Name: Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Keşfedin monosit altgruplarının akış altında davranışlarını in vitro ortamda konfokal floresan mikroskobisi ile. Bu yöntem, iltihaplanma ve immünoloji araştırmalarında lökosit göç mekanizmalarını anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Paul Bradfield okuma el yazması ve geri bildirimler için teşekkür ederiz. A. S., efendim Jules Thorn hayırsever yurtdışı güven trafiğe çıkış mali destek aldı.

İnsan malzemeler ile aydınlatılmış onam gönüllü bağış ve İsviçre etik komiteler klinik araştırma uygun olarak kullanılmıştır.
1. izolasyon ve insan göbek dondurulması damar endotel hücreleri (HUVEC)
<ol><li>5 mL kaplama çözeltisi (0.1 mg/mL kollajen G ve fosfat tamponlu tuz PBS pH %7,4 0,2 jelatin) T75 şişesi için 37 ° C'de 30 dk HUVEC yalıtım işlemini başlatmadan önce ekleyin.</li>
	<li>PBS sahip kablo temiz, steril kompres ile silin ve bir steril 20 cm Petri kabına yerleştirin. Kablonun ucu steril makasla kesme.</li>
	<li>Tek büyük damar ve iki küçük arterlerin tanımlar. Yavaşça bir kanül kendisine ven ekstremitelerde kordon ucunda içine iliştirilmiş bir üçlü stopcock yerleştirin.</li>
	<li>Kablo ve tel uzunluğu ile sıkıca kanül bağlantı sıkın.</li>
	<li>İki kez 20 mL ile kordon RPMI orta 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve 250 ng/mL kordon 's damarlar yıkamayı Amfoterisin B içeren sıvı. Bu işlem daha beyaz ve daha net kablosunu görünümünü sağlar. Ven collagenase ek Önce bir ucunda bir şırınga RPMI toplayarak boş.</li>
	<li>Ven ile 1 mg/mL collagenase türü 12 mL sıvı ben (0,22 µm filtre).</li>
	<li>Yakın stopcock, göbek bağını sona erer ve kordon 12 dk için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Yavaşça endotel hücrelerinden damar lümen ayırmak için kordon masaj.</li>
	<li>30 mL % 10 fetal buzağı serum 50 mL şırınga içeren RPMI almak ve göbek kordonu bir ucunu bağlayın.</li>
	<li>Bir boş 50 mL şırınga göbek kordonu diğer ucunu takın</li>
	<li>Stopcock açın ve damar bir ucundan diğer ucundan karşılıklı toplama iken sıvı. Not: Toplanan süspansiyon endotel hücreleri içerir.</li>
	<li>Bu hücre süspansiyon 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atmak ve hücre Pelet tam M199 Orta (M199 içeren % 20 FCS, 15 µg/mL endotel hücre büyümesini takviyeleri, 100 µg/mL heparin sodyum, 0.5 µM hidrokortizon, 10 µg/mL L-askorbik asit, 100 U/mL penisilin, 100 U/mL 10 mL ile resuspend streptomisin ve 250 ng/mL Amfoterisin B).</li>
	<li>Kaplama çözüm T75 balonun kaldırmak ve bir kez PBS ile durulayın.</li>
	<li>Tohum hücreleri T75 şişesi adım 1,13 toplanan ve % 5 CO237 ° C'de kuluçka yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, şişeye kalan kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve sonra Orta 2 günde izdiham kadar değiştirmek için 3 kez tam M199 orta ile yıkayın.</li>
	<li>% 80-90 izdiham, HUVEC monolayer kez 5 mL de PBS ile durulayın ve 5 mL 1 mM EDTA M199 5 dk. eklemek 4 mL ve 1 mL tripsin eylemi durdurmak için FCS için 37 ° C'de % 0.05 tripsin de hücrelerle bağlantısını kesin. Tüm HUVEC ayırmak için şişeye boşalt.</li>
	<li>Bir aliquot VE-cadherin, PECAM-1 ve gp38 boyama için kullanılan ve HUVEC saflık kontrol etmek için akış sitometresi tarafından çözümlemek için 50 µL toplamak.</li>
	<li>HUVEC kalan 200 x g oda sıcaklığında 5 min için adımda 1,18 15 mL tüp ve santrifüj toplamak.</li>
	<li>Adım 1.19 süpernatant atmak, 5 x 105 hücre/mL cryotubes yoğunluğu, çözüm (FCS % 10 DMSO içeren) dondurma hücre Pelet resuspend ve-80 ° C'de veya sıvı azot kullanımı kadar dondurmak.</li>
	<li>
HUVEC saflık denetlemek için:
	<ol>
<li>Anti-insan VE-cadherin-FITC antikor 1 µL, Anti-insan PECAM1-PE antikor 1 µL ve anti-insan Podoplanin-APC antikor 1 µL 1,18 adımda toplanan HUVEC 50 µL aliquot ekleyin.</li>
		<li>10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>PBS ve santrifüj 100 µL 400 x g 30 eklemek s.</li>
		<li>Süpernatant atın ve PBS 100 µL içinde resuspend. Veri akış sitometresi teknikleri tarafından şimdi elde edilebilir. Not: HUVEC VE-cadherin ve PECAM-1 için pozitif ve negatif Podoplanin için.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HUVEC buz çözme
Not: HUVEC düşük geçiş deneyler için (en fazla 5 pasajlar) kullanın.
