Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi
March 22nd, 2018
Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.
Bu deneyin genel amacı, optogenetik kontrol ve gen ekspresyonunun canlı izlenmesi yoluyla salınım bilgisinin hücreden hücreye transferini gözlemlemektir. Bu yöntem, hücrelerin Notch sinyal yolu aracılığıyla birbirleriyle nasıl iletişim kurduğuna, özellikle de hücrelerin salınım bilgisini birbirlerine nasıl ilettiğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gen ekspresyon dinamiklerini çok yüksek hassasiyetle kontrol edebilmemiz ve izleyebilmemizdir.
Prosedürü göstermek, bu yeni teknolojiyi geliştiren laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Akihiro Isomura olacak. Tol2 tabanlı optogenetik modüllerin plazmit vektörlerini transpozaz ekspresyon vektörü ile birlikte C2C12 hücrelerine transfekte etmek için, önce bir hücre sayacı ile tripsinizli hücreleri sayın. Transfeksiyondan bir gün önce 12 oyuklu bir plakada oyuk başına 50.000 C2C12 hücresi yerleştirin.
Daha sonra, lipofeksiyon reaktifi kullanarak 0.375 mikrogram Tol2 bazlı optogenetik vektörü, 0.125 mikrogram ilaç seçim vektörünü ve 0.5 mikrogram transpozaz ekspresyon vektörünü birlikte transfekte edin. Transfekte edilmiş hücreleri tripsinize edin ve transfeksiyondan bir gün sonra 100 milimetrelik kültür kaplarına yerleştirin. Transfekte edilmiş hücreler için kültür ortamını, mililitre higromisin başına 100 miligram ile takviye edilmiş kültür ortamıyla değiştirin.
Transfekte edilmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için hücreleri üç gün boyunca kültürleyin. Orta değişikliğin gerekli olmadığını unutmayın. Daha sonra, transfekte edilmiş hücreleri tripsinize edin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, alıcı ve ışığa duyarlı hücreleri sıralayarak seçim için floresan proteinleri eksprese eden bir hücre popülasyonunu saflaştırın.
Işık kaynaklı bir durum veya karanlık bir durum için ışık kaynakları olan veya olmayan iki tür inkübatör kurun. Mavi LED transilluminatörün ışık yoğunluğunu ayarlamak için bir ışık ölçer kullanın. Kapıyı kapattıktan sonra ışık yoğunluğunu ölçün.
Aydınlatma için programlanabilir programlara izin veren tek kartlı bir mikro denetleyiciye bir kontrol komut dosyası yükleyerek ışık aydınlatmasının zamanlamalarını ve süresini programlayın. Tripsinizli hücreleri bir hücre sayacı ile sayın ve pAI218 ve pAI170 taşıyan 100.000 ışığa duyarlı gönderici hücreyi 35 milimetre çapında plastik kültür kaplarına yerleştirin. Bulaşıkları karanlık ve aydınlık koşullar için ayrı kuluçka makinelerine koyun.
Bulaşıkları kurduktan sonra, hücre lizatlarını toplayana kadar inkübatörlerin kapılarını kapalı tutun. Kaplamadan bir buçuk gün sonra hafif aydınlatmaya başlayın. İstenmeyen foto stimülasyondan kaçınmak için hücreleri kontrolsüz ışığa maruz bırakmayın.
Yani, kapıyı açmadan bu adımı yapın. Burada kapıyı açmanın sadece gösteri amaçlı olduğunu unutmayın. Kaplamadan yaklaşık iki gün sonra, numune kaplarını 30 dakikalık aralıklarla inkübatörlerden buza taşıyın ve daha fazla analiz için hücre lizatlarının hazırlanmasına başlayın.
PMT ile optik stimülasyon üzerine hücresel yanıtları gerçek zamanlı olarak izlemek için, önce standart yöntemlerle gönderici ve alıcı hücrelerin sayısını tripsinize edin ve sayın. 25.000 alıcı ve 125.000 gönderici hücresinden oluşan bir mililitrelik toplam hacim süspansiyonu hazırlayın. Karışık hücreleri, 24 oyuklu siyah plakaların her bir oyuğunda, bir milimolar lusiferin içeren kültür ortamı ile kaplayın.
