Metodoloji balgam indüksiyon ve laboratuvar için

İndüklenmiş balgam tekniği 90'lı yılların başında geliştirilmiştir. Bu teknik, astım, KOAH gibi obstrüktif hava yolu hastalıklarında yeni bilgileri araştırmak için önerilmiştir ve daha yakın zamanda pulmoner fibrozis ile ilgili yeni bilgilere bakmak için de bir ilgi olmuştur. Bu tekniğin ana avantajı, bronkoskopinin aksine nispeten non-invaziv olmasıdır.

İşleme laboratuvar çalışması gerektirir ve zaman alır, bu nedenle oldukça zahmetli, zaman alıcıdır ve laboratuvarda biraz uzmanlığa sahip olması gerekir, bu nedenle her merkezde elde edilmesi zor olan bir tekniktir. İndüklenmiş balgam tekniği iki bölümden oluşur, ilk kısım indüksiyon ve ikinci kısım işlemedir. Balgamı indüklemeden önce, hastanın üretebildiği hacim ve akış hızının bir değerlendirmesi olan bir spirometri yapmamız gerekir.

Ve bunu yapmamız gerekiyor çünkü balgam indüksiyonu kendi başına bronşospazma neden olabilir, bu yüzden hastaların spirometrisinin temel değerini kesinlikle bilmemiz gerekiyor. Bu yüzden önce bir spirometri yapıyoruz, sonra hastalara bronkodilatörler veriyoruz, genellikle 400 mikrogram salbutamol veriyoruz, hastaların hava yollarını maksimum düzeyde açmak ve ayrıca indüksiyon aşamasında oluşabilecek bronşispazmı önlemek için. Ve 15 dakika sonra, spirometrinin temel değeri dediğimiz şeyi elde etmek için spirometriyi tekrar ölçüyoruz ve özellikle hastanın bir saniye içinde nefes verebildiği hacim olan FEV1'e bakıyoruz.

Önerilen seviyeye kadar damıtılmış suyu nebulizatör odasına dökün. Nebulizatör haznesine temiz bir kap yerleştirin. Doldurulmuş kapağı uygun kapakla kapatın.

Bronkodilatör sonrası FEV1 tahmin edilenden daha büyükse bardağı 50 mL hipertonik salin %5 veya bronkodilatör sonrası FEV1 tahmin edilenden azsa 50 mL izotonik salin %9 ile doldurun. Kaba ml başına beş miligram konsantrasyonda 1.75 salbutamol sülfat çözeltisi ekleyin. Tüpleri ve valfleri üretici talimatlarına göre bağlayın.

Teknik, tıbbi gözetim altında gerçekleştirilmelidir. Testin prensibini hastaya açıklayın. Hastadan burun klipsi kullanmasını isteyin.

Nebulizatörü başlatın ve en düşük aerosol seviyesini ve fan ayarını seçin. Hastadan aerosolü ağızlıktan tidal nefes ile solumasını isteyin. Aerosol seviyesi ve fan ayarı hastanın toleransına bağlı olarak artırılabilir.

Solunum rahatsızlığının göğüste sıkışması durumunda, prosedürü durdurun ve hastanın FEV1 değerini ölçmek için bir spirometri yapın. Beş dakikalık inhalasyondan sonra veya öksürük veya mide bulantısı durumunda, nebulizatörü durdurun. Hastadan burun klipsini çıkarmasını, ağzını çalkalamasını ve musluk suyu ile iki kez gargara yapmasını ve bu suyu lavaboya atmasını isteyin.

Daha sonra hasta olarak balgam çıkarıp plastik bir kap içinde boğazdan çıkanları tükürür. FEV1'i ölçmek için ilk solunum manevrasını gerçekleştirin. Balgam üretiminin her denemesinden sonra FEV1 değerini ölçüyoruz.

FEV1 değeri %20'den fazla düşerseişlemi durdururuz ve hastaya işlem sırasında daha önce uyguladığımız beta-iki agonist ile kombinasyon halinde hareket edecek bir antikolinerjik olan ipratropium bromür nebulizasyonunu veririz. FEV1 değeri %20'den fazla düşmezse, hastanın ürettiği balgamın kalitesine ve hacmine göre toplam 10 ila 20 dakika boyunca işlemi sürdürürüz. Balgam örneğini aldıktan sonra, işlenene kadar buzdolabında saklayın.

Yani ikinci kısım balgam işlemeden oluşuyor ve bunun için öncelikle bu işlem için kullanacağımız iki çözümü hazırlamamız gerekiyor. Bu yüzden DTT olarak da bilinen Dithiothreitol'ü hazırlamalıyız. Çözelti, 6.5 milimolar bir çözelti elde etmek için DTT'nin steril su ile seyreltilmesiyle hazırlanmalıdır.