<ol><li>Bir T75 şişesi 1 mL 30 dk 37 ° C'de kaplama çözeltisi ile kat.</li>
	<li>Hızla 2 min için 37 ° C'de HUVEC defreeze ve tam M199 10 mL hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Hücreleri 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Hücre Pelet tam M199 10 mL resuspend.</li>
	<li>Önceden kaplanmış şişeye hücre süspansiyon aktarın. Kuluçka %5 CO237 ° C'de şişeye koyun. Hücre kültür orta 2 günde değiştirin.</li>
</ol>3. HUVEC kültür 0.4 µ-slayt odasında
<ol><li>Akış deney başlamadan önce beş gün önceden 0.4 µ-slayt chambers ile 0.1 mg/mL kollajen G, 30 dk 37 ° C'de % 0,2 jelatin içeren PBS 30 µL kat.</li>
	<li>Chambers PBS 100 µL ile yıkayın.</li>
	<li>Bir T75 şişesi bir % 80 – 90 konfluent HUVEC hücrelerden bağlantısını kesin.</li>
	<li>PBS ile 5 mL HUVEC durulama ve onları 5 mL 5 min için 37 ° C'de % 0.05 tripsin ile bağlantısını kesin.</li>
	<li>Temizleme ve tam M199 hücre süspansiyon toplamak ve en uygun yöntemi tarafından hücreleri saymak. 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre Pelet 106 hücre/mL resuspend ve oda başına 30 µL (30.000 hücreleri) dağıtın.</li>
	<li>1s için % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>Tam M199 150 µL her odasına ekleyin ve kuluçka CO237 ° C ve % 5, 5 gün boyunca hücreler kültür. Orta 2 günde değiştirin.</li>
</ol>4. HUVEC monosit işe alım tahlil akış altında için boyama
<ol><li>M199 ve CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) 1 µM etiketleme orta hazırlamak ve 5 min için 37 ° C'de hücre etiketleme önce sıcak.</li>
	<li>37 ° C'de yıkama HUVEC M199 orta ile iki kez ısındı</li>
	<li>Orta CMFDA 1 µM içeren ısıtılan etiketleme orta 30 µL ile değiştirin ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 10 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Bir kez yıkama ile tam M199 ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka 30 dk için tam M199 hücrelerle kuluçkaya. Not: Serum etiketleme çözüm eklenmesi önce tüm izlerini silmek önemlidir, aksi takdirde HUVEC boyama değiştirebilir.</li>
	<li>Her iki insan TNFα içeren orta tam M199 ile değiştirin (500 U/mL) veya insan TNFα karışımı (500 U/mL) insan VEGFA ile (1 µg/mL) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO26 h için.</li>
</ol>5. yalıtım insan Pan monosit ve altgrupları boyama
<ol><li>Yoğun insan kanı buffy bir kat veya 20 mL EDTA Tüp tüpler deneyde gününde toplanan taze izole insan kanı kullanın.</li>
	<li>PBS-1 mM EDTA (1:1) kanda sulandırmak ve yavaşça seyreltilmiş kan yoğunluk gradient medya 20 mL üstüne 20 mL pipet. Vasıl 400 x g oda sıcaklığında yavaş hızlanma ve fren olmadan 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) toplamak-(arasında yoğunluk gradient medya ve plazma katmanları) trombosit katmanına 40 mL PBS - 1 mm EDTA içeren yeni bir 50 mL tüp. 50 mL PBS - 1 mM EDTA ile top.</li>
	<li>5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet boyama arabellek (1 mM % 0.5 Sığır serum albümin BSA içeren PBS - EDTA) 10 mL ile resuspend.</li>
	<li>5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak.</li>
	<li>5.5 ve 5.6 adımları yineleyin.</li>
	<li>Hücre Pelet arabellek boyama 10 mL ile resuspend. 10 µL hücre sayısı için bir aliquot almak.</li>
	<li>PBMC nüfus kontrol edin ve hızla bir akış sitometresi içeren hücreleri saymak. Not: Karakteristik lenfosit ve monosit nüfusu (Şekil 1A) görülebilir. Hakkında taze insan kanı 50 mL bekliyoruz 50-100 10 x6 PBMC.</li>
	<li>
CD14 + karşı CD14-PBMC akış altında alımı için:<ol>
<li>Üç kez ile akış arabellek Pelet yıkayın (M199% 0.5 BSA içeren) ve akış arabellek, 6 x 10 mL başına6 hücre mononükleer hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Her tahlil için 200 µL aliquots olun. Önce tahlil 20 dk kadar 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>5 µL anti-CD14-PE ve Höchst 33342 2 µM son bir konsantrasyon, her aliquot için ekleyin. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 200 µL ile resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monosit altgrupları akış altında alımı için:<ol>
<li>Monosit üretici yönergelerine uygun bir pan monosit izolasyon kiti ile izole et. Not: Aşağıdaki yalıtım 50 x 106 hücreler için protokolüdür. Üreticinin önerilerini içinde olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.</li>
