Name: Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, fare korteksinden translasyonel olarak aktif sinaptoneurozomları süreksiz Percoll-sakkaroz yoğunluk gradyanı kullanarak izole etme yöntemini. Bu teknik, mekanik hasarı en aza indirerek sinaptik fonksiyon çalışmaları için yüksek kaliteli örnekler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, elektron mikroskobu için, Wisconsin-Madison Elektron Mikroskobu Tesisi Üniversitesi&#39;nden BK Ağustos teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe R01-DA026067 ve P30-HD03352 (JSM) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlıklar 1-4 <ol><li> 50 ml 2.5 M sakkaroz bulamaç karıştırılarak 500 mL (GM), degrade orta tampon hazırlayın, 1M Tris-HCl, pH7.5 hisse senedi ve 0,5 m EDTA 0.1 ml 2.5 ml, pH 8.0, stok Mili S su hacmi. Çözümü, kısım ve mağaza dondurulmuş sterilize edin Filtre. </li><li> Mili-Q H 2 O. 1 mM çözüm yaparak tetrodotoxin (TTX) 1000x stok hazırlayın TTX alikotları -20 ° C'de saklanabilir </li><li> Mili Q suyu 100 mM Tris (pH 7.5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3 ve 800 mM NaCl çözeltisi yaparak 10x Uyarım Tampon hazırlayın. Stok 4 saklanabilir ° C </li><li> Pre-cool santrifüjler için 4 ° C </li><li> Mili Q suyu 2.5 M sakkaroz (2 ml) 1 hacim Percoll (18 ml) 9 hacim ekleme Isosmotic Percoll (SIP) stok solüsyonu hazırlayın ve iyice karıştırın. </li><li> GM tampon SIP ilgili tutarların eklenmesi ve her karıştırma 3, 10, 15, ve% 23 degrade katmanları hazırlayın: </li></ol><img alt="Tablo 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 0"><ol start="7"><li> P1000 Gilson Pipetman kullanarak kapaklar Beckman santrifüj tüplerine 2 ml 23, 15, 10, ve% 3 isosmotic Percoll çözümleri pipetleme degrade katmanları dökün. Katmanlar arasında arayüz katmanları hiçbir karıştırma ile açıkça ayırt edilebilir olmalıdır. Gradyanlar kullanmadan önce en az 20 dakika süreyle 4 ° C'de saklayın. Gradyanlar aynı gün kullanılması tavsiye edilir rağmen 24 saate kadar saklanabilir. [Deneyimsiz laboratuvar personeli mavi boya katmanı arayüzleri görünüm için isomotic Percoll çözümler ekleyerek hazırlanıyor gradyanlar pratik.] </li></ol> 2. Fare diseksiyonu 1 <ol><li> Tüm fare hayvancılık ve ötenazi prosedürleri NIH ve Üniversite kurallarına uygun olarak yapılır emin olun. Karbondioksit boğulma ya da hayvan protokolü olarak onaylanmış bir yöntem ile yavrular (yaş P13 P21) Euthanize. </li><li> Diseksiyonu kuruluna fare Pin ve etanol ile boyun ve baş arkasında sprey. Kafatası tabanında omurilik kesti keskin bir makas kullanarak, kafatasının üst deri kaldırmak parietal kemik ve interparietal kemik arasında veya beyin ve korteks bölgelerinde arasındaki yanal kafatası kesmek. Sonra burun tabanı (sagital sütür boyunca) kafatasının kesilmiş, dikkatle yumuşak parietal kemik tarafında her yarımkürede çekerek çıkarın ve bir spatula ile korteks kaldırmak. Spatula beyincik Yukarıdaki beyin içine takın ve daha sonra korteks kepçe ve buz GM tampon yerleştirmek. Homojenizasyon adıma hemen geçin. Korteks bu SNS oluşumunu olumsuz etkileyecek, çok uzun süre buz tampon oturmak izin vermeyin. </li></ol> 3. Homojenat ve SNS 1-4 hazırlanması <ol><li> Buz GM tampon korteks yıkayın ve soğuk GM tampon 5 ml içeren bir cam Dounce homojenizatör iki korteks transferi. </li><li> Yavaşça gevşek havaneli 5-10 vuruş ile korteks homojenize (havaneli "A"), 5-10 vuruş sıkı havaneli (havaneli "B") izledi. Darbeleri hızlı ama hava kabarcıkları neden yeterince yavaş