Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, süreksiz bir peral sükroz yoğunluk gradyanı kullanarak fare beyin korteksinden nöro bölgelere translasyonel olarak aktif sinap hazırlamaktır. Bu, önce fare kortekslerinin toplanması ve homojenleştirilmesi ve ardından homojenatın santrifüjlenmesiyle gerçekleştirilir. Bunu takiben, santrifüj homojenatını veya takviyeyi, kokroz sükroz gradyanlarına göre preport'a uygulayın.

Son adım, sinaptozom fraksiyonunu santrifüjlemek ve toplamaktır. Sonuç olarak, western blot analizi ve S 35 metiyonin dahil etme deneyleri, sinaptozom fraksiyonunun sinaptik olarak zenginleştirilmiş ve translasyonel olarak aktif olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin santrifüjleme ve filtrasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, ilk mekanik hasarımızın yoğunluk gradyanları kullanılarak önlenmesi ve çağrı başına ikincisi, bileşenlerindeki hücrelere karşı düşük toksisiteye sahip olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler bu protokolle mücadele edeceklerdir çünkü zamanlama kilit bir rol oynar. Kortis alındıktan sonra işlem hızlı bir şekilde tamamlanmalıdır. Prosedüre başlamak için, ekteki el yazmasında açıklandığı gibi ilgili miktarlarda SIP'yi GM tamponuna ekleyerek %3, 10, 15 ve 23 gradyan katmanlarını hazırlayın ve iyice karıştırın.

23, 15, 10 ve %3'lük izozmotik perol çözeltilerinin her birinden iki mililitre pipetleyerek gradyan katmanlarını kapaklı Beckman santrifüj tüplerine dökün. Bir P 1000 pipeti kullanarak, katmanlar arasındaki arayüz, katmanlar karıştırılmadan net bir şekilde ayırt edilebilir olmalıdır. Kullanmadan önce dört santigrat derece gradyanları en az 20 dakika saklayın.

Bu prosedüre başlamadan önce, ekteki el yazmasında açıklandığı gibi diğer gerekli çözümleri hazırlayın. Fareyi P 13 ila P 21 yaşlarında ötenazi yapın ve boynun arkasına ve başa% 70 etanol püskürterek diseksiyon için hazırlayın. Ardından, kafatasının tabanındaki omuriliği kesmek için keskin bir makas kullanın.

Ardından, cildi kafatasının üstünden çıkarın. Kafatasını parietal kemik ile inter parietal kemik arasında veya beyin ve korteks bölgeleri arasında yanal olarak kesin. Bundan sonra, kafatasını sagital sütür boyunca tabandan buruna doğru kesin.

Bu adımda, her yarım küreyi yana doğru çekerek yumuşak parietal kemiği dikkatlice çıkarın. Bundan sonra, korteksi çıkarmak için spatulayı beyinciğin üzerindeki beyne yerleştirin. Buz gibi soğuk GM tamponuna yerleştirin ve daha fazla korteks toplamak için prosedürleri tekrarlayın.

Şimdi korteksleri buz gibi soğuk GM tamponunda durulayın. Daha sonra iki korteksi beş mililitre soğuk GM tamponu içeren bir cam aşağı homojenizatöre aktarın. Korteksleri beş ila 10 vuruş havaneli A, gevşek havan tokmağı ve ardından havaneli türü olan beş ila 10 vuruş havaneli B ile nazikçe homojenize edin.

Vuruş sayısı, her bir homojenizatöre bağlı olarak değişir. Homojenatı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 1000 kez santrifüj edin.

Hücresel kalıntıları ve çekirdekleri peletlemek için bir Allegra altı KR santrifüjünde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yerçekimi. Her bir sükroz gradyanı için iki mililitre supinat veya sükroz gradyanı için bir bütün korteks için bir gradyan ile katmanlayın ve tüpleri kapatın. Daha sonra bunları bir Beckman J 2 21 santrifüjünde dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 32.500 katı sabit açılı bir rotorda santrifüjleyin.