		<li>PBMC süspansiyon 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Pelet arabellek boyama 400 µL ile resuspend.</li>
		<li>50 µL Fc reseptör engelleme reaktif ve Pan monosit antikor kokteyl 50 µL ekleyin.</li>
		<li>10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Tampon ve manyetik boncuklar konjuge anti-biotin antikor 100 µL boyama 400 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Boyama arabellek 2 mL ekleyin ve bir mıknatıs ile birleştiğinde bir MAC'ler LS sütun kullanın.</li>
		<li>LS sütun üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve tampon boyama 1 mL ekleyin. Akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>PBMC süspansiyon sütunda geçmek ve yeni 15 mL tüp içinde pan monosit içeren rağmen açık akış toplamak.</li>
		<li>5 mL top için boyama tampon ekleyin.</li>
		<li>Bir aliquot alın ve monosit yalıtım akış sitometresi ile kalitesini kontrol edin.</li>
		<li>Pan monosit sayısı belirler. Not: Sadece monosit nüfus (Şekil 1B)görülebilir.</li>
		<li>Monosit adım 5.11.11 200 x g 5 min için de geri kalanı santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atmak.</li>
		<li>Hücre Pelet akış arabellek 5 mL resuspend (M199% 0.5 BSA içeren).</li>
		<li>5.11.13-5.11.14 iki kez EDTA herhangi bir iz ortadan kaldırmak için yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monosit süspansiyon akışında olun 6 x 106 hücre/mL tampon (M199% 0.5 BSA ile).</li>
	<li>Monosit her işe alım tahlil için 200 µL aliquots olun.</li>
	<li>Enjeksiyon önce 20 dk kadar kuluçka 37 ° C'de aliquot devam et.</li>
	<li>Anti-CD16-PE antikor ve Höchst 33342 (son 2 µM) 5 µL her aliquot için ekleyin.</li>
	<li>Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s.</li>
	<li>Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 250 µL ile resuspend.</li>
	<li>30 µL monosit süspansiyon confocal mikroskobunun edinme parametreleri ayarlamak için kullanılmak üzere slaytı bir odası ekleyin.</li>
	<li>Adım 5,18 37 ° C'de monosit süspansiyon aliquots engellemek Not: Bu süspansiyon akış sisteminde enjekte edilir hazırdır.</li>
</ol>6. sıvı sistemi hazırlanması
<ol><li>37 ° C'de ayarla görüntüleme için hücre kuluçka sağlamak Not: Akış sistemi bir diyagram Şekil 2' de gösterilmiştir.</li>
	<li>Boru bölüm ı: araya bir radarı bağlayıcı erkek (8 cm uzun ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir parça bir ucunu takın ve diğer ucunu bir satır içi radarı enjeksiyon kümesine bağlayın. Silikon (40 cm ve 3 mm kalınlığında) boru bir parça için ikinci radarı konektörüne takın bir ucunda. Not: İsteğe bağlı olarak, bir 5 mL şırınga bağlı bir 3-yollu musluk hatlı radarı enjeksiyon kümesi ve nihai hava kabarcık Temizleme için boru silikon arasında eklenir.</li>
	<li>Araya boru Bölüm II: 20 mL şırınga (1 m uzunluğunda ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir uzunluğu bir ucunu bağlayın. Radarı bağlayıcı erkek tüp diğer sonuna yerleştirin.</li>
	<li>Bağlanmak bölüm ı ve II boru radarı bağlayıcı erkek bir kadın radarı kilit bağlaştırıcı (Şekil 2A) için ekleyerek bölüm.</li>
	<li>Havzanın 37 ° C'de ısındı akış arabellek (M199 + %0.5 BSA) içeren silikon tüp Ücretsiz sonu koymak</li>
	<li>Boru akış arabellek ile doldurmak için pistonu 20 mL şırınga üzerinde çek.</li>
	<li>Şırınga pompa yerleştirin ve güvenli.</li>
	<li>Pompa ayarla içinde modu olarak demleyin (karşı) çekilme ve akış hızını belirtin.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak kullanılan IBIDI slayt göre akış hızı belirleyin: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58509/58509eq1.jpg"> Not: Slayt faktör deneme için kullanılan IBIDI slayt bağlıdır. Μ-slayt için ben0,4 slayt faktör Bu örnekte kullanılan radarı kilit 131.6 olduğunu. Belirli slayt faktörler için bkz şirket web sitesi14. Akış arabellek viskozite 0.0072 dyn.s/cm2' dir. Yamultma stres sonrası kapiller venüller hakkında 0.5 dyn/cm2' dir.</li>
	<li>
Slayt (Şekil 2B) Bağlan:
	<ol>
<li>Silikon tüp kadın radarı kilit Coupler çevresinde kelepçe ve iki radarı bağlayıcı erkek bağlaştırıcı kesin.</li>
		<li>Onları teşvik HUVEC ve orta ile dolgu içeren slayt rezervuarlar bağlayın. Hava kabarcıkları bu adımı sırasında kaçının.</li>