olmalıdır. Programı 1 homojenizasyon sonra Homojenat bir resim. Vuruş sayısı, bireysel Homojenizatör ve beraberindeki havan bağlı olarak değişecektir. Gradyanlar vuruş sayısı değilse, güçlü bir SN band verdiği ayarlamanız gerekir bitirdi. </li><li> 4 15 ml konik ve 1000xg az 10 dakika süreyle santrifüj ° C sallanan bir kova rotor (Allegra 6KR santrifüj) Homojenat pelet hücresel enkaz ve çekirdekler aktarın. Bükülmüş Homojenat Resim Programı 1. </li><li> 4 5 dakika 32.500 xg'de Percoll-sukroz gradient, kap tüpleri, santrifüj başına süpernatant Layer 2 mL ° C (Beckman J2-21 santrifüj, JA-17 rotor) sabit açılı rotor (uygun adaptörler kullanarak Reaktifler ve Ekipmanları Masa bakınız. ) </li><li> Pipet ve cam Pasteur pipeti kullanarak SN bant çözümü yukarıda atın. 15/23% arayüzü SN bant kapalı Pipet, buz üzerinde konik ve mağaza aktarın. Her degrade veya bir korteks 0,9-1,1 ml SN üretecektir. </li><li> 12 nM bir final konsantrasyon 1000x CaCl 2 ve nonspesifik uyarma bastırmak için 1 mcM bir son konsantrasyonu 1 mM TTX stok eklemek SNS tuz konsantrasyonu, 10x stimülasyon tampon onda biri hacmi ekleyerek ayarlayın. (Downstream SN uygulamaları ile engel olacak CaCl 2 ilavesi isteğe bağlıdır). </li><li> Micro BCA Protein Testi Kiti kullanarak SNS protein konsantrasyonu belirleyin. (Bradford protein testi Percoll çıkarımlar nedeniyle tavsiye edilmez.) </li><li> SNS protein transla doğrudan ve hızlı bir şekilde kullanılabilirTION çalışmalar. Diğer uygulamalar için SN lizat temizlenmeli veya Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanarak konsantre olabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Fare korteks süreksiz Percoll-sakaroz gradyanlar (Şekil 1), 6 bant veya kesirler homojenize ve ayrıldı (Şekil 1) görüldü. Daha önce, yüksek molekül ağırlıklı gruplarından bileşenlerinin membran ve miyelin kırık ve pelet malzeme (Tablo 1) mitokondri veya organelleri yer alan olduğunu serebral korteks 3,5 sıçan gösterildi . % 23 /% 15 arayüzü (Band 5) zenginleştirilmiş SNS içeriyordu. Sağlam SNS içeren% 23 /% 15 arayüzü, bant kaldırılır ve daha önce açıklandığı gibi, elektron mikroskobu (EM) tarafından incelenmiştir. 2,6 EM sağlam sinaptik veziküllerin varlığı ve presinaptik ve postsinaptik elemanlarının korunması (Şekil gösterdi 2). Pre-ve postsinaptik bölmeleri izolasyonu, sinyalizasyon ve her iki bölümlerinde meydana protein sentezi, incelenmesi için önemlidir. 7-13 Percoll sukroz gradient SN fraksiyonu küçük hücresel, nükleer ve organel kirlenme gördüm, böylece ham arıtma ama genel ayrılması iyi oldu. Western Blot bakıldığında, Percoll kesirler SN bant (Şekil 3, Tablo 2) sinaptik saflık bir artış bekleniyor protein damgalı içeriyordu. Synaptic ve nöronal belirteçler zenginleştirilmiş SN bant (Band 5) muhafaza edildi ama diğer belirteçlerin bolluk önemli ölçüde azaldı. Özellikle, yapısal ve sinaptik belirteçler muhafaza veya gelişmiş iken GFAP, glial kökenli astrosit ve neoplastik hücreler için bir marker ve Lamin-B1, nükleer bir marker, varlığı, azdı. Buna ek olarak, protein sentezinde önemli bir rol oynayan mitokondri ve golgi gibi organelleri, belirteçleri saklama vardı. BCA protein testi ile belirlenen SN grup için tipik verim mcL başına protein 250-500 ng. SNS 50 mcM glutamate/10 mcM glisin ile uyarılmış olduğu SNS faaliyet de novo protein sentezi miktarı tespit edildi [35S]-Met dahil edilmesi (Şekil 4) tarafından izlenir gibi mevcut. 