Name: T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Öğrenin, fotoaktive edilebilir peptit-MHC kullanarak T lenfositlerinde polarize sinyalleşmeyi tetikleme yöntemini. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinde hızlı lokalize sinyal iletimini ve polarize hücresel yanıtları incelemek için uzamsal-zamansal kontrol sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz üye Huse laboratuarının tavsiye ve yardım için teşekkür ederim. ABD Ulusal Sağlık (M.H. için R01-AI087644) ve P30-CA008748 Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi için Enstitüleri tarafından desteklenen.

1. uyarıcı cam yüzeylerin hazırlanması
<ol><li>Kat 8-şey odalı coverglass biotinylated Poli-L-lizin (Bio-PLL) ile 1:500 distile, deiyonize su (GKD2O) seyreltilmiş. (RT) oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>H2ile O. yıkama</li>
	<li>Kuru RT. 2 h için</li>
	<li>Blok biyo-PLL yüzeyler RT., 30 dk için engelleme arabellek (HEPES arabelleğe alınmış serum [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], %2 BSA) ile kaplı<ol>
<li>Poli-L-lizin hydrobromide 10 mM NaPO4, pH 8,5 1 ml 5 mg geçiyoruz.</li>
		<li>125 μmol (0.55 mg) NHS-biotin (DMSO 100 mg/mL stokta) ekleyin ve reaksiyon pH kontrol edin. PH 8,5 altında ise 4 N NaOH pH 8,5 ve 9.5 arasında yükseltmek için 2 μL ekleyin.</li>
		<li>30 dk için girdap.</li>
		<li>20 mM Tris pH 8.0 çözünmüş 100 mM glisin 50 μL ile reaksiyon gidermek.</li>
		<li>Tam güç 10 min için spin ve süpernatant aktarmak için yeni bir tüp. Not: Bio-PLL kalitesi genellikle seri iki kat dilutions bir 96-Peki ELISA plaka üzerine malzemenin kaplama ve streptavidin kuluçka alkalen fosfataz ile birleştiğinde sonra biotin içerik miktarının önceki hazırlıklar için karşılaştırılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Engelleme arabellek kaldırın. Kuyu kuru izin vermez. Streptavidin (100 µg/mL engelleme arabelleği) ekleyin. 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>HBS içinde yıkayın. Doldurun ve HBS kuyulardan kaldırma odası slayt wells 4 - 5 kez, tersine çevirin. Kuyu kuru izin vermez.</li>
	<li>Biotinylated pMHC ligandlar ve adezyon molekülleri için yüzey ekleyin. Not: MCC ve OVA Orto-nitrobenzyl ekleyerek photocaged koruma grupları (Örneğin, nitrophenylethyl (NPE) veya nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) anahtar lysines ε-amino grubuna bağlı olabilir (mm, K7 OVA içinde K12). Photocaged mm ve OVA ticari satıcılardan temin edilebilir. Sulu tampon rekonstitüsyon sonra bacterially ifade-Ek ve kurulan yaklaşımlar11,12kullanarak H2-Kb refolded.</li>
	<li>Photoactivatable mm ya da OVA peptid doğrulama<ol>
<li>NVOC korumalı peptidler el bir UV lamba ile UV irradiating tarafından decage ( Tablo malzemelerigörmek) RT., 20 dk</li>
		<li>1 h için nabız 1.0 x 105 ZPT nonstimulatory peptid (negatif kontrol, örneğin Hb), 1 µM ile unirradiated photoactivatable peptid, radyoaktif photoactivatable peptid ve agonist peptid (pozitif kontrolü, örneğin, mm) 37 ° C'de bir gecede</li>
		<li>5 C. ifade T hücreleri uyarmak için C7/2B4/ve TCR, CH12 veya CH27 B hücre kullanın. OT1 T hücreleri uyarmak için RMA-s veya EL4 Timoma hücreleri kullanmak.</li>
		<li>T hücrelerinde eşit sayıda pulsed ZPT karıştırın 96-şey yuvarlak alt plaka 200 son ses seviyesinde µL. 12-24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Supernatants her kuyudan kurtarmak ve IL-2 tarafından ELISA streptavidin horseradish peroksidaz Renkölçer algılama ile analiz. Not: Tüm peptidler tarafından electrospray kütle spektrometresi MHC kompleksi refolding önce caging durumunu teyit şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Katlama ve arıtma MHC ışığa maruz kalma en aza indirmek için gerçekleştirin. Örneğin, alüminyum folyo reaksiyonlar katlama sarın ve UV lambalı jel filtrasyon Kromatografi taşımak. Not: Bu photoactivatable mm-ben-Ek bulundu oldu ve OVA - H2-Kb neden UV bağımsız T hücre aktivasyonu, büyük olasılıkla eksik fonksiyonel caging nedeniyle yüksek yoğunluklu. Bu nedenle, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC (hemoglobin64-76 peptid (Hb) içerene.g. -Ek ) bir 10-30 x fazlalığı immobilizasyon adımı sırasında seyreltilmiş. Bu sinyal gürültü oranı sonraki görüntüleme deneme artırır.</li>