		<li>Kelepçeler almak ve bağlantı değil sızdırıyor emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme için mikroskop altında slayt yerleştirin ve pompa başlar.</li>
</ol>7. zaman hata görüntüleme akış tarafından Confocal mikroskobu altında monosit alımı
<ol><li>40 x objektif kullanın (bkz. Tablo reçetesi) görüntüleme için.</li>
	<li>405 etkinleştirmek nm (mavi monosit çekirdeği), 488 nm (yeşil endotel hücreleri) ve 561 nm (kırmızı CD16 + alt) lazerler.</li>
	<li>Satın alma parametrelerini ayarlamak için monosit içerir odası kullanın. Not: Sigara transmigrated hem transmigrated monosit algılamak için iğne deliği ve lazer 405 nm yoğunluğu yüksek ayarlanır. Böylece, transmigrated monosit biraz bazal planında görünür. Ancak tek transmigrated monosit yeni yer altında endotel hücreleri meşgul karşılık gelen çekirdek çevresinde günahı bir alan mevcut.</li>
	<li>Mikroskop altında elde edilebilir için bir yer odası.</li>
	<li>Views 1 cm çapındaki çok pozisyonlu confocal görüntüleme için 3 alanı seçin.</li>
	<li>Bazal ve endotel hücrelerinin apikal kenarlarında tanımlamak</li>
	<li>Bir z-yığın 10 – 12 µm aralığı (0.5 µm adım) ayarlayın. Hızlandırılmış bir kazanım her 1dk çalıştırın.</li>
	<li>Görüntüleme 3 dk sonra 200 µL monosit süspansiyon (6 x 106 hücre/mL), satır içi radarı enjeksiyon bağlantı noktası yoluyla enjekte et. Not: Hızla monosit apikal odak düzlemi içinde görünür, uygun ve hicret (üretim emrindeki apikal bazal planı) başlatın.</li>
	<li>Görüntü için en az 30 dakika. Bir kez bitmiş, görüntüleme durdurmak ve akışını durdurmak. Slayttan bağlantısını kesmek için boru kelepçe.</li>
	<li>Slayt 10 dk 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde ile düzeltmek.</li>
	<li>Slayt PBS ile yıkayın ve slayt gerekirse daha fazla çözümleme için 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>8. ImageJ verilerle analiz
<ol><li>Her alandaki toplam yapisan monosit saymak. Mm2başına hücre sayısı belirler.</li>
	<li>Bazal planı endotel hücreleri altında bulunması ve bir kara delik (yeşil kanal) çekirdek çevresinde varlığı ile saptanan transmigrated monosit saymak.</li>
	<li>Yapisan lökosit sayısı tarafından transmigrated lökosit sayısı bölün. Hicret oranı yapisan monosit yüzdesi olarak sunulur.</li>
	<li>Gösterim amacıyla, apikal ve bazal iki tarafın aynı anda her endotel bu bölmeleri içinde gerçekleşen olayları göstermek için gösterilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Monocytes%3A+Development%2C+Heterogeneity%2C+and+Relationship+with+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li>
<li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li>
<li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355(2018).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li>
<li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163%E2%88%92+and+CD163%2B+monocytes+into+functional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li>
<li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li>
<li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+%28TEMs%29+in+human+peripheral+blood+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li>
<li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li>
<li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li>
<li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Shear+Stress+and+Shear+Rates+for+ibidi+%C2%B5-Slides+-+Based+on+Numerical+Calculations%22">Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations</a>. , (2014).</li>
<li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1%2C+VCAM-1%2C+and+IL-8+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).</li>
<li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+%28Vestweber+series%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li>
<li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679(2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Burada, bir yöntemi nasıl monosit altgrupları iltihaplı endotel monolayer transmigrate bir çalışma ayrıntılı raporu. Confocal mikroskobu Ayrıca monosit işe akışı3,11,19altında incelemek için kullanılır faz kontrast mikroskobu yerine kullanılan çok tartışılan yöntem. Confocal Mikroskopi için hızlandırılmış Imaging'i kullanma bir büyük avantajı belirsizliğe yer bırakmadan hicret ve güçlü yapışma monosit arasında ayırımcılık için y...