2 Bazal translasyonel aktivite 1.56 kat arttı (Glu) ya da aktif kat 5.12 Pin1 inhibitörü juglone'un. Pin1 inhibisyonu [35S]-Met eklenmesi de novo protein sentezinin artması nedeniyle olduğunu onaylamak için artan protein sentezini 2 bilinir, biz 40 mcM anisomycin, protein sentezi inhibitörü eklenen ve belirgin bir azalma dahil gördüm bazal düzeylere göre Glu Mobile varlığı ve yokluğu. Ayrıca,% 2 SNS bütünlüğünü bozan Triton-X 100, ek üzerine, bazal çeviri% 75 oranında azalmıştır. 2 Buna ek olarak, en sinaptik işaretleyici zenginleştirme gösterdi bantları (B4-B6) incelerken, SNS veya Band 5 de novo protein sentezi (Şekil 5) en büyük faaliyet vardı. Böylece, süreksiz Percoll sakaroz gradyanlar hızlı protein çeviri çalışma için kullanılabilecek bir aktif ve yüksek derecede zenginleştirilmiş SN bant üretir. Çünkü sert koşulları tarafından mekanik hasarlara neden süreksiz Percoll sukroz gradient işlemi diğer yöntemlere göre daha avantajlıdır. Kortikal Homojenat temizlenir filtrasyon yöntemi ile karşılaştırıldığı zaman boyutunda azalma, 3,14-15 Percoll yöntemi, daha fazla aktivite ile daha fazla SNS formları filtreleri bir dizi geçirilir. Şekil 6, 15/23% arayüzü çok daha az kırık membranların SNS ve büyük miktarda vardır Percoll sukroz gradient üzerinde filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS bir kısım geçti görüldüğü gibi. De novo protein sentezi S35-met birleşme yoluyla ölçüldü, filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS çok daha az aktif olan (Şekil 7). Translasyonel aktivite en üst düzeye çıkarmak için P14 ve P18 yaş arasında olan fareler kullanın. SN yetişkin farelerin hazırlanan, ancak juvenil fareler (Şekil 8) hazırlanan SN translasyonel aktivite önemli ölçüde artış görülmektedir olabilir. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1. Homojenize fare korteksin süreksiz Percoll degrade since gruplarından bileşenleri 3,5 <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 2"> Tablo 2. Süreksiz Percoll sukroz gradient bant bileşenlerinin Batı cıvata analizinin özeti her grubun kesirler Bağıl protein konsantrasyonları süreksiz Percol kullanarak izolel-sukroz gradient Western Blot tarafından belirlenir. Proteinini yok (-) 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), veya&gt; 0.8 (+++) kat daha fazla n süpernatant (S, santrifüj korteks Homojenat), temsilci protein mevcut = 3. <img alt="Şema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Programı 1"> Programı 1: süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanarak SN hazırlanması şematik Fare beynin korteks disseke homojenize ve homojenize olmayan doku, hücre çekirdekleri ve membranlar gibi tüm organelleri kaldırmak için düşük hızda santrifüj edildi. Süreksiz degrade katmanları açıkça tanımlanmış olması gerekir. Inset resim sadece katmanları görselleştirmek için amaçlıdır mavi boyalı olan katmanları, bir örnek gösterir. Süpernatant süreksiz Percoll sakaroz degrade üst katmanlı ve orta hızda santrifüj edilir. SN grup, daha sonra degrade alınan ve kullanıma hazır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Süreksiz Percoll sakaroz degrade Homojenat fraksiyonasyon. Fare korteks homojenize ve 6 bantlar veya kesirler sebebiyet veren bir süreksiz Percoll-sukroz gradient ayrıldı. Saflaştırılmış, aktif SNS (*) Band 5 bulundu. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. SN hazırlıkları presinaptik ve postsinaptik unsurlarını muhafaza SNS heterojen bir karışım verir. SN hazırlık C57BL / 6 farelerinde (yaş P13 ile P21) hazırlanan bir elektron mikrografı korunmuş presinaptik ve postsinaptik elemanları ile daha önce açıklanan ve gösterir SNS olarak yapıldı. 