	<li>Photoactivate CD4 için+ T hücreleri, topluca biotinylated Hb-ben-Ek (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable mm-ben-Ek (0.1 µg/mL) ve biotinylated antikor sınıf karşı karışımı kullanın ben MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). anti-H2-Kk antikor 5 C. teşvik eder. H2-Kkcam yüzey harekete geçirmek gören olmadan yaymak için hızlı C7/2B4/ve T hücreleri.</li>
	<li>CD8 için+ T hücreleri, kullanın biotinylated KAVYDFATL peptid taşıyan H2-Db karışımı (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable OVA-H2-Kb (0.1 µg/mL) ve ekstrasellüler etki alanı adezyon molekülün ICAM-1 (2 µg/mL böcek hücre kültür13tarafından üretilen). ICAM-1 T hücre yüzeyinde integrin LFA1 meşgul olarak yakın kişi oluşumu teşvik eder.</li>
	<li>Tüm protein karışımları kuluçka 1s RT at veya en az 2 h 4 ° C'de ardından engelleme arabellekte uygulamak Not: Önceden belirlenen6~ 8000 µm2 başına olmak bu tür yüzeylerde Moleküler yoğunluğu oldu. Th yüzeyinde, yoğunluğu biotinylated proteinin ~ 267 molekülleri µm2decaging önce başına photoactivatable pMHC ~1/30 gösteren göz önüne alındığında olacaktır.</li>
	<li>Adım olduğu gibi 1,6 yıkama ve HBS içinde kullanıma hazır kadar bırakın.</li>
	<li>200.000 CD4 eklemek+ veya CD8+ T hücreleri uygun TCR her kuyuya ifade ve hücreleri 15dk için 37 ° C'de bağlı kalmak izin. Hücreleri bağlı ve yüzeyde yaymak, onlar photoactivation ve görüntüleme için hazırız. Not: Floresan problar Imaging ile efektör T hücrelerinin Retroviral iletim ayrıntı elswhere6,7' açıklanmıştır. Kalsiyum sinyal aynı zamanda kalsiyum hassas boya Fluo-46ile yüklenen untransduced T hücreleri kullanarak ele. Ayrıca photoactivatable pMHC decaging neden olmaktadır UV aralığındaki uyarma gerektirdiğinden ratiometric boya Fura-2 tavsiye edilmez.</li>
</ol>2. resim alma
<ol><li>Resim alma için bir UV uyumlu 150 X objektif lens ile outfitted ters bir TIRF mikroskobu kullanın. UV ışınlatayım 100 bir W civa lamba (HBO) bağlı bir dijital diyafram sistemi kullanarak kullanıcı tanımlı bölgeler. UV ışığı bu lamba 400 nm uzun pası ayna kullanarak örnek üzerine doğrudan.</li>
	<li>Görüntü analiz yazılımı yerelleştirilmiş photoactivation ve hızlandırılmış satın alma için kullanın. Çoğu deneylerde probları 488 kullanarak her iki yeşil ve kırmızı kanalı izlemek nm ve 561 nm uyarma lazerler, anılan sıraya göre. Lazer ışığı da iletir (decaging etkinleştirmek için) UV aralığında bir dual-bant dikroik ayna kullanarak örnek üzerine yönlendirilir. Lütfen Malzeme tablo ve şekil 6 mikroskop yapılandırma hakkında daha fazla bilgi için bkz:.</li>
	<li>T hücreleri içeren odası slayt takma sonra ayarları gerektiği gibi TIRF veya epifluorescence aydınlatma elde etmek için ayarlayın. Live modda floresan probe(s) ilgi ifade eden hücrelerin bir alan seçin. Mikron çaplı bölgeler photoactivation altında yazılım denetimini kullanarak tek tek hücreler için kurmak.</li>
	<li>Hızlandırılmış edinme başlar. Genellikle, 80 timepoints, 5 zaman aralığı ile iktisap her zaman noktası arasındaki s. Bu sıralı 488 için gereğinden fazla zaman bırakır nm ve çift renk deneyler durumunda 563 nm Etkilenmeler.</li>
	<li>10 timepoints sonra dijital diyafram açarak seçili bölgeler için 1-1.5 s çekim photoactivate.</li>
	<li>Zaman atlamalı tamamlandıktan sonra hücre yeni bir alan seçin ve işlemi yineleyin.</li>
</ol>3. veri analizi
Not: İmmobilize ligandlar yerelleştirilmiş photoactivation yanıt ve hücre iskeleti remodeling etkinlikler sinyal, kantitatif analiz için kullanılabilecek iyi tanımlanmış, sabit bir uyarıcı bölge oluşturur. İletişim kuralları genellikle içerir floresan yoğunluğu radyasyonlu bölgedeki miktarının veya Radyoaktif bölge konumsal bir bitiş noktası olarak mesafe ölçümleri için kullanarak analiz (e.g. centrosome için kutuplaşma değerlendirmek için Radyoaktif bölge). Her iki analiz protokolleri aşağıda açıklanmıştır. Çeşitli etkileşimli resim analiz programları yoğunluğu ve sonra ek işleme ve analiz için çıktı olabilir mesafe ölçümleri yapmak için kullanılabilir.