Hasarlı doku, anjiogenez ve kanser1,2,3 de dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi temizlik patojenler, kavga ettiği için esastır doğuştan gelen bağışıklık fagositik bileşeni monosit teşkil . Monosit, kanda dolaşan, ancak periferik doku iltihabı site için belirli moleküler mekanizmalar aracılığıyla işe heterojen altgrupları oluşur ve kemik iliği türevi hücrelerdir. Monosit, lökosit gelince işe alım cascades genel olarak, yakalama, inişli çıkışlı, tarama, tutuklama, transendothelial geçiş (hicret) ve geçiş damar duvarı (membran ve duvar resmi de dahil olmak üzere farklı adımları implicates hücreleri)4. Bu adımlar, esas olarak iltihap kaynaklı moleküller üzerinde endotel luminal yüzeyinde selectins, glikoprotein ligandlar, kemokinler, hücreler arası ve bileske adezyon molekülleri ve onların reseptörleri gibi ligandlar selektin gibi lökosit içerir ve integrinler. Ticaret yolları endotel hücre kavşak (paracellular) veya endotel hücre vücut (transcellular) aracılığıyla endotel bariyer5geçmeye lökositler tarafından kullanılabilir. Monosit tarihsel transcellular yönlendirme yolu transmigrate için dokümante edilmiş iken, monosit artık homojen hücre nüfus kabul edilir gibi onların göç yolu içinde olası farklılıkları gidermek önerilmiştir. Şimdi monosit çeşitlilik her onların farklılıklar ve ortak tarafından tanımlanabilir,3,6ile ilgili olarak kendi kendine özgü ekstravazasyonu basamaklandırır açık hale geliyor. Bu nedenle, belirsizliğe yer bırakmadan monosit altgrupları arasında ayırımcılık için görselleştirmek önemlidir ve fenotip her işe alım sırasında farklı bu altgrupları davranışını işlemek.
Monosit gelen insan, domuz, fare ve fare ile belirli görev atfedilen ve özel göçmen davranış7,8,9fenotipik altgrupları içine kentler. Örneğin, insanlarda, monosit CD14, bakteriyel lipopolysaccharide için bir coreceptor ve CD16, Fc-gama reseptör III onların yüzey ifadeye dayalı üç alt kümeleri ayrılabilir. İnsan monosit altgrupları dahil klasik CD14+CD16-, orta CD14+CD16+ ve klasik olmayan CD14dimCD16+ hücreleri6,9. Klasik CD14+CD16- monosit esas olarak iltihaplı olmak gösterildi ise CD16 havuzu+ monosit topluca TIE2 ifade ve proangiogenic işlev10sunmak için bulunmuştur. Sürekli olarak, endotel hücre stimülasyon ile inflamatuar sitokinlerin gibi insan tümör nekroz faktör (TNF) α veya interlökin (IL-1) beta (geleneksel iltihabı) klasik CD14 tam istihdamı tetiklemek yeterli+CD16 - monosit. Ancak, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) A ve TNFα (anjiogenik faktörler tahrik iltihabı) eş zamanlı eylemleri CD16 hicret kışkırtmak için gerekli olan+ proangiogenic havuzu monosit3. Tarihsel olarak, statik koşulları, paralel plaka akışı odası ve μ-slayt akışı odaları geleneksel Transwell sisteminde kullanılan kantitatif analiz bir lökosit nüfus bir zaman vitro11, işe alım ,12,13. Bu protokoller doğrulandıktan iken, aynı anda birden fazla monosit altgrupları analizine izin daha sağlam bir yöntem daha anlayışlı olarak değerlendirilir. Böyle metodolojisi birden çok etkileşimler ve her ilgili nüfus farklı frekansları için hesap ve ayrıca her monosit tanımlamak işe alım cascades için benzerlikler ve özelliklerine mekanik bir anlayış sağlamak alt küme küme.
Burada, aynı anda confocal mikroskobu kullanılarak belirlenmesi için farklı monosit altgrupları göçmen cascades sağlayan akış altında monosit alımı zaman hata görüntüleme dayalı bir yöntem mevcut. Bu yöntem endotel hücre iltihabı, hem de sonrası kapiller venüller, monosit dolaşan hemodinami lökosit işe alım içinde vivo ana konumunu taklit bazı kritik özellikleri entegre. İnsan göbek bağları izolasyonu iyi kurulmuş bir protokol aracılığıyla oluşturulan insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), önerilen yöntem kullanır. Bu klinik kaynağın ederken aynı zamanda umbilikal ven ayrılmış olabilir endotel hücrelerinin makul bir verim sağlayan biyolojik bir yan ürün kolayca kullanılabilir olmanın avantajı var. Biz de floresan boyalar ve ayirt farklı hücresel bileşenleri ve belirsizliğe yer bırakmadan monosit (abluminal vs. luminal) konumlandırma tanımlamak için confocal mikroskobu arasında ayırt etmek için kullanılan zaman içinde. Burada sunulan Protokolü monosit altgrupları hicret düzeyde aynı anda ölçmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu yöntem diğer lökositler altgrupları ve işe alım süreçleri çalışmaya farklı biyolojik ve etiketleme kullanımı ile uzatılabilir olduğunu belirtmek gerekir.