2 6 Kırmızı oklar noktası post-sinaptik yoğunlukları. Ölçek çubuğu 1 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. SN hazırlıkları Western Blot analizleri sinaptik ve nöronal işaretleri saflaştırılmış SNS muhafaza olduğunu gösterdi (Band 5), ancak diğer belirteçlerin bolluğu önemli ölçüde azaldı. Süpernatant Immunoblots (S, kortikal Homojenat santrifüjle) ve bir süreksiz Gruplar 1-6 Percoll-sukroz gradient (postsinaptik yoğunluğu β-Aktin (yapısal, yükleme kontrolü), GFAP (astrositik), GP73 (Golgi), HSC70 (sitoplazmik ve nükleer), Lamin-B1 (nükleer), Prohibitin (mitokondrial) PSD95 için probed ), SNAP25 (sinaptik), sinaptofizin (sinaptik) ve β3-tubulin (nöron-spesifik). Bantları temsilcisi n = 3, Storm 860 Phosphorimager kullanılarak görüntülendi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. SNS aktif ve [35S]-Met eklenmesi ile de novo protein sentezi gösterirler. SNS 37 ° C'de 10 dakika süreyle ön-dengelenmiş. Sonra SNS, 37, 40 mcM anisomycin veya 1 mcM juglone'un ile 15 dakika süreyle tedavi edilmezse veya ön tedavi ° C-Met, 20 ul Express Pro Etiket artı veya eksi Glu 37 S35 Kolay Etiket Mix [35S] ilave edilerek takip ° C 30 dk. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Band süreksiz Percoll sukroz gradient 5 de novo protein sentezinin en yüksek seviyede yer alıyor . 4, 5 ve 6 Gruplar ve supernatant (S), kortikal Homojenat santrifüjle 37 ön-dengelenmiş ° C 10 dak. Sonra, [35S]-Met, Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket eklendi, artı ya da eksi 37 ° Glu ° C de 30 dakika oldu. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Filtrasyon yöntemi hazırlanan SNS süreksiz Percoll sukroz gradient yöntemi hazırlanan SNS daha kırık membranlar ve daha az bütün SNS içerir . SNS, daha önce açıklandığı gibi gözenek boyutu azalan filtreler bir dizi homojenize korteks geçerek hazırlanmıştır. 3,14-15 filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS bir kısım süreksiz Percoll sukroz gradient üzerinde santrifüj ve eşdeğer bir miktara göre süreksiz Percoll-sukroz gradient yöntemi kullanılarak malzeme. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7. Filtrasyon yöntemi hazırlanan SNS SNS fro hazırlanan daha az de novo protein sentezi aktivitesi içerenm süreksiz Percoll sukroz gradient yöntemi. SNS azalan gözenek boyutu ile daha önce açıklandığı gibi filtreler, 3,14-15 bir dizi ile homojenize korteks geçirerek ve süreksiz Percoll-sukroz gradient metodlar tarafından hazırlanmıştır. SNS hem hazırlıkları 37 ön-dengelenmiş ° C 10 dak. Sonra, [35S]-Met, Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket eklendi, artı ya da eksi 37 ° Glu ° C de 30 dakika oldu. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8. Genç farelerde (P14) SNS yaşlı farelerin (P85) daha büyük translasyonel bir faaliyet var. SNS Glu Mobile ile 10 dakika süreyle 37 ° preequilibrated süreksiz Percoll-sukroz gradient yöntemi, ° C kullanarak farklı yaşlı farelerde hazırlanan tedavi veya tedavi edilmemiş edildi varlığı [35S]-Met, çıtçıt dondurulmuş, 30 dakika (Express Pro Etiket S35 Kolay Etiket Mix) ve daha sonra Pierce, SDS-PAGE Örnek Hazırlık Seti ile temizlenir. SNS, sonra% 12 SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak kurutulmuş ve n = 3, ± SEM Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, temsilci görüntülü edildi. P14 fareler SNS P85 farelerin en az 3 kat daha aktif.

