Dekontamine Balgam Örneklerinde Hedeflenen Yeni Nesil Dizileme için Matris Tabanlı DNA Ekstraksiyonu

Araştırmamız, kişiselleştirilmiş hasta bakımı için NGS'yi dahil ederek TB tanısının geri dönüş süresini ve ardından başlatmayı azaltmakla ilgilidir. Protokolümüz, iş akışı entegrasyonunu, maliyeti ve geri dönüş süresini ele alarak TNGS'yi rutin kullanım için optimize eder, tanısal gecikmeleri azaltmayı ve tedavinin zamanında başlatılmasını iyileştirmeyi amaçlar.

Bu protokol, üç güne kadar süren geleneksel CTAB yöntemlerine kıyasla klinik örneklerden saatler içinde uygun maliyetli, hızlı ve yeterli kalitede DNA ekstraksiyonu sağlar.

Sonuçlarımız, TNGS'nin rutin teşhise entegrasyonu ve duyarlılığı ve klinik faydayı artırmak için yayma negatif ve yetersiz numuneler için ekstraksiyon yöntemlerinin optimize edilmesi hakkında önemli soruları gündeme getiriyor. Rutin teşhislerden kalan örneklerin, TB genomik sürveyansını kolaylaştırmak ve genişletmek için balgamın doğrudan tüm genom dizilimi de dahil olmak üzere, aşağı akış dizilimi için kullanılıp kullanılamayacağını araştıracağız.

[Anlatıcı] Başlamak için, ısıyla inaktive edilmiş bir balgam tortusu elde edin. Numuneyi 16.800 G'de veya 15 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. 20 ila 200 mikrolitrelik bir pipetle, süpernatanı yavaşça aspire edin ve atın, böylece peletin bozulmadan kalmasını sağlayın. Karıştırmak için matris süspansiyonunu hafifçe sallayın, ardından peleti yeniden süspanse etmek için iyi karıştırılmış matrisin 200 mikrolitresini pipetleyin. Tüm hacmi, iki milimetre çapında önceden sterilize edilmiş üç cam boncuk içeren 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın. Şimdi numuneleri 56 dakika boyunca 15 santigrat derecede bir ısıtma bloğuna yerleştirin. İnkübasyondan sonra, hücreleri dağıtmak için numuneleri 10 saniye boyunca bir girdapla homojenize edin, ardından numuneleri 100 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Numuneleri, saniyede 4,0 metre hızla 60 saniyelik bir döngüye sahip yüksek hızlı bir homojenizatör kullanarak homojenize edin. Ardından, süspansiyonu beş dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. DNA içeren süpernatanın 130 mikrolitresini, peleti bozmadan 1.5 mililitrelik düşük bağlayıcı yeni bir tüpe aktarın. Matris ve hücre kalıntılarını içeren ilk tüpü atın. DNA'yı manyetik boncuklar kullanarak saflaştırmak için, önce manyetik boncuk stok şişesini vorteksleyin veya kullanmadan önce boncukları yeniden süspanse etmek için kalan kısmı iyice hazırlayın, ardından ekstrakte edilen DNA'ya manyetik boncuk hacminin 1,2 katını ekleyin, Beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmeden önce numuneleri karıştırmak için süspansiyonu 10 kez pipetleyin. Numuneleri üç dakika boyunca veya sıvı berraklaşana kadar 1,5 mililitrelik bir tüp manyetik rafına yerleştirin, ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Mıknatısın üzerindeki tüplerle 200 mikrolitre %80 etanol ekleyerek boncukların bozulmadan kalmasını sağlayın. 30 saniyelik bir inkübasyondan sonra, boncukları rahatsız etmeden etanolü dikkatlice aspire edin ve atın. İkinci yıkamadan sonra, bir ila 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak kalan etanolü çıkarın. Boncukları 10 dakika veya mat bir görünüm elde edene kadar havayla kurutmak için tüpleri açık bırakın. Boncuklar mat bir görünüme sahip olduğunda, tüpleri mıknatıstan çıkarın ve her numunedeki boncukların üzerine doğrudan 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Ardından, her bir numuneyi 10 kez pipetleyerek karıştırın. Tüpün içine sıkışmış boncuk olup olmadığını kontrol edin. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, tüpleri üç dakika boyunca veya sıvı berraklaşana kadar manyetik rafa geri yerleştirin. Manyetik raftaki tüplerle, DNA içeren süpernatanı açıkça işaretlenmiş steril, düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. DNA konsantrasyonu, tüm yayma derecelerinde 500 mikrolitreye kıyasla iki mililitrelik tortu örneklerinde daha yüksekti. 500 mikrolitrelik tortu örneklerinde DNA veriminde daha fazla değişkenlik gözlendi. Dizileme okumalarının kapsama derinliği, tüm yayma derecelerinde 500 mikrolitreye kıyasla iki mililitrelik tortu örneklerinde daha yüksekti. Değişkenlik, 500 mikrolitrelik tortudan ekstrakte edilen üç artı yayma dereceli numunede daha fazlaydı. Sıralama kabul edilebilirlik puanları, iki mililitrelik numunelerde 500 mikrolitreye kıyasla genellikle daha yüksekti ve daha yüksek oranda kabul edilebilir sonuçlar elde edildi. Smear derecesi üç artı numuneler, bir artı ve iki artı yayma derecelerine kıyasla en yüksek kabul edilebilir sonuç oranına sahipti. 500 mikrolitrelik numunelerde kabul edilemez veya belirlenmemiş olarak sınıflandırılan daha fazla vaka vardı.