<ol><li>
Floresan yoğunluğu
	<ol>
<li>Hücre (FIb) dışında bir arka plan bölgesinin floresan yoğunluğu (FI) belirlemek. Bu arka plan düzeltme için kullanılacaktır.<ol>
<li>Bir mikron büyüklüğünde kare bölgesi dışında hücre ve bir maske yapmak. Floresan yoğunluğu belirlemek için analiz tıklatın | Maske istatistikleri. Demek floresan yoğunluğu seçin ve değerleri vermek. Not: Yordam ayrıntıları (örneğin 3.1.1.1) Slidebook yazılımlar için de kullanılır (bkz. Tablo malzeme). Diğer yazılım paketlerini kullanarak bu protokolünü (örn., FIJI) biraz farklı olacaktır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her zaman için photoactivated bölgedeki FI belirlemek.<ol>
<li>Maske yapıldı. photoactivated bölge vurgulamak için seçin. Floresan yoğunluğu belirlemek için analiz tıklatın | Maske istatistikleri. Demek floresan yoğunluğu seçin ve değerleri vermek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bölgede ölçüm FI değerleri FI kökenli çıkarma. O zaman, düzeltilmiş FI ölçümler ortalama tarafından bölerek normalize, arka plan FI photoactivation önce ilk 9 kare düzeltildi. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Not: ΔF/F bir fonksiyonu olarak grafiğini çizin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesafe
	<ol>
<li>X ve y koordinatları photoactivated Bölge Merkezi.<ol>
<li>X ve y koordinatları photoactivated bölgesinin merkezinin photoactivated yapıldı bölge vurgulamak için maske seçin. Photoactivation bölgesinin vurgulandığında, analiz seçin | Maske istatistikleri | Alan Merkezi ve değerleri vermek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>X ve y koordinatları için her zaman için ilgi soruşturma floresan. Bu genellikle el ile veya otomatikleştirilmiş parçacık izleme elde edilir.<ol>
<li>X ve y belirlemek için faiz, floresan probe koordinatlarını Manuel parçacık izleme seçin ve faiz floresan sondası zamanla'yı tıklatın. Bir kez tüm zaman Puan izleniyor, analiz seçmek | Maske istatistikleri | Alan Merkezi ve değerleri vermek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Floresan protein ilgi ve her zaman noktası denklemi kullanarak photoactivated Bölge Merkezi arasındaki uzaklığı hesaplamak: mesafe √ = ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), hangi x2 ve y2 vardır1 faiz ve x ve y1 floresan protein koordinatlarını photoactivated Bölge Merkezi koordinatlar.</li>
		<li>Grafik zamanın bir fonksiyonu olarak mesafe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
<li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-14463-4_11">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li>
<li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+%CE%B1+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82(2014).</li>
<li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li>
<li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li>
<li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li>
<li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li>
<li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li>
<li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC%3A+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li>
<li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-A2-peptide+complexes%3A+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li>
<li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+cell%2Funder+auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li>
<li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son yıllarda, ışık spatiotemporally kontrollü harekete geçirmek-in hücresel süreçler için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, her ilişkili avantajları ve dezavantajları. İmmobilize, hücre dışı ligandlar decaging üzerinde dayanır, burada açıklanan sistem hızlı, hücre altı, polarize sinyal yanıt analiz için idealdir. Bu yaklaşım yukarıda açıklandığı gibi T hücrelerinin oluşumunda IS incelemek için uygulanmıştır. Ayrıca, diğer reseptörleri için Kafesli ligandlar, inhibitör doğal öl...