<table><tbody><tr><td>Doku Kültürü Şişeleri 75 cm2</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>İzole HUVEC</td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI rutin kültürü 0.4</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri 15 mL</td><td>TPP</td><td>191015</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri 50 mL</td><td>TPP</td><td>191050</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen G</td><td>Biochrom</td><td>L 7213</td><td>Hücre kültürü kaplaması için şişeler</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1393</td><td>Hücre kültürü şişelerinin kaplanması için</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (MgCl2 ve CaCl2 olmadan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (MgCl2 ve CaCl2 ile)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>3 Musluklar</td><td>BIO-RAD</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>penisilin 10.000 &mu;/mL streptomisin 10.000 &mu; g/mL mantar zonu 25 &mu;/mL</td><td>AMIMED</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 1</td><td>Worthington</td><td>LS004216</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199 1x avec Earle tuzları, L-Glutamin, 25 mM Hepes</td><td>GIBCO</td><td>22340020</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Albümin Fraksiyonu V</td><td>ThermoFisher</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi, 150 mg</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodyum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149RT</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A 4544</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu dihidrat C10H14N2Na2O8 ve orta nokta; 2H < altı > 2 < / alt >O</td><td>APPLICHEM</td><td>A2937.0500</td><td></td></tr><tr><td>CD144 (VE-Cadherin), insan rekombinant klonu: REA199, FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-100-713</td><td>AB_2655150</td></tr><tr><td>CD31-PE antikoru, insan rekombinant klonu: REA730, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-807</td><td>AB_2657280</td></tr><tr><td>Anti-Podoplanin-APC, insan rekombinant klonu: REA446, APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-107-016</td><td>AB_2653263</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide I Luer</td><td>IBIDI</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA (5-klorometilfloresein diasetat)</td> <td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan TNF ve alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan VEGFA</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 Programlanabilir Şırınga Pompası</td><td>KF Teknolojisi</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD14-PE, insan rekombinant klonu: REA599, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-519</td><td>AB_2655051</td></tr><tr><td>Pan Monosit İzolasyon Kiti, insan</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD16-PE, insan rekombinant klonu: REA423, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-106-762</td><td>AB_2655403</td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat</td><td>ThermoFisher</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru</td><td>IBIDI</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Dirsek Luer Konektörü</td><td>IBIDI</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Dişi Luer Kilit Kuplörü</td><td>IBIDI</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Luer Kilit Konektörü Dişi</td><td>IBIDI</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Sıralı Luer Enjeksiyon Portu</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ar1 konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x objektif</td><td>Nikon</td><td>40x 0.6 CFI ELWD S Düzlem Fluor WD: 3.6-2.8mm düzeltme 0-2mm</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Yazılımı</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monosit altgrupları vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Hedeflenen periferik dokulara kan üzerinden monosit alımı, doku hasarı, tümör gelişimi ve otoimmün hastalıklar sırasında enflamatuar süreç önemlidir. Bu onların yapışma ve transendothelial göç (hicret) temel etkilenen doku takip aktive endotel hücrelerinin luminal yüzeyine serbest akışı yakalama sürecinde kolaylaştırılmıştır. Ancak, monosit altgrupları Tercihli ve içerik bağımlı alımı destek mekanizmaları hala tam anlaşılır. Bu nedenle, aynı anda görüntülenir ve akış altında ölçülen için farklı monosit altgrupları alımı sağlayan bir yöntem geliştirdik. Hızlandırılmış confocal görüntüleme üzerinde dayalı bu yöntemi yapışık ve transmigrated monosit arasında kesin ayrım olanak sağlar. Burada, bu yöntem aynı anda pro-anjiogenik ve sigara anjiogenik monosit tüp bebek işe alım çağlayan eğitim için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem en çok üç monosit nüfus alımı farklı adımları incelemek için uzun olabilir.

TNFα tarafından indüklenen HUVEC etkinleştirme durumunu belirleme
Biyo-etkinlik inflamatuar sitokin TNFα, toplu iş ve donma-çözülme döngüsü repletion göre farklı. HUVEC harekete geçirmek durum TNFα tedavi ile kontrol etmek önemlidir. Bu paralel olarak selectins, ICAM-1 ve VCAM-115,16,17inflamatuar indüksiyon için konfluent HUVEC bazı örnek...