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li>
<li>Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density%3A+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li>
<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan süreksiz Percoll sukroz gradient hazırlık sinaptik iletim deneyler çeşitli kullanılabilir aktif SNS, izole etmek için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Dunkley ve ark. 3,4 tarafından geliştirilen yöntem dayanmaktadır Bu gradyan yöntemi, birbiri ile ilişkili hem de pre-ve postsinaptik membran kaynaklı veziküller izole bir hücre içi beyin fraksiyonasyon işlemdir. Ileri arıtma olmadan bu SNS immunoprecipitation, batı blot, flow sitometri, [35S] üzerinden Met dahil, elektron mikroskobu ve enzim a...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Testi Kiti </td><td> Delmek </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Balıkçı </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 gaz </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Balıkçı </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Balıkçı </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Balıkçı </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE Örnek Hazırlık Seti </td><td> Delmek </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Balıkçı </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Balıkçı </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Diseksiyon araçları </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homojenizatör, 7 ml (iki cam ile birlikte &quot;A&quot; ve &quot;B&quot; etiketli havan) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8 Rotor, Sallanır kova rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Santrifüj </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman tüpleri ile kapaklar </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Beyaz duvarlı adaptörleri </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Mavi duvarlı adaptörleri </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Sabit açılı rotor </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Batı lekeler için kullanılan antikorların Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Antikor Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Ev Sahibi Türler </th><th> Seyreltme Faktörü </th></tr><tr><td> beta-aktin </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> fare </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65.343 </td><td> fare </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-134.509 </td><td> tavşan </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> fare </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-6261 </td><td> keçi </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28.259 </td><td> tavşan </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> fare </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> tavşan </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Sinaptofizin </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> fare </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubulin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80.016 </td><td> fare </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

süreksiz percoll sakkaroz yoğunluk gradient kullanarak fare cortex synaptoneurosomes hazırlanması

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNS) fare beyin korteksi homojenizasyon ve bölümleme sonra elde edilir. Bunlar kortikal doku homojenize akson terminalleri kurtulmak vezikül veya izole terminalleri kapatılmalı. SNS sinaptik iletim çalışmasında faydalı kılan, pre-ve postsinaptik özelliklerini korurlar. Nöronal sinyal kullanılan moleküler makine korumak ve alımı, depolama ve nörotransmitterlerin salınımı yeteneğine sahiptir. Aktif SNS üretim ve izolasyon sitotoksik ve SNS mekanik hasar nedeniyle düşük aktivite neden olabilir, yüksek yoğunluklu ve filtrasyon ve santrifüj yöntemleri nedeniyle genişletilmiş santrifüj gerektirebilir Ficoll gibi sorunlu kullanarak medias olabilir. Ancak, süreksiz Percoll sakaroz yoğunluğu gradyanlar SNS izole etmek için kullanmak translationally aktif SNS iyi verim üretmek için hızlı bir yöntem sağlar. Percoll sukroz gradient yöntemi, hızlı ve nazik bir pelet SNS ve mekanik hasara neden olduğu, izotonik koşullar istihdam ve daha az ve daha kısa santrifüj spin santrifüj adımları önler.

