Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık
16 Kasım 2017
Biz hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak için bir protokol mevcut.
Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan farelerden iyi korunmuş doku mimarilerine sahip uygun hipofiz koronal kesitleri elde etmektir. Bu prosedür, hipofiz histolojisi, hücre farklılaşması, proliferasyon ve apoptoz gibi hipofiz gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişmekte olan murin hipofizlerinin gözle görülür bir hasar olmadan diseke edilebilmesi ve koronal bölümler elde etmek için uygun şekilde yönlendirilebilmesidir.
Bu yöntem için ilk olarak, murin hipofizlerini geliştirmek için uygun koronal bölümler elde etmenin teknik olarak zor olduğunu bulduğumuzda aklımıza geldi. Fareleri metin protokolüne göre uyuşturduktan ve sabitledikten sonra, kafatası kemiğini kesmek için makas kullanın. Daha sonra, forseps ile arka beyni kafatasının tabanından yavaşça kaldırın.
Daha sonra, sella turcica'nın ilk belirtisinde, kaldırmayı bırakın, ancak arka beyni tutun ve beynin tabanına bağlı hipofiz sapını ve sinir liflerini kesmek için ince makas kullanın. Hipofiz bezini tamamen açığa çıkarmak için tüm beyni kaldırmaya ve çıkarmaya devam edin. Hipofiz bezi, sfenoid kemiğin dorsal yüzeyine dayanır ve yanal olarak trigeminal sinirlerle çevrilidir.
Daha sonra hipofiz bezi, lateral trigeminal sinirler ve sfenoid kemiğin altı dahil olmak üzere tüm sellar bölgeyi kesmek için makas kullanın. Dokuyu %4 PFA içeren 35 mm'lik bir tabağa koyun ve yaşlarına bağlı olarak 4 santigrat derecede 40 dakika ila 3 saat arasında inkübe edin. Daha sonra, sabit dokuyu her biri 15 dakikada beş değişiklik için yıkamak için 10 mL PBS kullanın.
Sabit dokuyu 1 mL PBS içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın ve stereo mikroskop altında hipofiz bezlerini ayırın. P5 ila P14 hipofizleri için, ince forseps ve makasla sinirler ve kemik arasındaki bağ zarlarını çıkarın ve hipofiz bezini bir bütün olarak lateral trigeminal sinirlerle birlikte dikkatlice izole edin, ancak sella turcica'yı bırakın. P21 ve yetişkin hipofizleri için, hipofizin etrafındaki sinirleri ve bağ zarlarını çıkarın ve bezi çevre dokulardan kurtarın.
Metin protokolüne göre gerçekleştirilen dehidrasyon, ksilen temizleme ve balmumu sızmasından sonra, bir doku gömme konsol sisteminde, örneği kasetten çıkarın ve erimiş parafin mumu ile yarı doldurulmuş bir temel kalıba yerleştirin. P21 ve yetişkin hipofiz bezleri için, hipofiz bezini kısa ekseni bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde konumlandırmak için ısıtılmış ince forseps kullanın. P0 ila P4 hipofizleri için, numuneleri sfenoid kemikleri bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde yönlendirin.
P5 ila P14 hipofiz bezleri için, numuneleri trigeminal sinirleri bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde yönlendirin. Bezi yerleştirdikten sonra, balmumu bir soğutma plakası üzerinde yarı katı hale gelene kadar dokuyu istenen pozisyonda nazikçe tutmak için ısıtılmış ince forseps kullanın. Kalıbı erimiş parafin mumu ile doldurun.
Balmumu tamamen katılaşana kadar parafin bloğunun soğumasına izin verin. Parafin bloğunu eksi 20 santigrat derecede 10 ila 20 dakika soğutun, ardından ince dilimler halinde kesmek için bir mikrotom kullanın, kesitleme sırasında parafin bloğunun konumunu ince ayarlayın. Metin protokolüne göre immün etiketleme yapın.
Burada gösterildiği gibi, yenidoğan faresinden hipofiz bezini incelemek için, hipofiz bezini içeren tüm sellar bölge, trigeminal sinirler ve altındaki sfenoid kemik kafa tabanından diseke edildi. Küçük ve hassas hipofiz bezi işlem sırasında sağlam kaldı. Beş günden daha eski fareler için, lateral trigeminal sinirlere bağlı hipofiz bezleri izole edildi.
P7 faresinden izole edilen hipofiz bezinin büyüme yapısı iyi korunmuştur. Burada, P21 faresinin hipofiz bezi, çevresindeki dokuyu çıkarırken gözle görülür bir hasar olmadan başarılı bir şekilde izole edildi. Bu şekilde, düzgün yönlendirilmiş koronal bölümlerin H&E boyaması, P0, P7 ve P21 hipofiz bezlerinde hem adenohipofiz hem de nörohipofizin iyi korunmuş morfolojisini göstermektedir.
Son olarak, işlenen slaytlar immünofloresan etiketleme ile de uyumluydu. Örnek olarak, adenohipofiz ve nörohipofiz, sırasıyla GH ve GFAP'nin spesifik immünoetiketlemesini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, diseksiyondan gömmeye kadar olan süreç, yetişkin farelerde 7.5 saat içinde ve uygun şekilde yapılırsa genç farelerde daha da az yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, hipofiz bezine herhangi bir cerrahi aletle dokunmaktan kaçınmak için tüm sellar bölgesini incelemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, önceden eklenmemiş hipofiz de izole edilebilir. Bu durumda, istenmeyen hasarları önlemek için daha dikkatli olunmalıdır.
Bez ayrıca mümkün olduğunca çabuk disseke edilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, fare hipofiz bezlerinin nasıl diseksiyon edileceğini ve farklı gelişim aşamalarında hipofiz koronal bölümlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hipofiz bezinin ayrıştırılması ve gelişmekte olan farelerden koronal kesitlerin hazırlanması için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, doku mimarisini korurken hipofiz gelişimi çalışmasını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Histoloji
Arka Plan
- Hipofiz gelişimini anlamak, hormonal düzenlemeye dair anlayış için çok önemlidir.
- Gelişmekte olan murine hipofizden uygun koronal kesitler elde etmek zorluklara neden olmaktadır.
- Histolojik analiz, hücre farklılaşması ve çoğalması hakkında bilgiler ortaya çıkarabilir.
- Diseksiyon sırasında doku bütünlüğünü korumak için uygun teknikler şarttır.
Çalışmanın Amacı
- Hipofiz bezini ayrıştırmak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Koronal kesitlerde iyi korunmuş doku mimarisini sağlamak.
- Hipofiz histolojisi ve ilgili gelişim süreçleri üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Gelişmekte olan farelerin anestezi ve fiksasyonu.
- Hipofiz bezine erişmek için kafatasının ayrıştırılması.
- Hasar vermemek için arka beynin dikkatli bir şekilde kaldırılması.
- Histolojik analiz için koronal kesitlerin hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Protokol, murine hipofizlerinin başarılı bir şekilde ayrıştırılmasına izin verir.
- Koronal kesitler, doku mimarisini etkili bir şekilde korur.
- Bu yöntem, hipofiz gelişimi üzerine yapılan çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
- Sonuçlar, hücre farklılaşması ve apoptozu anlamak için katkıda bulunur.
Sonuçlar
- Sunulan protokol, nörobilimciler ve gelişimsel biyologlar için değerli bir araçtır.
- Bu, kaliteli koronal kesitler elde etme konusundaki önceki zorlukları ele almaktadır.
- Gelecek çalışmalar, bu yöntemi hipofiz fonksiyonu ve bozukluklarını araştırmak için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable dissection and coronal sectioning of developing mouse pituitary glands, supporting endocrine and neurodevelopmental research. By preserving tissue architecture across developmental stages, it facilitates mechanistic studies of hormone-secreting cell differentiation and proliferation. The method addresses a key technical barrier in pituitary biology, improving reproducibility in preclinical target validation and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of pituitary developmental pathways and endocrine cell specification.
- Operational Value: Provides standardized tissue preparation for consistent histological and molecular readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible coronal sections suitable for immunohistochemistry and immunofluorescence screening.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent orientation and preservation of adenohypophysis and neurohypophysis structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links developmental phenotypes to hormonal regulation mechanisms relevant to endocrine disorder modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis across postnatal developmental windows (P0-P21) for phenotype tracking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing intact pituitary tissue for downstream analysis, supporting target validation and phenotypic screening in endocrine-related disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pituitary cell differentiation and proliferation through preserved coronal sections.
- Screening: Enables quantitative immunohistochemical and immunofluorescence assays with consistent tissue morphology.
- Analytics: Facilitates morphometric and molecular readouts that allow comparison across developmental stages and experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to endocrine function, supporting preclinical modeling of pituitary-related disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and sectioning protocol applicable across multiple pituitary development studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in pituitary developmental studies by ensuring tissue integrity and section quality.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and developmental timepoints.
- Strategic Value: Reduces technical failure rates in endocrine research, improving resource efficiency and timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in hormonal regulation pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and histological processing techniques.
- Dependent on access to microtome, embedding consoles, and histological staining infrastructure.
- Necessitates standardization of dissection timing and fixation protocols across developmental stages.
- Requires adaptation of embedding orientation based on age-specific anatomical landmarks (sphenoid bone, trigeminal nerves).
- Limited by tissue fragility in early developmental stages, necessitating careful handling to avoid damage.
