Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

Bu prosedürün genel amacı, antinükleer otoantikorları taramak ve aynı anda monospesifik ve karışık yoğun ince benekli 70 modeli doğrulamak için Yeni bir HEp-2, yoğun ince benekli 70 nakavt substratı kullanan geliştirilmiş, dolaylı bir immünofloresan testi göstermektir. Yeni HEp-2 substratı, ANA'lar olarak da bilinen klinik olarak anlamlı antinükleer antikorların taranması için standart, dolaylı bir immünofloresan prosedürü ve yorumlama kriterleri kullanır. Ana avantaj, tarama adımında yoğun ince benekli 70 paternini hastalıkla ilişkili, homojen benekli veya zorlu karışık desenlerden ayırt etme yeteneğidir.

Prosedürü göstermek, kalite kontrol laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Sofia Badanin olacaktır. Alt tabaka slaytları için, geleneksel HEp-2 hücrelerini veya geleneksel ve yoğun ince benekli 70 nakavt HEp-2 hücrelerinin bir karışımını içeren, her slaytta 12 oyuklu cam slaytlar kullanın. Optimum performans için alt tabaka slaytlarını içeren torbaların oda sıcaklığına dengelenmesini sağlayın ve numune eklemeden önce slayt yüzeyinde nemin yoğunlaşmasını önleyin.

Bu işlem 10 ila 15 dakika sürmelidir. Oda sıcaklığına dengelendikten sonra, alt tabaka slaytlarını parmaklarınızı kullanarak dikkatlice çıkarın, slaytlar ile poşetin kenarları arasındaki temastan kaçının. Slaytları etiketleyin ve numune ve konjuge inkübasyon sırasında slaytların kurumasını önlemek için nemli kağıt havlularla kaplı bir inkübasyon odasına yerleştirin.

Slaytları inkübasyon odasına yerleştirmeden önce yaklaşık 50 mikrolitre negatif ve pozitif kontrollerin yanı sıra seyreltilmiş hasta serumlarını ayrı ayrı slayt kuyucuklarına dağıtın. ANA testi, otoimmün bir hastalık taramasında ilk adımdır. Yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçları en aza indirmek için hasta numunelerinin slayt üzerinde çapraz kontaminasyonundan kaçınılması çok önemlidir.

Kuyu çapraz kontaminasyonunu önlemek için kuyuları aşırı doldurmaktan kaçının. Kapağı inkübasyon haznesine yerleştirin ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hastanın serumunda herhangi bir ANA varsa, bu süre zarfında her bir vasiyette bulunan hücrelere bağlanacaktır.

Kuluçka süresi sona erdiğinde, slaytı kuluçka odasından çıkarın. Slaytı sekme ucunda tutun ve yaklaşık 10 mililitre sulandırılmış fosfat tamponlu tuzlu su yıkama tamponu ile 10 ila 15 saniye boyunca nazikçe durulayın. Slaytı hemen PBS yıkama tamponu olan bir Coplin kavanozuna aktarın ve 10 dakika bekletin.

İşlemi kalan tüm slaytlarla tekrarlayın. Coplin kavanozundan her seferinde yalnızca bir slayt çıkarın. Fazla PBS yıkama tamponunu slayttan çıkarmak için, slaytı bir kağıt havlu üzerine hafifçe vurun veya kurulayın.

Her bir oyuğa nazikçe anti-insan IgG floresan konjugatı etiketli bir damla floresein izotiyosiyanat uygulayın. Ardından, slaytları kapalı boyama inkübasyon odasında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi sona erdiğinde, slaytı kuluçka odasından çıkarın.

Sürgüyü tırnak ucunda tutun ve yaklaşık 10 mililitre PBS yıkama tamponu ile daha önce olduğu gibi nazikçe durulayın. Slaytı hemen PBS yıkama tamponu olan bir Coplin kavanozuna aktarın ve 10 dakika bekletin. Kit içerisinde verilen kapak fişlerini kuru bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.

Kapak kaymasının alt kenarına, bir satırda 3 ila 4 damla montaj ortamı uygulayın. Ardından, yıkama tamponunu içeren Coplin kavanozundan her seferinde bir slayt çıkarın. Fazla yıkama tamponunu çıkarmak için, kağıt havlunun üzerindeki sürgüyü hafifçe vurun veya kurulayın.

Sürgü üzerinde fazla miktarda yıkama tamponu bırakmaktan, kapak kızağına çok fazla baskı uygulamaktan veya hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Bunların tümü hücre morfolojisini, ortaya çıkan floresan desenlerini ve reaksiyonların yoğunluğunu etkileyebilir. Sürgünün alt kenarını kapak sürgüsünün kenarına yerleştirerek sürgüyü yavaşça kapak kızağının üzerine indirin.