Fare beyin korteksi translationally etkin, sağlam synaptoneurosomes (SNS) hazırlamak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, aktif SNS hızlı hazırlanması için izin veren bir süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanır.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Sinaptonörozomlar (SN'ler), fare beyin korteksinin homojenizasyonu ve fraksiyonasyonundan sonra elde edilir. Bunlar, yeniden mühürlenmiş veziküller veya izole edilmiş terminallerdir ve ...

Bu prosedürün genel amacı, kesikli bir sükroz yoğunluk gradyanı kullanarak fare beyin korteksinden translasyonel olarak aktif sinaptoneuro zonlar hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle fare kortekslerinin toplanıp homogenize edilmesi ve ardından homogenatın santrifüj edilmesiyle gerçekleştirilir. Bunun ardından, santrifüj edilen homogenat veya süpernatan, önceden hazırlanmış sükroz gradyanlarına uygulanır.Son adım, sinaptozom fraksiyonunu santrifüj ederek toplamaktır. Nihayetinde, western blot analizi ve S 35 metiyonin inklüzyon deneyleri, sinaptozom fraksiyonunun sinaptik olarak zenginleşmiş ve translasyonel olarak aktif olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin santrifüjasyon ve filtrasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; ilk olarak, yoğunluk gradyanları kullanılarak mekanik hasarın önlenmesi ve ikinci olarak, kullanılan bileşenlerin hücreler üzerinde düşük toksisiteye sahip olmasıdır.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, zamanlamanın kilit bir rol oynaması nedeniyle bu protokolde zorluk yaşayabilirler. Korteksler toplandıktan sonra prosedür hızla tamamlanmalıdır. Prosedüre başlamak için, eşlik eden makalede açıklandığı şekilde GM tamponuna uygun miktarlarda SIP ekleyerek %3, 10, 15 ve 23'lük gradyan katmanlarını hazırlayın ve iyice karıştırın.Her bir %15, %10 ve %3 izosmotik perol çözeltisinden iki mililitre pipetleyerek kapaklı Beckman santrifüj tüplerine döküp gradyan tabakalarını oluşturun. P 1000 pipet kullanarak, tabakalar arasında hiçbir karışma olmadan arayüzün net bir şekilde ayırt edilebilir olması gerekir. Gradyanları kullanmadan önce en az 20 dakika boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın.Bu prosedüre başlamadan önce, beraberindeki makalede açıklandığı şekilde diğer gerekli solüsyonları hazırlayın. P 13 ile P 21 yaşındaki fareyi ötanize edin ve ense ile baş bölgesine %70 ethanol püskürterek diseksiyona hazırlayın. Ardından, kafatasının tabanındaki omuriliği kesmek için bir çift keskin makas kullanın.Ardından, kafatasının üst kısmındaki deriyi çıkarın. Kafatasını lateral olarak parietal kemik ile inter parietal kemik arasından veya cerebrum ile korteks bölgeleri arasından kesin. Bundan sonra, kafatasını sagittal sütür boyunca tabandan buruna doğru kesin.Bu adımda, her bir hemisferi yanlara doğru çekerek yumuşak parietal kemiği dikkatlice çıkarın. Ardından, korteksi sıyırmak için spatulayı beyne, serebellumun üzerine yerleştirin. Korteksi buz gibi soğuk GM tamponuna yerleştirin ve daha fazla korteks toplamak için prosedürleri tekrarlayın.Şimdi korteksleri buz soğukluğundaki GM tamponu ile durulayın. Ardından iki korteksi, beş mililitre soğuk GM tamponu içeren cam bir homogenizatöre aktarın. Korteksleri önce gevşek havan olan havan A ile beş ila 10 darbe, ardından sıkı havan olan havan B ile beş ila 10 darbe uygulayarak nazikçe homogenize edin.Vuruş sayısı, kullanılan homojenizatöre bağlı olarak değişiklik gösterir. Homojenize edilen örneği 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 1000 kez santrifüjleyin.Hücresel kalıntıları ve çekirdekleri çöktürmek için Allegra six KR santrifüjünde, dört degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca Gravity uygulanır. Her bir per veya sukroz gradyanı için iki milliliters süpernatant eklenir; her bir bütün korteks için bir gradyan kullanılır ve tüpler kapatılır. Ardından, Beckman J 2 21 santrifüjünde, sabit açılı rotorda, dört degrees Celsius'ta beş dakika boyunca 32, 500 times gravity hızında santrifüj edilirler.İşlem tamamlandığında, uygun adaptörler kullanılarak gradyan, güçlü bir SN bandı vermelidir; SN bandının üzerindeki çözeltiyi pipetle çekip atın. Bir cam pasta pipet kullanarak, %15 ile %23 arayüzündeki SN bandı pipetle çekilir; bir gradyan genellikle yaklaşık 0,9 ila 1,1 mililitre SN verir. Ardından, bunu konik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.Ardından, SNS'nin tuz konsantrasyonunu 10 kat yoğunluktaki stimülasyon tamponunun 1/10 hacmini ekleyerek ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, final konsantrasyonu 12 nano molar olacak şekilde 1000 kat yoğunlukta kalsiyum klorür ekleyin. Son olarak, spesifik olmayan eksitasyonu baskılamak için final konsantrasyonu bir mikromolar olacak şekilde bir milimolar TTX stok çözeltisi ekleyin.Bir sonraki adım, SNS'nin protein translasyon çalışmaları gibi uygun alt uygulamalarda kullanılmasıdır. Diğer uygulamalar için SN lizatı, Pierce SDS page örnek hazırlama kiti kullanılarak temizlenebilir veya konsantre edilebilir. SNS'nin protein konsantrasyonu, mikro BCA protein analiz kiti kullanılarak belirlenebilir.Burada altı bant veya fraksiyon örneği verilmiştir. Fare korteksi homojenize edilip süreksiz perkol sukroz gradyanlarında ayrıştırıldığında, zenginleştirilmiş SNS'ler %23 ile %15 ara yüzeyindeki beşinci bantta yer almıştır; bu bant çıkarılmış ve elektron mikroskobu ile incelenmiştir. Bozulmamış sinaptik veziküller ile presinaptik ve postsinaptik elementlerin korunumuna dair bir örnek, buradaki western blot görüntüsünde gösterilmiştir.Sürekli olmayan bir sükroz gradyanından elde edilen SN bandında sinaptik belirteçlerdeki artış ve safsızlıklardaki azalma, glutamat eklenmesi üzerine S 35 metiyonin inklüzyonundaki artışın de novo protein sentezinden kaynaklandığını doğrulamak için gösterilmiştir. Bir protein sentezi inhibitörü olan 40 micromolar anesa mycin eklenmiştir. Bu şekil, bazal seviyelerle karşılaştırıldığında, glutamat varlığında veya yokluğunda anso mycin mevcudiyetinde S 35 metiyonin inklüzyonundaki belirgin azalmayı göstermektedir.Böylece, süreksiz peral sakkaroz gradyanları, protein translasyonunu incelemek için kullanılabilecek, oldukça aktif ve nispeten saf SNS'leri hızlı bir şekilde üretir. Bu şekil, süreksiz per çekirdek sakkaroz gradyanındaki beşinci bandın en yüksek düzeyde de novo protein sentezi içerdiğini göstermektedir. Karşılaştırma amacıyla, homojenize edilmiş korteksin azalan gözenek boyutuna sahip bir dizi filtreden geçirilmesi ve ardından süreksiz per çekirdek sakkaroz gradyanında santrifüjlemesiyle hazırlanan SNS, süreksiz peral sakkaroz gradyanı yöntemiyle hazırlanan SNS'ye göre daha fazla parçalanmış membran ve daha az bütün SNS içerir. Süreksiz peral sakkaroz gradyanı yöntemi kullanılarak hazırlanan SNS'lerin, filtrasyon yöntemiyle hazırlanan SNS'lere göre daha fazla de novo protein sentezi aktivitesi içerdiği görülmektedir.Genç farelerden hazırlanan SNS'lerin, yaşlı farelere kıyasla daha yüksek translasyonel aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, fare kortekslerini homojenize ederek, homojenatı salınımlı kova rotorunda santrifüj ederek, süpernatantı sabit açılı bir rotorda sükroz gradyanı üzerinden santrifüj ederek ve ardından ortaya çıkan sinaptik nörozon bandını toplayarak translasyonel olarak aktif sinaptik nörozonların nasıl izole edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olacaksınız.