T lenfositler (T hücreleri) hücresel bağışıklık hücre yüzeyine MHC bağlamında görüntülenen antijenik peptidler tanıyarak merkezi bir rol oynamaktadır. TCR tarafından aracılık ettiği, Antijen tanıma saf T hücre farklılaşma sürücüler ve cytolytic ve iletişimsel tepkileri efektör nüfus tarafından teslim teşvik etmektedir. TCR nişan da hücresel mimarisi dramatik değişiklikler neden olmaktadır. Birkaç dakika içinde T hücreleri taktımı immünolojik synapse (IS)1,2olarak bilinen bir polarize arayüz şekillendirme (APC), antijen sunan hücrenin kenarını üzerine. Is yönlü yayın sitokinler veya sitotoksik T lenfositler (CTL), APC yok litik proteinler durumunda etkinleştirerek T hücre efektör yanıt-e doğru potentiates.
TCR nişan pMHC tarafından bağlayıcı sonuçta sağlam sinaptik sitoiskeleti2/ remodeling teşvik T harekete geçirmek için hücreleri (LAT), dahil olmak üzere birden çok akış aşağı adaptör moleküllerin hızlı fosforilasyon neden olmaktadır. Kortikal ipliksi aktin (F-aktin) T hücre APC yüzeye yayılan sürücüler ve IS çevre ve tükenmesi Merkezi'nden F-aktin birikimi ile karakterize bir annüler yapıda giderir. F-aktin halka oluşumu sıkı hale gelmesini Mikrotubul organizasyon Merkezi (MTOC, T hücreleri centrosome olarak da bilinir) için hemen altında arayüzü merkezi bir konuma eşleşen. Her iki olay ilk Antijen tanıma dakika içinde oluşur ve hangi sonraki etkinleştirme olayları ve efektör yanıt ortaya mimari içerik oluşturun.
Is oluşumu çalışmaya, çeşitli labs APC immobilize TCR ligandlar içerir veya kendi ligandlar3,4içerir bir lipid bilayer destekler bir cam yüzey tarafından değiştirilir yaklaşımlar geliştirdi. T hücreleri tarafından toplam iç yansıma Floresans mikroskobu (TIRF) ya da yüksek çözünürlüklü çalışmalar erken T hücre aktivasyonu ve IS oluşumu etkinleştirme confocal mikroskobu görüntüsü bu yüzeylerde IS benzeri kişiler oluşturur.
Bu yaklaşımlar tam olarak birleştirilmiş IS mükemmel görselleştirme için izin vermiş olsa da, sinyal aşağıdaki TCR:pMHC ligasyonu çoğunu TCR harekete geçirmek doğru bir şekilde takip olayların sırasını belirlemek için çabalarını zorlaştıran saniye içinde oluşur . Bu sorunu aşmak için bir photoactivation yaklaşım, photoactivatable pMHC TCR harekete geçirmek5,6,7kronolojik zamanmekansal kontrolünü elde etmek için kullanılan geliştirilmiştir. Bu sistemde, T hücreleri içeren ultraviyole (UV) ışık ile ışınlanmış kadar TCR için uyarıcı sigara photoactivatable pMHC cam yüzeyler eklenir. T hücre yüzeyin mikron büyüklüğünde bölgenin UV ışınlama T hücre tarafından kabul edilebilir bir uyarıcı bölgesi oluşturmak photocage kaldırır. Sonraki sinyal olaylar ve hücre iskeleti remodeling sonra genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanarak izlenir. Antijenik peptidler, sınıf II MHC-Ek ve sınıf bağlamında ben MHC H2-Kb, anılan sıraya göre sunulur, güve sitokrom c88-103 (mm) ve ovalbumin257-264 (OVA), iki photoactivatable sürümü olmuştur (şekil 1) geliştirdi. Bu her iki CD4 analizini sağlar+ T hücreleri belirli mm-ben-Ek (5 C. ifade etmek için C7, 2B4, ya da ve TCRs) ve CD8+ T hücreleri belirli OVA-H2-Kb (OT1 TCR ifade).
Son on yıl içinde TCR photoactivation ve düşsel yaklaşımı erken TCR adımları sinyal kesin Kinetik kurmak ve polarize hücre iskeleti remodeling5, yöneten moleküler yolları tanımlamak için kullanılmıştır 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Örneğin, tahlil bu centrosome belirlemede etkili oldu APC doğru hale gelmesini lipid ikinci haberci diacylglycerol IS at merkezli yerelleştirilmiş bir degrade tarafından aracılık. Bu metodoloji yüksek çözünürlüklü görüntü analizi T hücre işlevinin talep uygulamaları için değerli olmaya devam edecektir tahmin edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Odacıklı Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin hidrobromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Biyotinile Poli-L-Lizin</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>yapması gerekecek Biyotinillenmiş Poli-L-Lizin</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA biotin-protein ligaz standart reaksiyon kiti</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Proteinleri biyotinillemek için kullanılacak</td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş Hb I-EK&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Protein katlanması için referans 6'ya bakın. Biyotinilasyon için BirA kiti</td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş NPE-MCC I-EK&nbsp; kullanın </td> <td>Anaspec</td><td></td><td>Özel NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K (Nvoc) -QATK-OH), Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated & alpha'dan satın alınabilir; H2-Kk antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş NPE-OVA H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Özel NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinilated KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Özel sentezlenmiş protein (KAVYDFATL), Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Protein katlanması için protokoldeki referansa bakın. Biyotinilasyon için BirA kiti kullanın</td></tr><tr><td>El tipi UV lambası</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lamba numuneden < 1 cm uzakta tutulur.&nbsp; Algılanabilir ölçüm için 30 sn 365 ışık, kantitatif ölçüm için 20 dakika yeterlidir.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF sistemi.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Görüntüleme sistemi hakkında daha fazla bilgi Şekil 6</td></tr><tr><td>Mosaic dijital diyafram</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook yazılımında</td> bulunabilir. Akıllı <td>Görüntüleme Yenilikleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t hücre aktivasyonu photoactivatable agonist kullanarak kayma ve temporal kontrolünü