Tamamlandığında uygun adaptörler kullanarak, gradyan güçlü bir SN bandı pipeti vermeli ve çözeltiyi SN bandının üzerine atmalıdır. %15 ila 23 arayüzde SN bandından bir cam makarna pipeti pipeti kullanılarak, bir gradyan genellikle yaklaşık 0,9 ila 1,1 mililitre sns verir. Bundan sonra, konik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.

Ardından, 10 kez stimülasyon tamponunun 10. hacmini ekleyerek SNS'nin tuz konsantrasyonunu ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, 12 ano molar nihai konsantrasyon elde etmek için 1000 kez kalsiyum klorür ekleyin. Daha sonra, spesifik olmayan uyarımı bastırmak için bir mikromolar nihai konsantrasyon vermek için bir milimolar TTX stoğu ekleyin.

Bir sonraki adım, SNS'yi protein çeviri çalışmaları gibi ilgili aşağı akış uygulamasında kullanmaktır. Diğer uygulamalar için SN lizat, Pierce SDS sayfası numune hazırlama kiti kullanılarak temizlenebilir veya konsantre edilebilir. SNS'nin protein konsantrasyonu, mikro BCA protein test kiti kullanılarak belirlenebilir.

İşte altı bant veya kesir örneği. Fare korteksi homojenize edildiğinde ve süreksiz perol sükroz gradyanları üzerinde ayrıldığında, zenginleştirilmiş SNS, %23 ila 15'lik arayüzde beşinci bantta yer aldı, bu bant çıkarıldı ve elektron mikroskobu ile incelendi. Sağlam sinaptik veziküllerin bir örneği ve pre-sinaptik ve post-sinaptik elementlerin korunması burada batı lekesinde gösterilmiştir.

Sinaptik belirteçlerde bir artış ve sakaroz gradyanı başına süreksiz bir süreksizlikten SN bandındaki safsızlıklarda bir azalma, glutamat ilavesi üzerine S 35 metiyonin katılımındaki artışın de novo protein sentezine bağlı olduğunu doğrulamak için gösterilmiştir. 40 mikromolar anesa misin bir protein sentezi inhibitörü eklendi. Bu şekil, bazal seviyelerle karşılaştırıldığında, glutamat içeren veya içermeyen anso misin varlığında S 35 metiyonin katılımındaki belirgin azalmayı göstermektedir.

Bu nedenle, süreksiz peral sükroz gradyanları, protein translasyonunu incelemek için kullanılabilecek oldukça aktif ve nispeten saf SNS'yi hızlı bir şekilde üretir. Bu şekil, çekirdek başına süreksiz sükroz gradyanından beşinci bandın en yüksek seviyelerde de novo protein sentezi içerdiğini göstermektedir. Homojenize korteksin gözenek boyutu küçültülmüş bir dizi filtreden geçirilmesi ve daha sonra karşılaştırma için çekirdek başına süreksiz bir sükroz gradyanı üzerinde santrifüjlenmesiyle hazırlanan SNS'nin, süreksiz perol sükroz gradyan yönteminden hazırlanan SNS'den daha fazla kırık membran ve daha az tam SNS içermesi ile hazırlanan SNS'nin, süreksiz peral sükroz gradyan yöntemi kullanılarak hazırlanan SNS'den daha fazla de novo protein sentezi aktivitesi içerdiği gösterilmiştir.

Genç farelerden hazırlanan SNS'nin yaşlı farelere göre daha fazla translasyonel aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, fare kortekslerini homojenize ederek, homojenatı sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyerek, süpernatanı sabit açılı bir rotorda çağrı başına sükroz gradyanı üzerinde santrifüjleyerek ve ardından elde edilen sinaptik nöro bölge bandını toplayarak translasyonel olarak aktif sinaptik nöro bölgeleri nasıl izole edeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.