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare kortekste nöronal kültürlerin üretmek için bir prosedür gösterir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme için kullanılan ve doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal geliştirme çalışması için bir platform sağlamak olabilir.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

Bu video, inme araştırmalarında inflamasyon tepkilerini incelemek için beyin hücrelerinin ve sızmış bağışıklık hücrelerinin iskemik fare beyin dokularından enzimatik sindirim yoluyla izole edilmesi, ardından hücre kalıntılarının ve miyelinin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile uzaklaştırılması prosedürünü göstermektedir.

İskemik Fare Beyin Dokularından Hücre Süspansiyonlarının Elde Edilmesi

Kaynak: Lunelli, L., et. al. Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polizomlarına Bakış. J. Vis. Exp.(2016). Bu video, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak polizomların görüntülenmesini göstermektedir. Nikel iyonları kaplı bir mika levhası, RNA'yı bağlı ribozomlarla sabitler. Numune yıkanır, kurutulur ve mikroskop tablasına monte edilir. Konsol ucu, topolojiyi haritalamak için lazer sapmalarını kaydederek numune yüzeyini tarar. Yazılım, bozulmaları düzeltmek ve yüksek çözünürlüklü polizom...

 Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyninden İzole Edilen Polizomların Görüntülenmesi

Bu makalede, bir sükroz gradyanı üzerinde süreksiz bir ultra-santrifüj ile sinaptik plazma membranı ile bağlantılı proteinlerin zenginleştirme göstermektedir. Post-sinaptik yoğunluk proteinlerin takip eden hazırlama de tarif edilmektedir. Protein preparatları western blotting ya da 2 boyutlu DIGE analiz için uygundur.

Süreksiz Sukroz Degrade&#39;yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Ribozom yapısı kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, polizomların organizasyonu hala yeterince çalışılmamıştır. Bu bilgi eksikliğinin üstesinden gelmek için, burada memeli polizomlarının hava ve sıvıda atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile doğru görüntülenmesi için ayrıntılı bir hazırlık protokolü sunuyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

Sinaptik plastisiteyi ve hafızayı kontrol eden moleküllerin ve yolakların tanımlanması, sinirbilimde hala büyük bir zorluktur. Burada, işitsel bir öğrenme paradigmasında öğrenme ve hafıza konsolidasyonu sırasında sinapsların moleküler yeniden düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılan sinaptik proteinlerin göreceli nicelleştirilmesini ele alan bir iş akışı açıklanmaktadır.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Yeni beyin bölgelerindeki genç nöronlar zorlu nasıl çevre nöronal kader ve olgunlaşma sculpts içine önemli anlayışlar ortaya çıkarabilir. Bu iletişim kuralı interneuron öncüleri belirli beyin bölgelerinden hasat ve onları her iki homotopically nakli için bir yordam açıklanır veya beyin ve postnatal yavrularını içine heterotopically.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Bu protokol, fare beyninden son derece saf sinaptozomlar, sinaptik veziküller ve diğer sinaptik fraksiyonları elde etmek için sağlam ve ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein lokalizasyonunun ve fonksiyonunun kompartmanlı çözünürlükle biyokimyasal analizi de dahil olmak üzere sinaptik süreçlerin değerlendirilmesini sağlar.

Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Öğrenin, fare korteksinden translasyonel olarak aktif sinaptoneurozomları süreksiz Percoll-sakkaroz yoğunluk gradyanı kullanarak izole etme yöntemini. Bu teknik, mekanik hasarı en aza indirerek sinaptik fonksiyon çalışmaları için yüksek kaliteli örnekler sağlar.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Daha fazla video keşfet