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lenfositler TCR etkinleştirme aşağıdaki birkaç dakika içinde meydana gelen hızlı, polarize işaret içinde meşgul. Bu oluşumu immünolojik sinaps, T hücre aktivasyonu düzenleyen ve directionally efektör yanıt hedefleyen bir sterotiplenmiş hücre-hücre kavşak neden olmaktadır. Bu süreçlerin etkin bir şekilde çalışmak için hızlı, polarize yanıt-e doğru esir alma için uyarlanmış bir düşsel yaklaşımı gereklidir. Bu iletişim kuralı ultraviyole ışığa maruz kadar yani uyarıcı olmayan bir photoactivatable peptid-Binbaşı MHC kompleksi (pMHC) dayalı böyle bir sistem açıklar. Hedeflenen Bu reaktif videomicroscopy deneyler sırasında decaging TCR etkinleştirme kesin kronolojik zamanmekansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü Imaging sonraki hücresel yanıtları toplam iç yansıma (TIRF) tarafından izleme sağlar. Bu yaklaşım da genetik ve farmakolojik pertürbasyon stratejileri ile uyumludur. Bu TCR sinyal immünolojik synapse altında yatan polarize hücre iskeleti yapıların oluşumu için bağlantı iyi tanımlanmış moleküler yolları Meclisi sağlar.

