Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan farelerden iyi korunmuş doku mimarilerine sahip uygun hipofiz koronal kesitleri elde etmektir. Bu prosedür, hipofiz histolojisi, hücre farklılaşması, proliferasyon ve apoptoz gibi hipofiz gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişmekte olan murin hipofizlerinin gözle görülür bir hasar olmadan diseke edilebilmesi ve koronal bölümler elde etmek için uygun şekilde yönlendirilebilmesidir.

Bu yöntem için ilk olarak, murin hipofizlerini geliştirmek için uygun koronal bölümler elde etmenin teknik olarak zor olduğunu bulduğumuzda aklımıza geldi. Fareleri metin protokolüne göre uyuşturduktan ve sabitledikten sonra, kafatası kemiğini kesmek için makas kullanın. Daha sonra, forseps ile arka beyni kafatasının tabanından yavaşça kaldırın.

Daha sonra, sella turcica'nın ilk belirtisinde, kaldırmayı bırakın, ancak arka beyni tutun ve beynin tabanına bağlı hipofiz sapını ve sinir liflerini kesmek için ince makas kullanın. Hipofiz bezini tamamen açığa çıkarmak için tüm beyni kaldırmaya ve çıkarmaya devam edin. Hipofiz bezi, sfenoid kemiğin dorsal yüzeyine dayanır ve yanal olarak trigeminal sinirlerle çevrilidir.

Daha sonra hipofiz bezi, lateral trigeminal sinirler ve sfenoid kemiğin altı dahil olmak üzere tüm sellar bölgeyi kesmek için makas kullanın. Dokuyu %4 PFA içeren 35 mm'lik bir tabağa koyun ve yaşlarına bağlı olarak 4 santigrat derecede 40 dakika ila 3 saat arasında inkübe edin. Daha sonra, sabit dokuyu her biri 15 dakikada beş değişiklik için yıkamak için 10 mL PBS kullanın.

Sabit dokuyu 1 mL PBS içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın ve stereo mikroskop altında hipofiz bezlerini ayırın. P5 ila P14 hipofizleri için, ince forseps ve makasla sinirler ve kemik arasındaki bağ zarlarını çıkarın ve hipofiz bezini bir bütün olarak lateral trigeminal sinirlerle birlikte dikkatlice izole edin, ancak sella turcica'yı bırakın. P21 ve yetişkin hipofizleri için, hipofizin etrafındaki sinirleri ve bağ zarlarını çıkarın ve bezi çevre dokulardan kurtarın.

Metin protokolüne göre gerçekleştirilen dehidrasyon, ksilen temizleme ve balmumu sızmasından sonra, bir doku gömme konsol sisteminde, örneği kasetten çıkarın ve erimiş parafin mumu ile yarı doldurulmuş bir temel kalıba yerleştirin. P21 ve yetişkin hipofiz bezleri için, hipofiz bezini kısa ekseni bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde konumlandırmak için ısıtılmış ince forseps kullanın. P0 ila P4 hipofizleri için, numuneleri sfenoid kemikleri bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde yönlendirin.

P5 ila P14 hipofiz bezleri için, numuneleri trigeminal sinirleri bir taban kalıbının alt yüzeyine dik olacak şekilde yönlendirin. Bezi yerleştirdikten sonra, balmumu bir soğutma plakası üzerinde yarı katı hale gelene kadar dokuyu istenen pozisyonda nazikçe tutmak için ısıtılmış ince forseps kullanın. Kalıbı erimiş parafin mumu ile doldurun.

Balmumu tamamen katılaşana kadar parafin bloğunun soğumasına izin verin. Parafin bloğunu eksi 20 santigrat derecede 10 ila 20 dakika soğutun, ardından ince dilimler halinde kesmek için bir mikrotom kullanın, kesitleme sırasında parafin bloğunun konumunu ince ayarlayın. Metin protokolüne göre immün etiketleme yapın.

Burada gösterildiği gibi, yenidoğan faresinden hipofiz bezini incelemek için, hipofiz bezini içeren tüm sellar bölge, trigeminal sinirler ve altındaki sfenoid kemik kafa tabanından diseke edildi. Küçük ve hassas hipofiz bezi işlem sırasında sağlam kaldı. Beş günden daha eski fareler için, lateral trigeminal sinirlere bağlı hipofiz bezleri izole edildi.

P7 faresinden izole edilen hipofiz bezinin büyüme yapısı iyi korunmuştur. Burada, P21 faresinin hipofiz bezi, çevresindeki dokuyu çıkarırken gözle görülür bir hasar olmadan başarılı bir şekilde izole edildi. Bu şekilde, düzgün yönlendirilmiş koronal bölümlerin H&E boyaması, P0, P7 ve P21 hipofiz bezlerinde hem adenohipofiz hem de nörohipofizin iyi korunmuş morfolojisini göstermektedir.

Son olarak, işlenen slaytlar immünofloresan etiketleme ile de uyumluydu. Örnek olarak, adenohipofiz ve nörohipofiz, sırasıyla GH ve GFAP'nin spesifik immünoetiketlemesini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, diseksiyondan gömmeye kadar olan süreç, yetişkin farelerde 7.5 saat içinde ve uygun şekilde yapılırsa genç farelerde daha da az yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hipofiz bezine herhangi bir cerrahi aletle dokunmaktan kaçınmak için tüm sellar bölgesini incelemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, önceden eklenmemiş hipofiz de izole edilebilir. Bu durumda, istenmeyen hasarları önlemek için daha dikkatli olunmalıdır.

Bez ayrıca mümkün olduğunca çabuk disseke edilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, fare hipofiz bezlerinin nasıl diseksiyon edileceğini ve farklı gelişim aşamalarında hipofiz koronal bölümlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.