Bu, kapak kızağı üzerinde bulunan montaj ortamının sürgünün üst kenarına akmasına izin verir ve her bir oyuğun okunmasını engelleyebilecek hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirir. Karanlık odada bulunan bir floresein izotiyosiyanat filtre seti kullanarak slaytları floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Pozitiflik ve desenle ilgili son yorumu yapmak için numuneyi mikroskop altında 200 kat veya daha büyük bir büyütmede belirli parlak yeşil floresan açısından inceleyin.

Pozitif ve negatif kontrolleri gözlemleyin. Pozitif kontrol, çekirdekte parlak yeşil floresan gösterecektir. Negatif kontrol, bir floresan mikroskobu altında belirli bir yeşil floresan göstermeyecektir.

Her kuyucuk için pozitif veya negatif sonucu kaydedin ve pozitif vakalar için ANA modelini ekleyin. HEp-2 yoğun ince benekli 70 nakavt substratı, tüm ana nükleer ve sitoplazmik modelleri korur. Yoğun ince benekli desen, interfaz çekirdeği ve mitotik fazdaki kromatin boyunca düzgün dağılmış benekli lekelenmenin varlığı ile karakterize edilir.

Yoğun ince benekli 70 antijeni eksprese eden konvansiyonel HEp-2 hücrelerinin ve antijenden yoksun tasarlanmış HEp-2 hücrelerinin varlığı, konvansiyonel HEp-2 substratlarının tüm avantajlarını korurken, yoğun ince benekli 70 modelinin doğru bir şekilde ayırt edilmesini kolaylaştırır. Majör hastalıkla ilişkili ANA paternleri için pozitif serumlar, eşit oranlarda yoğun ince benekli 70 patern pozitif serum ile karıştırıldı ve hem geleneksel HEp-2 hem de HEp-2 yoğun ince benekli 70 nakavt substratları üzerinde test edildi. Burada, kırmızı oklar mitotik fazdaki hücreleri gösterir.

Sarı oklar geleneksel HEp-2 çekirdeklerini ve mavi oklar tasarlanmış HEp-2 çekirdeklerini gösterir. Gösterilen tüm reaksiyon kombinasyonları için, yoğun ince benekli 70 nakavt substratı, değiştirilmemiş hücreler ile aynı görüş alanındaki mühendislik hücreleri arasında net bir yoğunluk farkı gösterir. Bu, mono-spesifik ve karışık yoğun ince benekli 70 reaksiyonun ayırt edilmesine yardımcı olur.

Nükleer ve sitoplazmik antijenlere karşı otoantikorlar, sistemik otoimmün hastalıklarda oldukça yaygındır. PSIP1 proteini olarak da bilinen DFS70'e karşı otomatik antikorlardan kaynaklanan yoğun ince benekli desenin sağlıklı popülasyonlarda oldukça yaygın olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, bu DFS70 otoantikorları hem izolasyonda hem de diğer hastalıkla ilişkili ANA'larda ortaya çıkar.

Bu, klinik laboratuvarların bu modeli diğer hastalıkla ilişkili modellerden doğru bir şekilde ayırt etmesini kritik hale getirir. Örneğin, Lupus ile ilişkili karışık homojen benekli modelde, çoklu doğrulayıcı testler gerektiren DFS70 modeli olarak yanlış yorumlanabilir. HEp-2 substratlarının kullanıldığı indirekt immünofloresan yöntemi, ANA'lar için altın standart tarama yöntemi olarak kabul edilmektedir.

Bununla birlikte, doğruluk büyük ölçüde teknisyenin becerisine, bireysel adımların dikkatli bir şekilde yürütülmesine ve ortaya çıkan modellerin doğru yorumlanmasına bağlıdır. Tersine, geleneksel HEp-2 ve DFS70 nakavt alt tabakalarının karşılaştırmalı değerlendirmesi, bu yeni alt tabakanın ANA'ları tararken DFS70 modelini yüksek güvenle ayırt etmedeki faydasını göstermektedir. Hem monopozitif hem de karışık DFS70 modellerinin daha fazla yorumlanması, bu geliştirilmiş HEp-2 substratı kullanılarak nispeten basitleştirildi.

Yeni substrat, klinik olarak ilgili tüm ANA paternleri için standart, dolaylı bir immünofloresan protokolü ve belirlenmiş yorumlama kriterleri kullanır.