu bulunmuştur. İnhibitör sinapslar, vGat ve Gephyrin arasındaki kolokalizasyon ile tanımlanabilir.Kontrol ve iDkk1 fareleri arasındaki inhibitör sinapsların yüzdesi nicelendirilmiş ve anlamlı bir fark saptanmamıştır. Bu prosedürü uygularken, kesitlerle mümkün olduğunca dikkatli davranmaya özen göstermek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, ex vivo beyin kesitlerinde sinaptik yoğunluğun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, sıçan ve transgenik farelerin hipokampal dilimler sinaptik değişiklikler, beynin yaşlanma ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı ile ilgili çalışma için hazırlamak için prosedürler sıralanıyor.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Kaynak: McLeod, F.,  et al. Hipokampal Kemirgen Beyin Dilimlerinde Sinaps Yoğunluğunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, konfokal immünofloresan analizi kullanarak hipokampal beyin dilimlerinde sinaptik belirteçleri görselleştirmek için bir yöntemi göstermektedir. Dilimler, presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedef alan primer antikorlarla immün boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Etiketli belirteçler daha sonra sinaptik mimariyi kolokalizasyonları...

İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Bu video makalesinde, kemirgenlerden alınan akut hipokampal dilimler kullanılarak CA1 piramidal nöronlarında sinaptik etiketleme, yakalama ve çapraz etiketleme gibi uzun vadeli plastisiteyi ve ilişkisel süreçlerini incelemek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Alzheimer hastalığının bir özelliği Aβ yükseklik.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Öğrenin, fare hipokampal kesilerinde sinaptik yoğunluğu değerlendirmek için immünofloresan tekniklerini. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklardaki sinaptik değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet