T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Bu protokolün genel amacı, T lenfositlerinde polarize sinyallemeyi indüklemek için fotoaktive edilebilir peptit MHC'nin kullanımını tanımlamaktır. Bu yöntem, lenfositlerin hızlı lokalize sinyalleri nasıl ilettiği ve daha sonra bu sinyallere polarize hücresel yanıtları nasıl monte ettiği gibi bağışıklık hücresi sinyal iletimindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, T hücresi sinyalizasyonunun uzamsal zamansal kontrolünü sunmasıdır.

Bunu, T hücresi reseptör aktivasyonunun kesin zamanını ve yerini sabitleyerek yapar. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Elisa Sanchez olacak. Sekiz kuyucuklu kapak camına damıtılmış deiyonize su içinde bir ila 500 oranında seyreltilmiş biyotinile poli-L-lizin veya biyo-PLL ekleyerek başlayın.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından damıtılmış deiyonize su ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında iki saat kurutun. Biyo-PLL kaplı yüzeyleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %2 BSA ile HEPES tamponlu salinden oluşan blokaj tamponu ile bloke edin.

İnkübasyonun ardından, kuyucukların kurumasına izin vermeden biyo-PLL kaplı yüzeylerden bloke edici tamponu çıkarın. Sonra streptavidin ekleyin ve dört santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra, kaplanmış yüzeyleri HBS'de yıkayın.

Hazne sürgülü kuyucukları dört ila beş kez doldurun ve ters çevirin, HBS'yi kuyulardan çıkarın. Kuyuların kurumasına izin vermeyin. CD4 pozitif T hücreleri veya CD8 pozitif hücreler için spesifik biyotinile fotoaktifleştirilebilir peptit majör histouyumluluk kompleksi ligandları ve adezyon moleküllerini biyo-PLL kaplı yüzeylere ekleyin.

Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, daha önce olduğu gibi yıkayın ve tohumlamaya hazır olana kadar HBS'de bırakın. Son olarak, uygun TCR'yi eksprese eden 200.000 CD4 pozitif veya CD8 pozitif T hücresini doğru kuyucuklara ekleyin ve hücrelerin 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca yapışmasına izin verin.

Hücreler yüzeye yapıştıktan ve yayıldıktan sonra, fotoaktivasyon ve görüntüleme için hazırdırlar. Görüntü elde etmek için UV uyumlu 150X objektif lens ile donatılmış, ters çevrilmiş bir toplam yansıma floresan mikroskobu kullanın. Sırasıyla 488 nanometre ve 561 nanometre uyarma lazerleri kullanarak hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki probları izleyin.

T hücrelerini içeren hazne sürgüsünü monte ettikten sonra, gerektiği gibi TIRF veya epifloresan aydınlatması elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın. Canlı modda, ilgilenilen floresan probları ifade eden bir hücre alanı seçin. Yazılım kontrolünü kullanarak tek tek hücrelerin altında fotoaktivasyon için mikron ölçekli bölgeler oluşturun.

Ardından, satın alma işlemini başlatın. Tipik olarak, her biri arasında beş saniyelik bir aralık olacak şekilde 80 zaman noktası gereklidir. Bu, çift renkli deneyler durumunda sıralı 488 nanometre ve 563 nanometre pozlamaları için zaman bırakır.

Ardından, 10 zaman noktası elde ettikten sonra, dijital diyafram deklanşörünü bir ila 1,5 saniye açarak seçilen bölgeleri fotoaktif hale getirin. Zaman atlaması tamamlandıktan sonra, yeni bir hücre alanı seçin ve işlemi tekrarlayın. Arka plan düzeltmesi için kullanılacak hücrenin dışındaki bir arka plan bölgesinin floresan yoğunluğunu belirleyerek başlayın.

Hücrenin dışına mikron büyüklüğünde kare bir bölge çizin ve bir maske yapın. Floresan yoğunluğunu belirlemek için Analiz Et, Maske İstatistikleri'ne tıklayın. Ortalama floresan yoğunluğu'nu seçin ve değerleri dışa aktarın.

Her zaman noktası için fotoaktif bölge içindeki floresan yoğunluğunu belirleyin. Fotoğrafın etkinleştirildiği bölgeyi vurgulamak için Maske'yi seçin. Floresan yoğunluğunu belirlemek için Analiz Et, Maske İstatistikleri'ne tıklayın.

Ortalama floresan yoğunluğu'nu seçin ve değerleri dışa aktarın. Fotoaktif hale getirilen bölgeyi vurgulamak için Maske'yi seçerek fotoaktif bölgenin merkezinin X ve Y koordinatlarını elde edin. Fotoaktivasyon bölgesi vurgulandıktan sonra, Analiz Et, İstatistikleri Maskele, Alan Merkezi ve Değerleri Dışa Aktar'ı seçin.

İlgilenilen floresan probun X ve Y koordinatlarını belirleyin. Manuel Parçacık İzleme'yi seçin ve zaman içinde ilgilendiğiniz floresan probuna tıklayın. Tüm zaman noktaları izlendikten sonra Analiz Et, İstatistikleri Maskele, Alan Merkezi ve Değerleri Dışa Aktar'ı seçin.

T hücreleri, fotoaktifleştirilebilir MCC-IEFK içeren odacıklı kapak camına bağlandı. Lipid ikinci haberci DAG için bir prob olan C1-GFP, epifloresan modunda TIRF mikroskobu ve RFP-Tubulin kullanılarak görüntülendi. T hücresinin altındaki yüzeyin lokalize fotoaktivasyonu, ışınlanmış bölgede DAG birikimine

Bunu saniyeler içinde sentrozomun aynı bölgeye yeniden yönlendirilmesi takip eder. C1-GFP birikimi, zaman içinde fotoaktif bölgenin merkezinde arka plan düzeltmesinden sonra normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplanarak ölçülebilir. Fotoaktivasyona yanıt olarak sentrozom yeniden oryantasyonu, zamanın bir fonksiyonu olarak sentrozom ile fotoaktif bölgenin merkezi arasındaki mesafenin hesaplanmasıyla ölçülebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir günden daha kısa sürede yapılabilir. Bu süre içinde analiz için genellikle 15 ila 20 zaman atlamalı film oluştururuz. Bu yaklaşım, araştırmacıların T hücrelerinde aktive edici sinyallemenin kesin kinetiğini ve polarizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı.

Ayrıca doğal öldürücü hücrelerde inhibitör sinyallemeyi incelemek için uyarlanmıştır. Sonuç olarak, artık iletişimsel bağışıklık hücresi hücre etkileşimlerinin nasıl bir araya getirildiğini ve çözüldüğünü daha iyi anlıyoruz.