Photoactivation ve düşsel yaklaşımı gözlem ve hızlı, polarize sinyal yanıtlar facile miktar sağlar. Çoğaltılamaz yeteneklerini göstermek için işte TCR kaynaklı DAG birikimi ve centrosome hale gelmesini arasında kronolojik zamanmekansal korelasyon inceleyerek bir deney. 5C. C7 T hücre patlamaların retrovirally ile 2 floresan gazetecilere transduced: GFP (C1-GFP) ve RFP tübülin centrosome izlemek için tandem C1 etki alanlarından protein kinaz C-θ içeren bir DAG Biyoalgılayıcı bağlantılı. T ...

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Bu protokolün genel amacı, T lenfositlerinde polarize sinyallemeyi indüklemek için fotoaktive edilebilir peptit MHC'nin kullanımını tanımlamaktır. Bu yöntem, lenfositlerin hızlı lokalize sinyalleri nasıl ilettiği ve daha sonra bu sinyallere polarize hücresel yanıtları nasıl monte ettiği gibi bağışıklık hücresi sinyal iletimindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, T hücresi sinyalizasyonunun uzamsal zamansal kontrolünü sunmasıdır.Bunu, T hücresi reseptör aktivasyonunun kesin zamanını ve yerini sabitleyerek yapar. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Elisa Sanchez olacak. Sekiz kuyucuklu kapak camına damıtılmış deiyonize su içinde bir ila 500 oranında seyreltilmiş biyotinile poli-L-lizin veya biyo-PLL ekleyerek başlayın.Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından damıtılmış deiyonize su ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında iki saat kurutun. Biyo-PLL kaplı yüzeyleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %2 BSA ile HEPES tamponlu salinden oluşan blokaj tamponu ile bloke edin.İnkübasyonun ardından, kuyucukların kurumasına izin vermeden biyo-PLL kaplı yüzeylerden bloke edici tamponu çıkarın. S

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, UV ışınlaması kullanarak fotoaktifleştirilebilir bir peptit-majör histouyumluluk kompleksinin deşifre edilmesi yöntemini göstermektedir. Boşaltma işlemi, doğal peptit dizisini ortaya çıkararak hassas T hücresi aktivasyonunu mümkün kılar.

Fotoaktifleştirilebilir Peptit MHC ile Kontrollü T Hücre Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Bu protokol için Kafesli protein kinaz A (PKA), hücresel sinyal iletim bioeffector bir nanopartikül yüzey üzerine immobilize sitozol microinjected ve upconverted UV yakın kızılötesi (Nur) ışınlama ışığı sayesinde inducing aşağı akım stres fiber dağılma sitozol içinde.

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Bu iletişim kuralı hangi autoreactive photoactivatable yeşil flüoresan protein (PA-GFP) muhabir lenfositleri taşımak spontan otoimmün germinal merkezleri ile karışık fare kemik iliği chimeras nesil açıklar. Bu hücresel aşağı akım moleküler ve fonksiyonel analizleri kurcalayarak konumda bağlantı olanağı sağlar.

Bireysel Autoreactive Germinal merkezleri Photoactivation otoimmünite, karışık Chimeric modeli tarafından sorguya

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Bu protokol, birincil T hücrelerinin yetiştirilmesi için temel adımları tanımlar; bunların izolasyonu, aktivasyonu, genişlemesi ve mRNA elektroporasyonu ile geçici transfeksiyonu dahildir. Ayrıca, fenotip, aktivasyon belirteçleri, canlılık ve kimerik antijen reseptörü (CAR) ekspresyonunun akış sitometrik analizi için bir iş akışı ve antikor paneli önerilmektedir.

Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek

Öğrenin, fotoaktive edilebilir peptit-MHC kullanarak T lenfositlerinde polarize sinyalleşmeyi tetikleme yöntemini. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinde hızlı lokalize sinyal iletimini ve polarize hücresel yanıtları incelemek için uzamsal-zamansal kontrol sağlar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Daha fazla video keşfet