Name: Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Öğrenin, gelişmekte olan farelerde hipofiz bezinin diseksiyonu ve koronal kesit hazırlama yöntemini. Bu teknik, doku bütünlüğünü koruyarak hipofiz gelişimi ve histolojisi araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31201086, 31470759 ve 31671219) ve Şangay doğal Bilim Vakfı (12ZR1436900) tarafından desteklenmiştir.

C57BL/6 fareler özel patojen-Alerjik durumlar yetiştirilmiş. Tüm hayvan deneysel hayvan bakım ve ikinci askeri Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış yönergelere uygun yöntemlerdir.
 1. diseksiyon, Postnatal gelişmekte olan hipofiz bezi <ol><li>gerçekleştir anestezi: yenidoğan fareler (P0 - P5) hipotermi ikna etmek için ezilmiş buz koyun. 5 günden büyük fareler için %5 üretan (30 µL/g vücut ağırlığının) anestezi ikna etmek için intraperitoneally enjekte et. Kuyruk/Pinch ayak yanıt-e doğru değerlendirmek. Sadece fare için zararlı uyaranlara yanıt vermemesine neden olur sonra devam.</li>
	<li>Yavaşça forepaws taping tarafından fare (yüz yukarı arkasında yatan) sırtüstü pozisyonda güvenli ve hindpaws olma yeteneğine sahip bir çalışma yüzeyinin için pinned (Yani, strafor) bir kimyasal duman başlık içinde.</li>
	<li>Transcardial perfüzyon gerçekleştirmek.
	<ol><li>Fare kafesi kalp (ve torasik diğer organlara) ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesti.</li>
		<li>Kalbi künt Forseps ile güvenli ve 26 G (0,45 mm) iğne sol ventrikül yerleştirin. İğne heparinized fosfat tamponlu tuz ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı olduğu (PBS; 5 mg/mL sodyum nitrit ve 10 U/mL heparin ile desteklenmiş, pH 7.4, sıcak kullanmadan önce 37 ° c). Hemen sağ atrium iyi makasla kesmek ve sağ Kulakçık çıkmadan sıvı temizlenene kadar sıcak PBS ile vücut sıvı başlar. 
		Not: yaklaşık 5-10 mL PBS yenidoğan fareler için gereklidir ve 10-20 mL PBS yetişkin fareler için.</li>
		<li>İğne tutmak ve % 4 paraformaldehyde (PFA; pH 7,4) dolu bir şırınga için değiştirin. 10 mL ve sabitleştirici için 20 mL sıvı yenidoğan ve P21 fare, sırasıyla. 
		Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt ve solunum tahrişleri ve göz zarar neden olabilir. Eldiven ve iş bir kimyasal başlık altında.</li>
	</ol></li> <li>PFA-sabit fare başını kesmek ve kafatası kemik makasla kesip.
	<ol><li>Yavaşça küçük Forseps ile arka beyin kafatası tabanından kaldırın. Sella turcica ilk belirtisinde durağı kaldırma ama tutun arka beyin, kesme hipofiz sapı ve sinir lifleri beynin tabanına iyi makas ile bağlanma. Bu hipofiz uzakta beyinle kaldırdı değil emin olmak için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Sonra beyin kaldırma tutmak ve tüm beyin hipofiz bezi tam olarak ortaya çıkarmak için kaldırın. Hipofiz bezi, yanal trigeminal sinir, dahil olmak üzere tüm sella bölge kesmek ve makas (yaklaşık 3 x 5 mm 2) ile ense kemiği altında.</li>
	</ol></li> <li>Disseke doku içine bir 35 mm çanak ya da bir şey 2 mL soğuk %4 içeren 6-şey plaka koymak PFA (pH 7,4). Saptamak için P0 - P7 pituitaries, P14 pituitaries, P21 - P28 pituitaries ve yetişkin pituitaries için 3 h için 1,5 saat için 1 saat 40 dk 4 ° C'de doku.</li>
	<li>Daha fazla ayrışma, hipofiz <ol><li>sabit doku 10 mL PBS, 5 değişiklikleri, 15 dk ile yıkayın. Yenidoğan hipofiz bezi ile birlikte onun çevre dokular ve ense kemiği altında aşırı su kaybına doğrudan işlenebilir. Ancak, hipofiz bezlerin fareler 5 günden daha eski üzerinden ayrışmış başka bir stereo mikroskop altında.</li>
		<li>Sabit doku 1 mL PBS içeren bir 35 mm çanak içine koymak. P5 - P14 pituitaries, için sinirler ve iyi forseps ve makas ile kemik arasındaki bağ membranlar kaldırmak ve dikkatle yanal trigeminal sinir birlikte hipofiz bezi sella turcica bırakarak ancak bir bütün izole. İzole bezi ve sinirler ile bağ membranlar tarafından bağlı bir &#34; H &#34;-hangi tarihlerde görünüm ( şekil 1B).</li>
		<li>İçin P21 ve yetişkin pituitaries, sinirler ve hipofiz etrafında bağ membranlar kaldırmak ve bezi çevre dokular üzerinden ücretsiz. Hipofiz bezi doku kağıt mendil temizlik lens ile sarın ve gömme bir kaset koy. 
		Not: küçük hipofiz lens temizleme kağıt mendil ile kaydırma örneklerin herhangi bir olası kaybını önlemek ve parafin katıştırma aşağıdaki yordamdaki doku bütünlüğünün korunması için yardımcı olur. Cryo-gömme yordamdaki küçük bir şişe içinde işlense hipofiz kaydırılmasına gerek kalmayabilir.</li>
	</ol></li></ol> 2. Katıştırma ve Sectioning alkol <ol><li>15 dk için % 50, % 65, %75 ve % 95 etanol çözümleriyle kaset katıştırma olarak numuneler kurutmak. Daha sonra saf etanol, 3 dakikadır her P0 - 3 değişikliklerle P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için kurutmak. Ksilen ile net, 3, 3 dakikadır her P0 - P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için değiştirir. Erimiş parafin mum, 3 değişiklikleri, 7 dk P0 - P4 bezleri, sızmak ve 8 min iki kez izledi tarafından 6 dk bir kez P5 ve büyük bezleri için. 
	Not: Doku işleme için en uygun parametreler ampirik olarak ayarlanabilir. Yüksek kaliteli bölümler elde etmek için yaşında veya yetersiz dehidrasyon kaçınılmalıdır. Aynı Ksilen kullanarak doku temizlenmesi için geçerlidir.</li>
	<li>Katıştırırken yönlendirme <ol><li>konsol sistemi, gömme bir doku üzerinde örnek kaset çıkarın ve yarı erimiş parafin mum ile dolu temel bir kalıp içine yerleştirin. Gömme hipofiz bezinin uygun yönlendirmeyi koronal bölümleri tatmin edici esastır.</li>
		<li>İçin P21 ve yetişkin hipofiz bezleri, hipofiz bezi temel kalıp (bölüm uçak) alt yüzeyine dik kısa ekseni ile getirin. Ense kemikler ve trigeminal sinir anatomik yerlerinden P0 - P4 ve P5 - P14 pituitaries, sırasıyla kullanın. Numuneler ile onların trigeminal sinir ya da enine lamina ense kemik bir temel kalıp alt yüzeyine dik orient.</li>
		Balmumu soğutma tabağa yarı katı hale gelene kadar <li>yavaşça doku istenen konumda ısıtılmış ince Forseps ile tutun. Kalıp erimiş parafin mum ile kontör. Balmumu tamamen katılaşmış kadar soğumasını parafin blok izin. 
		Not: Hipofiz (E18.5) embriyonik gün 18,5 yenidoğan hipofiz olarak aynı şekilde tedavi edilebilir. Ama pituitaries (Rathke &#39; s torbalar içinde) E16.5 ile tüm baş gömülü ve temel bir kalıp alt yüzeyine dik sagittal eksen (ağzından occiput) ile odaklı daha genç değil.</li>
	</ol></li> <li>Sonra kesti ve parafin blok için 10-20 dk-20 ° C'de soğuk içine ince dilimleri (4 µm kalınlık tercih edilir) ile bir microtome. Tatmin edici koronal bölümler elde etmek için ince kesit sırasında parafin blok konumunu ayar. Doku dilimleri dilimleri aşağıdaki yordamlar dekolmanı önlemek için polylysine kaplı cam slaytlar üzerine monte. 
	Not: Alternatif olarak, örneklerin % 15, susuz %30 (W/V) Sükroz çözümlerinde (PBS) aynı yönlendirme yöntemini kullanarak bileşik cryo katıştırma katıştırılmış ve hızlı bir şekilde kuru buzda donmuş alt lavabo kadar 4 ° C'de. O zaman donmuş doku bloklar bir cryostat kullanarak 8-10 µm dilimler halinde kesin. Cryo-kesitler, Morfoloji ancak, sık sık alkol bölümleri aşağı kalır yanı yok.</li>
</ol> 3. H &#38; E boyama ve ayirt etiketleme <ol><li>, sıcak bir ısı slaytlarda blok 55 ° C'de ve dewax Ksilen, 2 değişiklik, 4 dk ile her. % 95 etanol iki kez ve % 75 etanol iki kez, 3 dk örnekleriyle kurutmak. Slayt üzerinde bir shaker 5 min için distile su ile yıka.</li>
	<li>H için &#38; E boyama, şap Hematoksilen çözüm için 6 dk bölümlerde leke, durulama runn içindeIng musluk suyu 2 dakika, 45 s ve durulama akan suyun 2 dakika içinde yeniden için % 0,2 amonyaklı su ile ayırt etmek. 1 dk ve leke için 2 min. Eozin ile sırayla kurutmak, Sil ve mount için % 95 etanol bölümlerle kurutmak.</li>
	<li><ol><li>Ayirt etiketleme bölümleri % 3 H 2 O 2 ve % 0,01 NaN 3 endojen peroxidases devre dışı bırakabilirsiniz için oda sıcaklığında 20 dakika içeren metanol ile tedavi. 37 30 dk için engelleme arabellek (%5 keçi serum içinde PBS) bölümlerle bir düdüklü tencere 2 dk. Incubate alma arabellek (1 mM EDTA ve 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) bölümlerinde kaynatılarak antijenleri almak ° C.</li>
		<li>Engelleme arabellekte gecede 4'te seyreltilmiş bölümleri tavşan Anti-büyüme hormonu (GH) antikor (1:2, 000) veya tavşan anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) antikor (1:2, 000) ile kuluçkaya ° C.</li>
		<li>35 dk. 37 için ikincil antikor (keçi Anti-tavşan IgG-HRP, 1:300 engelleme arabelleği) bölümlerle kuluçkaya ° C.</li>
		<li>15 dakika oda sıcaklığında Biotinyl Tyramide (1:50 Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik içeren %0,3 H 2 O 2) kullanarak sinyalleri yükseltmek ve Streptavidin-Alexa594 veya 488 (kapatmaktır tampon, 30 dk, 37 ° C 1:300) ile görselleştirmek.</li>
		<li>Counterstain DAPI (50 mg/L PBS) ile çekirdeği oda sıcaklığında 5 min için. 
		Not: Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) sistemi kullanarak sinyali yükseltmek gerekli olmayabilir. Alternatif olarak, Floresans Birleşik ikincil antikor sinyal görselleştirmek için kullanılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Floresan mikroskop kullanarak edinme görüntüleri 40/0,75 hedefleri ve 5,0 megapiksel kamera DAPI, Texas kırmızı ve FITC filtre setleri, × 4/0,13 × ile donatılmıştır. 360, 488 ve 594 nm lazer dalga boyu görüntüleme DAPI, Alexa 488 - ve kesitler, Alexa 594 lekeli için sırasıyla kullanın. Lazer güç en iyi duruma getirme (0,8 genellikle kullanıldı) ve her kanal için istenilen düzeylere çekim hızı. Görüntü alma yazılımı kontrol altında görüntü yakalama ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanarak floresan görüntü.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fare pituitaries geliştirmek için bu küçük ve kırılgan özellikleri ve benzersiz anatomik özellikleri6,8nedeniyle uygun koronal bölümler elde etmek teknik olarak zor oldu. Bazı araştırma grupları böylece embriyonik ve neonatal hipofiz11,12morfolojisi çözümlemek için orta-sagittal bölümleri seçti. Yine de hipofiz orta-sagittal bölümünü de anterior, orta gösterilen yeteneğine sahiptir ve bu üç LOB maksimum b...

Önemli bir endokrin organ homeostazı1,2için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. Anatomik olarak, hipofiz bezi, nörohipofiz ve adenohipofiz oluşan bir '' iki-in-one'' yapısıdır. Bu parçaların farklı embriyonik kökenleri ve işlev farklı var. Nörohipofiz sinirsel ektoderm türetilmiştir ve oksitosin ve Antidiüretik hormon salgılar. Adenohipofiz Rathke'nın çantası kaynaklı ve dahil olmak üzere büyüme hormon, prolaktin, tiroid - uyarıcı hormon, folikül - uyarıcı hormon, Lüteinizan, adrenocorticotropic hormon, hormon serbest bırakmak için sorumludur ve melanosit - uyarıcı hormon3,4,5.
Hipofiz bezi fare kafatası ense kemiği (sella turcica) dorsal yüzeye aittir ve beynin tabanına kırılgan bir SAP tarafından eklenir. Yanal trigeminal sinir tarafından ve anteriorly optik hemisferlerine6,7ile çevrilidir. Bezinin uzun ekseni başı dik bir uzun oval şekil vardır. Dorsal yüzeyi nörohipofiz ve adenohipofiz kolayca, dorsal orta bölge ve yanal ve ventrally ikinci uzanan işgal eski ile demarcated. Postnatal geliştirme sırasında ilk ay sonra doğum8,9hipofiz boyutunu hızla artar. Yine de, fare hipofiz hala çok küçük boyutu 1,9 mg bir ortalama ağırlığı ve uzun eksen çapı ~ 3 mm ile yetişkin10, postnatal gün 21 (P21) 2-2.5 mm ve P0 yalnızca 1-1.5 mm uzun eksen çapı.
Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir. Ancak, bazı teknik becerileri fareler son derece küçük boyutu ve farklı anatomi nedeniyle gelişmekte olan hipofiz bezlerinin koronal bölümleri tatmin elde etmek için gereklidir. Video bu makalede, biz nasıl fare hipofiz bezleri teşrih ve hipofiz koronal bölümleri farklı geliştirme aşamalarında hazırlayın göstermek.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Araçlar / Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cerrahi makas-düz</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>İnce makas strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Künt forseps</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Hipofiz</td> 26G (0,45 mm) <td>iğnesinin izolasyonu için</td>Dumont <td>RS-5015</td></tr><tr><td></td><td>Transkardiyal perfüzyon için</td><td>HongDa</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Şırınga (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>35 mm</td><td>çanak Corning</td><td>430165</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Lens temizleme kağıdı</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Anatomik mikroskop</td><td></td><td>OLYMPUS SZX-ILLB2-200</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Gömme kaseti</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Doku gömme konsol sistemi</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>diğer satıcılardan</td></tr> <tr>satın alınabilir<td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus slaytları</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>başka satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td><güçlü>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üretan</td><td>PBS için</td><td>BBI EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>PBS için KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>PBS için</td> <td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>PBS için</td><td>P2222</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Enjeksiyonu</td><td>Perfüzyon tuzlu</td>su için <td>SPH</td><td>H31022051</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>H & için Ksilen</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td> H & için E boyama</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td> E boyama</td></tr><tr><td>tavşan anti büyüme hormonu (GH)</td> <td>İmmün boyama</td>antikoru için <td>Ulusal Hormon</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hipofiz Programı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-fare GFAP antikoru</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>immüno-boyama için</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>immüno-boyama için</td></tr><tr><td>TSA sistemi</td><td>NEN Yaşam Bilimleri Ürünleri</td><td>İmmün boyama için</td> <td>NEL700</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>immün boyama için</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>immün boyama için</td></tr></tbody></table>

diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Önemli bir endokrin organ homeostazı için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. O oluşmak-in iki bezleri ile ayrı embriyonik kökenleri ve görev — nörohipofiz ve adenohipofiz. Küçük ve narin bir uzun oval şekli ile gelişmekte olan fare hipofiz bezi bulunmaktadır. Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir.
Bu iletişim kuralı uygun hipofiz koronal bölümleri fareler gelişmekte olan iyi korunmuş doku mimarileri ile ulaşmak hedeftir. Bu protokol için ayrıntılı olarak incelemek ve hipofiz bezlerinin düzgün üzerinden fare geliştirme işlemek nasıl açıklar. İlk olarak, fare transcardial perfüzyon formaldehit diseksiyon önce tarafından sabitlenir. Daha sonra üç farklı diseksiyon teknikleri sağlam hipofiz bezlerin fareler yaş bağlı olarak elde etmek için uygulanır. Fetal farelerin embriyonik gün (E) 17,5-18,5 ve Yenidoğan Bebeklerin yukarı 4 gün olarak yaşları için ense kemiği, bezi ve trigeminal sinir de dahil olmak üzere tüm sella bölgeleri kesmiştim. Yavrular için bir bütün olarak trigeminal sinir ile bağlı yaşında doğum sonrası gün (P) 5-14, hipofiz bezleri disseke. 3 hafta boyunca fareler için hipofiz bezleri dikkatle ücretsiz çevre dokulardan disseke. Ayrıca nasıl koronal bölümleri tatmin elde etmek için simge çevre dokular kullanarak uygun yönde hipofiz bezleri katıştırmak için görüntüler. Bu yöntemleri fareler gelişmekte olan hipofiz bezlerinin histolojik ve gelişimsel özellikleri analiz yararlıdır.

Bu iletişim kuralı fareler gelişmekte olan hipofiz bezleri incelemek için bir yöntem sunuyor. Yenidoğan fare, hipofiz bezi, trigeminal sinir ve iç çamaşırım içeren tüm sella bölgelerin ense kemik kafatası tabanından dışarı disseke. Küçük ve narin hipofiz bezi (şekil 1A) işlemi sırasında olduğu gibi kaldı. 5 günden daha eski fareler için yanal trigeminal sinir bağlı hipofiz bezleri o zamanlar izole. Fare iyi korunmuş P7 izole hipofiz bezi (<strong class="xfig"...

Biz hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak için bir protokol mevcut.

Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan farelerden iyi korunmuş doku mimarilerine sahip uygun hipofiz koronal kesitleri elde etmektir. Bu prosedür, hipofiz histolojisi, hücre farklılaşması, proliferasyon ve apoptoz gibi hipofiz gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişmekte olan murin hipofizlerinin gözle görülür bir hasar olmadan diseke edilebilmesi ve koronal bölümler elde etmek için uygun şekilde yönlendirilebilmesidir.Bu yöntem için ilk olarak, murin hipofizlerini geliştirmek için uygun koronal bölümler elde etmenin teknik olarak zor olduğunu bulduğumuzda aklımıza geldi. Fareleri metin protokolüne göre uyuşturduktan ve sabitledikten sonra, kafatası kemiğini kesmek için makas kullanın. Daha sonra, forseps ile arka beyni kafatasının tabanından yavaşça kaldırın.Daha sonra, sella turcica'nın ilk belirtisinde, kaldırmayı bırakın, ancak arka beyni tutun ve beynin tabanına bağlı hipofiz sapını ve sinir liflerini kesmek için ince makas kullanın. Hipofiz bezini tamamen açığa çıkarmak için tüm beyni kaldırmaya ve çıkarmaya devam edin. Hipofiz bezi, sfenoid kemiğin dorsal yüzeyine dayanır ve yanal olarak trigeminal sinirlerle çevrilidir.Daha sonra hipofiz bezi, lateral trigeminal sinirler ve sfenoid kemiğin altı dahil olmak üzere tüm sellar bölgeyi kesmek için makas kullanın. Dokuyu %4 PFA içeren 35 mm'lik bir tabağa koyun ve yaşlarına bağlı olarak 4 santigrat derecede 40 dakika ila 3 saat arasında inkübe edin. Daha sonra, sabit dokuyu her biri 15 dakikada beş değişiklik için yıkamak için 10 mL PBS kullanın.Sabit dokuyu 1 mL PBS içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın ve stereo mikroskop altında hipofiz bezlerini ayırın. P5 ila P14 hipofizleri için, ince forseps ve makasla sinirler ve kemik arasındaki bağ zarlarını çıkarın ve hipofiz bezini bir bütün olarak lateral trigeminal sinirlerle birlikte dikkatlice izole edin, ancak sella turcica'yı bırakın. P21 ve yetişkin hipofizleri için, hipofizin etrafındaki sinirleri ve bağ zarlarını çıkarın ve bezi çevre dokulardan kurtarın.Metin protokolüne göre gerçekleştirilen dehidrasyon, ksilen temizleme ve balmumu sızmasından sonra, bir doku gömme konsol sisteminde, örneği kasetten çıkarın ve erimiş parafin mumu ile yarı doldurulmuş bir temel kalıba yerleştirin. P21 ve yetişkin hipofiz bezleri için, hipofiz bezini kısa ekseni bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde konumlandırmak için ısıtılmış ince forseps kullanın. P0 ila P4 hipofizleri için, numuneleri sfenoid kemikleri bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde yönlendirin.P5 ila P14 hipofiz bezleri için, numuneleri trigeminal sinirleri bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde yönlendirin. Bezi yerleştirdikten sonra, balmumu bir soğutma plakası üzerinde yarı katı hale gelene kadar dokuyu istenen pozisyonda nazikçe tutmak için ısıtılmış ince forseps kullanın. Kalıbı erimiş parafin mumu ile doldurun.Balmumu tamamen katılaşana kadar parafin bloğunun soğumasına izin verin. Parafin bloğunu eksi 20 santigrat derecede 10 ila 20 dakika soğutun, ardından ince dilimler halinde kesmek için bir mikrotom kullanın, kesitleme sırasında parafin bloğunun konumunu ince ayarlayın. Metin protokolüne göre immün etiketleme yapın.Burada gösterildiği gibi, yenidoğan faresinden hipofiz bezini incelemek için, hipofiz bezini içeren tüm sellar bölge, trigeminal sinirler ve altındaki sfenoid kemik kafa tabanından diseke edildi. Küçük ve hassas hipofiz bezi işlem sırasında sağlam kaldı. Beş günden daha eski fareler için, lateral trigeminal sinirlere bağlı hipofiz bezleri izole edildi.P7 faresinden izole edilen hipofiz bezinin büyüme yapısı iyi korunmuştur. Burada, P21 faresinin hipofiz bezi, çevresindeki dokuyu çıkarırken gözle görülür bir hasar olmadan başarılı bir şekilde izole edildi. Bu şekilde, düzgün yönlendirilmiş koronal bölümlerin H&E boyaması, P0, P7 ve P21 hipofiz bezlerinde hem adenohipofiz hem de nörohipofizin iyi korunmuş morfolojisini göstermektedir.Son olarak, işlenen slaytlar immünofloresan etiketleme ile de uyumluydu. Örnek olarak, adenohipofiz ve nörohipofiz, sırasıyla GH ve GFAP'nin spesifik immünoetiketlemesini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, diseksiyondan gömmeye kadar olan süreç, yetişkin farelerde 7.5 saat içinde ve uygun şekilde yapılırsa genç farelerde daha da az yapılabilir.Bu prosedürü denerken, hipofiz bezine herhangi bir cerrahi aletle dokunmaktan kaçınmak için tüm sellar bölgesini incelemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, önceden eklenmemiş hipofiz de izole edilebilir. Bu durumda, istenmeyen hasarları önlemek için daha dikkatli olunmalıdır.Bez ayrıca mümkün olduğunca çabuk disseke edilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, fare hipofiz bezlerinin nasıl diseksiyon edileceğini ve farklı gelişim aşamalarında hipofiz koronal bölümlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Fare beyin korteksi translationally etkin, sağlam synaptoneurosomes (SNS) hazırlamak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, aktif SNS hızlı hazırlanması için izin veren bir süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanır.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Biz medial entorinal korteks (MEC) dorsal-ventral eksen korumak beyin dilimleri ile hazırlanması ve elektrofizyolojik kayıt için prosedürler açıklanmaktadır. Konumu nöral kodlama MEC içinde dorsal-ventral organizasyonu aşağıdaki Çünkü, bu işlemler navigasyon ve bellek için önemli hücresel mekanizmaların incelenmesi kolaylaştırmak.