Çıkış sinyallerinin kayıt sistemi için çok yüksek olmadığını doğrulamak için lusiferaz tahlili için hücreleri bir plaka okuyucu üzerinde analiz edin. Ardından, plakayı kayıt sistemine yerleştirin ve bir kayıt programı başlatın. Örneğin, kaydı ayarladıktan 18 saat sonra ışık aydınlatmasını başlatın.
Optogenetik bozulmanın kontrolü altında tek hücreli yanıtların gerçek zamanlı görüntülenmesi için, ilk plaka 50.000 alıcı ve 250.000 verici hücre, 27 milimetre çapında cam tabanlı 35 milimetre çapında tabaklara yerleştirilir. Karışım oranlarının ve toplam hücre sayısının doğru ayarlandığından emin olun. Kaplamadan bir gün sonra, ortamı iki mililitre kayıt ortamıyla değiştirin.
Cam tabanlı çanağı, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir çevre odası ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine yerleştirin. Soğutulmuş bir CCD kamera kurun. CCD sensörünün sıcaklığının hedef değere kadar soğutulduğundan emin olun.
Beş dakikalık aralıklarla ve 288'den fazla kez görüntü yakalamak için otomatik çekim yazılımında çok boyutlu hızlandırılmış pencere parametrelerini ayarlayın. Çok boyutlu zaman atlamalı penceresinde bir lüminesans kanalı seçin. Okuma modunun, zayıf yayılan biyolüminesan ışığı algılamak için okuma gürültülerini azaltmak için kritik olan yavaş 50 kilohertz okuma moduna ayarlandığından emin olun.
Çok boyutlu hızlandırılmış çekim penceresinde floresan kanallarını seçin. Floresan görüntüleme için gereken süreyi azaltmak için okuma modunun hızlı bir megahertz moduna ayarlandığından emin olun. Son olarak, 400 milisaniye pozlama ile ikişer ikişer gruplamayı ayarlayın.
Ardından, hücreleri periyodik mavi ışık aydınlatmasıyla uyarmak üzere programları ayarlamak için bir günlük sekmesi seçin. Yeni bir günlük kurulumu eklemek için artı düğmesine tıklayın. Günlük kutusundan bir günlük dosyası seçin, birden çok zaman noktası seçin ve stimülasyonu zamanlamak için başlangıç noktası ve aralık kutularındaki değerleri ayarlayın.
Belirtilen günlük dosyasının aydınlatma, deklanşör açma, gecikme, deklanşör kapanışı ve gecikme seçimi için sıralı protokoller içerdiğinden emin olun. Ardından, periyodik mavi ışık aydınlatması ile hücreleri uyarmak için programlar ayarlayın. Son olarak, Kazan düğmesine tıklayarak hızlandırılmış kaydı başlatın.
Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi, zaman atlamalı filmlerden lüminesans kanallarının tek hücreli izlerini çıkarın. Optogenetik gönderici-alıcı testlerinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir. Foto-indüklenebilir gönderici hücreler, beklendiği gibi periyodik mavi ışık aydınlatmasının varlığında Delta ligand ekspresyonunun salınım modellerini üretti.
Alıcı hücreler, ışığa duyarlı gönderici hücrelerle birlikte kültürlendiğinde ve tekrarlayan ışık aydınlatmasına maruz kaldığında, gerçek zamanlı bir biyolüminesans kayıt sistemi, çeşitli karıştırma oranları koşullarında alıcı hücrelerin döngüsel tepkilerini algılar. Ayrıca, tekrarlayan ışık aydınlatmalı hızlandırılmış mikroskopi, alıcı hücrelerin tek hücre düzeyinde senkronize tepkilerini de ortaya çıkarır. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, gen ekspresyonunun dinamik bilgisinin hücre-hücre etkileşimlerinde nasıl aktarıldığını keşfetmelerinin yolunu açtı.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, osilatör bilginin hücreden hücreye aktarılmının analizi için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, optogenetik kontrol ve gen ekspresyonunun canlı takibi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, gen ekspresyon dinamiklerinin hassas kontrolünü ve gözlemlenmesini sağlayarak hücresel iletişim hakkında bilgiler sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Optogenetik
Arka Plan
- Hücre iletişimi anlamak, çok hücreli sistemleri deşifre etmek için kritik öneme sahiptir.
- Notch sinyal yolu hücresel etkileşimlerde önemli bir rol oynamaktadır.
