Jejunum Kriyoseksiyonlarında Tutam Hücrelerini Görselleştirmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Apikal mikrovillus ve makara şeklinde soma ile tutam hücreleri içeren formalinle sabitlenmiş, jelatin dolgulu fare jejunum kriyoseksiyonları içeren bir kültür kabı ile başlayın.

Hücre zarlarına nüfuz etmek için deterjan içeren bir tamponla yıkayın.

Bir alkalin antijen alma çözeltisi ekleyin. Fiksasyonun neden olduğu protein çapraz bağlarını kırmak için inkübe edin ve boyama için proteinleri ortaya çıkarın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloke edici solüsyon uygulayın.

Tutam hücrelerinde spesifik olarak fosforile edilmiş bir aktin bağlayıcı proteini hedefleyen birincil antikorlarla kaplama.

Bağlanmamış antikorları çıkarın. Florofor konjuge ikincil antikorlar, DNA bağlayıcı boya ve falloidin-floresan boya konjugatının bir karışımını tanıtın.

İkincil antikorlar birincil antikorlara bağlanır, falloidin-floresan boya eşlenik etiketleri aktin ve DNA bağlayıcı boya hücre çekirdeklerini işaretler.

Bağlanmamış bileşenleri çıkarın ve deterjan içermeyen bir tampon ekleyin.

Bölümü, ortamla monte ederek yapışkan kaplı bir cam kızağa aktarın.

Konfokal bir mikroskop altında, luminal uçta yoğunlaştırılmış floresan ve genişletilmiş bir kırmızı kök kütlesi olan yeşil makara şeklindeki hücreler, tutam hücrelerinin varlığını gösterir.

Jejunum bölümlerini hazırlamak için, hem kriyostat odası sıcaklığını hem de nesne sıcaklığını eksi 22 santigrat dereceye ayarlayarak başlayın. Donmuş doku bloğunu en az 15 dakika boyunca kriyostat odasındaki bir kriyo kalıba yerleştirin. 15 dakika sonra, jejunumun enine kesitini ortaya çıkarmak için bloğu bir jiletle ikiye bölün. Bloğun yarısını bir kriyostat adaptörüne monte edin. Jelatin dolgulu jejunumu 30 mikron kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri 3 mililitre PBS içeren 35 milimetrelik bir kültür kabına nazikçe aktarmak için donmuş forseps kullanın.

Bölümleri her biri 3 mililitre PBS-T ile 5 dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, serbest yüzen bölümleri içeren tabağa 3 mililitre taze hazırlanmış antijen alma solüsyonu ekleyin. Daha sonra kapağı kapatın, tabak ile kapak arasındaki boşluğu bir vinil bant şeridi ile kapatın ve 50 santigrat derecede bir hibridizasyon inkübatöründe çalkalamadan üç saat inkübe edin.

İmmün boyamadan sonra, PBS'deki lekeli bölümlerin tabağını stereoskopik bir mikroskoba aktarın. 200 mikrolitre PBS'yi AMS kaplı beyaz cam slaytın ortasındaki bir damlacığa yerleştirin. Ardından, bir jejunum bölümünü tabaktan damlacığa aktarmak için bir P200 pipet ucu kullanın.

Bölüm hizalamasını ayarladıktan sonra, bölümü çevreleyen kalan tüm PBS'yi aspire edin. 20 mikrolitre sulu montaj ortamı ekleyin ve ortamın üzerine bir lamel yerleştirin. Lamel kenarlarını hemen ksilen bazlı montaj ortamı ile kapatın ve konfokal mikroskopiye başlamadan önce iki ila üç saat kurumasını bekleyin.