Kemirgen Medial entorinal Korteksin dorsal-ventral Örgütü Soruşturma parasagital Dilimleri hazırlanması

Video, fare yavrusu beyinlerinden kollikülo-talamokortikal beyin dilimlerinin hazırlanışını göstermektedir. İzole edilmiş bir beyin, işaretli bir slayt üzerinde hizalanır ve işitsel orta beyin ile ön beyni aynı düzlemde hizalamak için belirli bir açıyla kesilir. Beyin daha sonra bir vibratom kullanılarak dilimlenir ve ana işitme, orta beyin ve ön beyin yapılarını içeren dilimler, koruma için bir tutma odasına aktarılır.

Bir Fare Yavrusu Beyninden Kollikülo-Talamokortikal Dilimlerin Hazırlanması

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

İnsan beyni tümörlerinin birçok türü, beynin belirli bölgelerine lokalizedir ve kültürde büyümesi zordur. Bu protokol, tümör mikroçevresinin rolünü ele alır ve organotipik bir fare beyin diliminde büyüyen floresan primer beyin tümörü hücrelerini analiz ederek yeni ilaç tedavilerini araştırır.

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Bu makalede, ayrıntılı olarak, postnatal fare nöral kök hücrelerinden nörosfer kültürlerin üretimi için bir protokol ana fare nörojenik nişler türetilmiştir açıklar. Nörosferler öncühücre sayılarının tahmin ine izin beyin dokusundan nöral kök hücreleri tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, bu 3D yapılar farklıkoşullarda kaplanmış olabilir, nöronlar neden, oligodendrositler ve astrositler, hücre kaderini çalışma sağlayan.

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Hipofiz bezi, vücudun endokrin sisteminin anahtar düzenleyicisidir. Bu makalede, fare hipofizinden organoidlerin gelişimi, biyolojisi ve işlevi tam olarak anlaşılamayan bezin kök hücre popülasyonunu incelemek için yeni bir 3D in vitro model olarak açıklanmaktadır.

Hipofiz Kök Hücre Biyolojisini Keşfetmek için Fare Hipofizinden In Vitro Model Olarak Organoidlerin Geliştirilmesi

Öğrenin, gelişmekte olan farelerde hipofiz bezinin diseksiyonu ve koronal kesit hazırlama yöntemini. Bu teknik, doku bütünlüğünü koruyarak hipofiz gelişimi ve histolojisi araştırmalarını destekler.

Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

Daha fazla video keşfet