- Osilatör bilgi transferi, hücresel dinamiklerin önemli bir yönüdür.
- Optogenetik araçlar, gen ekspresyonunun hassas manipülasyonunu sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Hücrelerin osilatör sinyallerle nasıl iletişim kurduğunu gözlemlemek.
- Çok hücreli bir bağlamda gen ekspresyon dinamiklerini araştırmak.
- Gen ekspresyon programlarının işlevsel önemini test etmek için bir platform geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Plasmid vektörlerinin C2C12 hücrelerine transfeksiyonu.
- Tol2 tabanlı optogenetik modüllerin kullanımı.
- Gen ekspresyon dinamiklerinin canlı takibi.
- Transfeksiyon için hücre sayımı ve yerleştirme teknikleri.
Ana Sonuçlar
- Optogenetik modüllerin hedef hücrelere başarılı transfeksiyonu.
- Hücreler arasında osilatör bilgi transferinin gösterimi.
- Gen ekspresyon dinamiklerini kontrol etmede yüksek hassasiyet.
- Hücresel iletişimde Notch sinyalinin rolüne dair bilgiler.
Sonuçlar
- Bu protokol, hücre iletişimi çalışmaları için değerli bir araç sağlamaktadır.
- Optogenetik kontrol, gen ekspresyon dinamikleri hakkındaki anlayışımızı artırmaktadır.
- Bulgular, çok hücreli sistemleri anlamak için önemli olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This optogenetic method enables precise temporal control and live monitoring of gene expression in cell-to-cell interactions, addressing a key challenge in deciphering dynamic signaling mechanisms. By revealing how oscillatory Notch signaling entrains intrinsic cellular rhythms through frequency tuning and phase shifting, the approach provides mechanistic de-risking for target validation in multicellular systems. It supports predictive confidence in early discovery by linking dynamic gene expression programs to functional intercellular communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how periodic inputs of signaling pathways entrain intrinsic oscillations at single-cell resolution.
- Operational Value: Enables functional target validation through optogenetic perturbation and real-time readout of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying how dynamic signaling features influence cellular response patterns in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated sender-receiver coculture systems for downstream screening of modulators affecting oscillatory signal transfer.
- Operational Value: Standardizes light-controlled stimulation protocols and luminescent readouts for reproducible, quantitative assay outputs.
- Scalability: Facilitates platform reuse across signaling pathways by decoupling optogenetic control from specific genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects dynamic gene expression measurements in vitro to potential biomarker alignment in multicellular disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed oscillatory patterns are drivers or passengers in pathogenic signaling, reducing ambiguity in target selection.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating whether modulating signal dynamics alters phenotypic outcomes in receiver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness for lead identification, particularly when dynamic signaling behavior is a key determinant of target validity.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how oscillatory information transfer contributes to cellular decision-making in Notch and similar pathways.
- Screening: Enables assay development for compounds that disrupt or enhance frequency-specific signal transmission between cells.
- Analytics: Provides quantitative time-series data on luminescence and fluorescence readouts, enabling statistical comparison of entrainment efficacy across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when oscillatory dynamics correlate with functional states in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular optogenetic platform applicable to multiple signaling systems beyond Notch, increasing long-term ROI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by resolving mechanistic ambiguity in how dynamic gene expression programs influence intercellular communication.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible control over temporal stimulation and real-time monitoring, reducing variability in complex coculture systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of whether targeting dynamic signaling features yields measurable phenotypic effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets where signal dynamics, not just static expression, are functionally relevant.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, live-cell imaging, and luciferase-based reporter systems.
- Depends on access to programmable light sources, environmental chambers, and plate readers capable of low-light luminescence detection.
- Necessitates standardization of light intensity, timing schedules, and cell mixing ratios across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to primary cells or in vivo models due to differences in transfection efficiency and light penetration.
- Practical limitations include potential phototoxicity from prolonged blue-light exposure and signal saturation in high-density cocultures, as noted in the protocol’s optimization steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Generation of Stable Cell Lines by the Tol2 System
2:07
Evaluation of Photo-sensitivity of Engineered Cells at the Population Level
3:31
Dynamic Sender-receiver Assay at the Population Level and at the Single-cell Level
6:47
Results: Analysis of Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions
7:35
Conclusion