Bu nedenle DTT'yi ortam havasına maruz bırakmaktan kaçınmalısınız ve bunun için bir şırınga ve iğne kullanıyoruz. İkinci olarak, tripan mavisi çözeltisini hazırlamanız gerekir ve bunun için %0.08'lik bir çözelti elde etmek için DPBS'yi tripan mavisi ile seyreltmeniz gerekir.Bu nedenle balgamla ilgili olarak, tüm balgamı 50 mL'lik konik tabanlı bir plastik tüpe aktarmanız ve numuneyi tartmanız gerekir. Üç kat daha fazla DPBS çözeltisi ekleyin.

Numuneyi 30 saniye boyunca yavaşça girdaplayın, 800 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, iki tek kat steril gazlı bezden süzüldükten sonra 50 mL'lik konik tabanlı plastik bir tüpte toplayın. Süpernatanı 2 mL plastik tüplere ayırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Süpernatan numunelerin balgamın üç fazlı bileşeni olarak bizim için yararlı olduğunu unutmayın. Hücre paleti hacmi 5 mL'den azsa, 5 mL'lik bir hücre süspansiyonu hacmine ulaşmak için DPBS ekleyin. Hücre süspansiyonunu 6.5 milimolar'da bir hacim DTT ile seyreltin.

Hücre süspansiyonunu bir tezgah çalışanı ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sallayın. Hücre süspansiyonunu DPBS ile en az üç kez seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu 550 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı atın. Hücre paletini yaklaşık bir ml DPBS'de askıya alın. Hücre süspansiyonunun tam hacmini değerlendirin ve kaydedin.

50 mikrolitre seyreltilmiş tripan mavisi çözeltisine 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve homojenize edin. Numuneyi bir hemosil sitometrenin kapak fişinin altına koyun ve optik mikroskop altına yerleştirin. Hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonunu, skuamöz hücrelerin yüzdesini ve skuamöz olmayan hücrelerin canlılık yüzdesini değerlendirin.

mL başına 500.000 hücrede en az 350 mikrolitre hücre süspansiyonu elde etmek için süspansiyonun bir tahsisini DPBS ile seyreltin. Hücre yoğunlaştırıcıyı üretici talimatlarına göre monte edin. Hücre yoğunlaştırıcının üç bölmesinin her birine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Bir sito santrifüjde oda sıcaklığında 150 g'da iki dakika döndürün. Süpernatanı atın. Sürgünün kurumasına izin verin.

Slaytı, üretici talimatlarına uygun olarak div quick veya nikel değerlik leke kiti ile boyayın. Bir montaj ortamı ve kapak kayması ile monte edin. Slaytı yağa daldırılarak optik mikroskobun altına yerleştirin.

En az 500 skuamöz olmayan hücreyi, nötrofilleri, eozinofilleri, makrofajları, lenfositleri ve epitel hücrelerini sayın ve mutlak değerleri, yüzdeyi ve hücre tipini kaydedin. Sonuçlarla ilgili olarak, hemositometreyi kullanarak, renksiz olan canlı skuamöz olmayan hücreleri saymamız gerekiyor. Ayrıca, mavi renkli ölü skuamöz olmayan hücreler.

Ve skuamöz hücreler. Bu hücreler ağızdan gelen epitel hücreleridir. Büyüktürler, bu nedenle küçük insan hücrelerine kıyasla tanınmaları kolaydır.

Bu yüzden bakteri, maya veya hurda saymaktan da kaçınmalısınız. Hücre süspansiyonu %80'den fazla skuamöz hücre içeriyorsa, bu numunenin kalitesiz olduğu ve bir sitospin lamı için uygun olmadığı kabul edilir. Bu nedenle bu örnek başarısız olarak kabul edilir.

Lekeli sitospin üzerindeki sayım, hücrelerin rengine ve morfolojisine göre yapılır. Nötrofillerin temel özellikleri, hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştıran çok loblu çekirdektir. Bu hücreler yuvarlak, küçük ve nötr pembe renktedir.

Eozinofiller, bu hücreler tanımlanması kolay kırmızı granüllerden oluşur. Bu hücrelerin büyüklüğü nötrofillere yakındır. Makrofajlar, nötrofillerden iki ila beş kat daha büyüktürler ve mavi renklidirler.

Sitoplazma enkaz ve vakuol içerebilir. Lenfositler, bu hücreler yuvarlak ve küçüktür, mavi renklidir ve büyük ve yoğun bir çekirdeğe sahiptir. Epitel hücreleri sütunlu bir şekle sahiptir, pembe renktedir ve genellikle üstte kirpikler bulunur.

Burada, skuamöz hücrelerin %80'inden fazlasına sahip okunamayan bir sitospin örneklerinin bazı örnekleri verilmiştir. Bence çok faydalı bir teknik, ancak çok dikkatli olmalıyız çünkü balgam indüksiyonu tıbbi gözetim altında yapılmalıdır, ancak balgam indüksiyonu tekniği size hava yollarındaki hastaların iltihabi durumu hakkında çok fazla bilgi verir. Süpernatanttaki farklı biyokimyasal belirteçleri ölçmenize izin verebilir ve ayrıca hücresel parçalar üzerindeki farklı şeyleri de ölçebilirsiniz, bu nedenle indüklenmiş balgam, akış sitometrisi, proteomik, transkriptomik ve hatta genomik yapmanıza izin verir.