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Bu yöntem için inflamasyon ve immünoloji alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir. Örneğin, lökosit adezyonunun moleküler mekanizması ve trans-endotel göçü nelerdir. Bu tekniğin en büyük avantajı, transmigration ve endotel monolayer monositgüçlü eklenmesi arasında sınırsız kullanım ayrımcılık sağlar olmasıdır.Bu yöntem akış üzerinde monositlerin işe alınması hakkında bilgi sağlasa da, t-hücreleri, B-hücreleri veya bunların alt popülasyontürevleri gibi hematopoetik sistemlerin diğer hücrelerine de adapte edilebilir. Yıkadıktan sonra, 37 derece Santigrat M199 orta 30 mikrolitre ile insan göbek ven endotel hücreleri veya HUVEC etiket bir mikromolar CMFDA ile 37 derece santigrat derece ve% 5 Karbondioksit 10 dakika için takviye. Kuluçka sonunda, hücreleri 150 mikrolitre tam M199 ortasıyla yıkayın ve kültürü 150 mikrolitre taze tam M199 ortamına 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.Daha sonra supernatant'ı uygun deneysel takviyeleri içeren 150 mikrolitre tam M199 ortamıile değiştirin ve slayt odası kültürünü altı saat boyunca kuvöze geri döndürün. İnsan PAN monosit izolasyonu için, PBS'de taze toplanan bir kan örneğini bire bir oranında bir milimolar EDTA ile takviye edin ve santrifüj ile yoğunluk gradyan ayrımı için 20 ml yoğunluk gradyan ortasına kan çözeltisinin 20 ml'lik kısmını dikkatlice katlayın. 1 milimolar EDTA ile takviye PBS 40 ml içeren yeni bir 50 ml tüp içine orta periferik kan mononükleer hücre trombosit tabakası toplamak ve sayma sonra ek PBS-EDTA ile 50 ml son hacmi getirmek, üreticinin talimatına göre PAN monosit izolasyon kiti ile monosit izole.Ve EDTA herhangi bir iz ortadan kaldırmak için, 0.5% Sığır Serum Albumin veya BSA ile desteklenen M199 orta hücreleri üç kez yıkayın. Monosit izolasyonunun kalitesi, sağlam transmigration ve yapışma sonucu sağlamak için çok önemlidir. Bu nedenle, izolasyon için üreticinin tavsiyesini harfiharfine harfimek önemlidir.Taze M199 orta ml konsantrasyonu başına 6 kez 10 pelet resuspend 0.5% BSA ile desteklenen ve işe alım tsay başına mikrocentrifuge tüp başına bir 200 mikrolitre aliquot hücreleri bölmek. Daha sonra 37 derece santigrat derecede, akış odasına enjekte edilmeden önce 20 dakika yerleştirin. Analiz için akışkan sistemi hazırlamak için, ilk silikon boru 8 cm uzunluğunda 3 mm kalınlığında parça bir ucuna bir erkek luer konektör takın ve bir inline luer enjeksiyon seti diğer ucunu bağlayın.Daha sonra luer konektörünü 40 cm uzunluğunda 3 mm kalınlığında silikon boru parçasının bir ucuna bağlayın. Daha sonra, 20 mm şırınga 1 m uzunluğunda 3mm kalınlığında silikon boru parçasının bir ucuna ve diğer uca bir erkek luer konektörü yerleştirin. Sonra bir kadın luer kilit bağlayıcı içine her iki erkek luer konektörler takın ve 37 derece Santigrat M199 orta% 0.5 BSA ile desteklenen bir rezervuar içine silikon boru serbest ucunu yerleştirin.Tüplü havaleyi akış tamponuyla doldurmak için pistonu geri çekin ve şırınga pompasını sabitlayın. Daha sonra pompayı çekme moduna ayarlayın ve akış hızını belirtin. Slayt odası bağlamak için, kadın luer kilit bağlayıcı etrafında silikon boru kelepçe ve onları slayt rezervuar bağlı izin vermek için beyit iki luer konektör erkek kesmek.Hava kabarcıkları sadece görüntü kalitesini bozmakla kalmıyor, aynı zamanda hücrelere kılcal damar stresini de tetikler ve hücre ölümüne yol açarak ölüme yol açada. Hava kabarcıklarından kaçınmak için, luer'i rezervuara takmadan önce borunun doğru kenetlemesi onaylayın. Ardından bağlantının sızdırmadığını doğrulamak için kelepçeleri çıkarın ve kaydırağı mikroskop un altına yerleştirin.Akış altında monosit işe görüntüleme için, unescence kontal16 antikor ve oda sıcaklığında 10 dakikalık kuluçka için her aliquoted monositler için uygun bir nükleer boya 5 mikrolitre ekleyin ve kısa bir santrifüj ile hücreleri toplamak. 250 mikrolitre akış tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve şırınga pompasını çalıştırın. Kaydıraktan bir haznesine 30 mikrolitre monosit süspansiyon ekleyin ve konfokal mikroskoptaki 40X hedefini seçin.Uygun floresan lazerleri etkinleştirin ve konfokal mikroskobun kazanım parametrelerini ayarlamak için etiketli monositli odayı kullanın Sonraki, çoklu konumkonfokal görüntüleme için yarım santimetre yarıçap içinde üç görüş alanı seçin ve 10 ila 12 mikrometre aralığına bir Z destesi ayarlayın ve her dakika çalışması için zaman atlamalı kazanım. Üç dakikalık görüntülemeden sonra, 200 mikrolitre monositi sıralı luer enjeksiyon portundan enjekte edin ve hücresel etkileşimi görüntülemeye başlayın. En az 30 dakika sonra, görüntülemeyi ve akışı durdurun ve kaydıraktan kopmasını sağlamak için tüpü kıskaca alın.Uyarılmış HUVECs aracılığıyla hücrelerin transmigration oranını belirlemek için, açık görüntü J ve milimetre başına hücre sayısını belirlemek için her alanda yapışık monositlerin toplam sayısını saymak. Daha sonra, çekirdeğin etrafındaki bir kara delik zonunun varlığıyla tanımlanan endotel hücrelerinin altındaki bazal düzlemde bulunan göç etmiş monositlerin sayısını sayın. Stimülasyon dan sonra HUVECs aktivasyon durumunu kontrol etmek için basit bir yolu inflamatuar stres altında uzama görselleştirme etmektir.Zaman atlamalı konfokal görüntüleme, monositlerin fenotiplerinin değerlendirilebileceği apikal düzlemde görüntülenmelerini sağlar. Transmigration geçiren hücreler, apikal düzlemden kaybolmadan ve bazal düzlemde yeniden ortaya çıkmadan önce hücreler arası hücreden hücreye biraraya taşınırlar. Zaman içinde monosit alımının sayısallaştırılması, monosit adezyonunun transmigration tarafından takip edilebildiğini doğrular.CD16 pozitif monositin transmigration oranı endotel hücresi sadece TNF alfa ile uyarıldığında düşüktür ancak endotel hücreleri hem TNF alfa hem de vasküler endotelyal büyüme faktörü veya VEGFA ile uyarıldığında artar. TNF alfa ve TNF alfa artı VEGFA ile HUVEC stimülasyonu CD14 negatif T, B ve NK hücrelerine bağlılık bir artış neden olur, CD14 pozitif monositler karşılaştırın. Buna ek olarak, HUVEC stimülasyon sadece monosit popülasyonun transmigration neden olur, T, B ve NK hücreleri ya TNF alfa veya TNF alfa artı VEGFA uyarıcı koşulları altında göç yok gibi.Optimal bir monosit işe alım tayini gerçekleştirmek için, denemenizi önceden planlamanız ve aynı gün yapmanız önemlidir. Hücreleri arındırdığınızda, mikroskobunuzun 37 derecede olduğundan emin olun, böylece deney sırasında hücreleri farklı sıcaklıklara aktarmayın. Bu prosedürü öğrenmek için, HUVEC sitokin ve kemokine ekspresyonu profilleme gibi tüm yöntemlerin yanı sıra kemotaksis çalışmaları transmigration ve belirli monosit popülasyonun transmigration ve yapışma sürdürmek moleküler mekanizma hakkında ek soru cevaplamak için yapılabilir.

simultaneous-study-recruitment-monocyte-subpopulations-under-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) efektör T hücresi proliferasyonu üzerindeki immünomodülatör etkisini araştırmak için bir in vitro testi göstermektedir. Test, monosit popülasyonunu immünomodülatör bir fenotip kazanmaya teşvik etmek için MSC'lerin PBMC'lerle birlikte kültürlenmesini içerir ve bu da interlökin-10'un (IL-10) salgılanmasına yol açar. Aktive edilmiş CD4 + T hücreleri ile inkübasyonun ardından, indüklenen monositler T hücresi proliferasyonunu etkili bir şekilde baskılar.

Monositlerin Lökosit Proliferasyonu Üzerindeki İmmünomodülatör Etkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Video, stromal hücrelerin lökosit alımı üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Paralel bir plaka akış odası modelinde, pro-inflamatuar sitokinler, endotel hücreleri tarafından adezyon reseptörlerinin ekspresyonunu indükleyerek nötrofil alımını ve göçünü kolaylaştırır. Stromal hücreler ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerine nötrofil alımını azaltır.

Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi Ex vivo Autoperfused Microflow Odası Deneyi

akışından lökositleri için iltihaplı endotel kabiliyeti mezenkimal stromal hücreler tarafından düzenlenir. Biz akışından nötrofil işe değerlendirmek ve mezenkimal stromal hücreler bu süreci düzenleyen oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir birincil insan hücreleri içeren iki in vitro model tarif.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Monositler, aktive edildiğinde glikolitik metabolizmaya dayanan insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bileşenleridir. Taze tam kandaki toplam monositler ve monosit alt popülasyonları tarafından glikoz taşıyıcı ekspresyonunu ve glikoz alımını ölçmek için bir akış sitometrisi protokolü tanımladık.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Burada fare modellerinde kan monositlerinin kemotaktik aktivitesini ölçmek, beslenme, farmakolojik ve genetik müdahalelerin kan monositi üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve kan monositlerinden elde edilen makrofajları karakterize etmek için bir protokol sıyoruz. monosit-kemoattractant protein-1 (MCP-1) yüklü bazal membran kaynaklı jel fişleri kullanarak fare modelleri.

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Keşfedin monosit altgruplarının akış altında davranışlarını in vitro ortamda konfokal floresan mikroskobisi ile. Bu yöntem, iltihaplanma ve immünoloji araştırmalarında lökosit göç mekanizmalarını anlamak için değerli bir araçtır.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Daha fazla video keşfet