Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi Enterococcus spp. Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Bu Dubleks Dijital PCR Testinin genel amacı, sulardaki genel ve insan ile ilişkili dışkı kontaminasyonunu aynı anda ölçmektir. Bu Test, rekreasyonel su kalitesi izlemesinde, genel dışkı göstergesinin, yani Enterococcus ve daha da önemlisi insan dışkısı ile ilişkili HF183 İşaretleyicisinin sularda olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu Testin ana avantajı, bir reaksiyonda iki hedefi ölçmesi ve qPCR ile karşılaştırıldığında, standart eğrileri çalıştırma ihtiyacını ve dolayısıyla ilişkili yanlılığı ve değişkenliği ortadan kaldırmasıdır. Prosedürü gösteren Kıdemli Araştırma Teknisyenimiz Meredith Raith olacak. Bu prosedüre başlamak için, önce protokol metninde açıklandığı gibi Moleküler Dereceli Sudaki tüm primerler ve TEPH 8 Tamponundaki problar için litre başına 100 Mikromol stok konsantrasyonu hazırlayın.

Ardından, uygun miktarlarda Dijital PCR karışımı, ileri ve geri primerleri, floresan probu ve Nükleaz İçermeyen Suyu karıştırarak bir Ana Karışım hazırlayın. Solüsyona hava kabarcıkları girmemesine dikkat ederken karıştırmak için en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. dPCR Master Mix, geleneksel qPCR Master Mix'ten daha viskoz olduğundan, homojen bir çözelti oluşturmak için pipetleme tekniği ile karıştırma kullanmak gerekir.

Bu, aşağı yönde doğru dPCR miktar tayinine izin verir. Numuneleri çift olarak çalıştırmak üzere Damlacık Üretimi için Test Karışımını yapmak için, 36 mikrolitre Master Mix'i normal bir PCR plakasına pipetleyin. 36 mikrolitrelik Master Mix'lerin her birine, 12 mikrolitre DNA şablonunu karıştırın ve karşılık gelen replikat kuyucuklarını plaka üzerinde boş bırakın.

Testin düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontroller ekleyin. Plaka içinde kontaminasyon olmadığından emin olmak ve daha sonra veri analizi için floresan taban çizgisini ayarlamak için Şablon Kontrolleri veya NTC'ler Dahil Etmeyin. Damlacık Jeneratörünü kurmadan önce, karışımları yaklaşık 15 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için çok kanallı bir pipet kullanarak Tahlil Karışımlarını karıştırın.

Karışım içinde erişim kabarcıkları oluşmasını önlemek için pipet ucunun sıvının içinde kaldığından emin olun. Ardından, sekiz kuyu içeren kartuşu beyaz bir kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş tutucuyu tıklayarak kapatın. Kartuş bir artık sıkıca yerine oturmuştur ve damlacıklar oluştururken tutucudan çıkarılamaz.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, 20 mikrolitre Tahlil Karışımını hava kabarcıkları oluşturmadan kartuş işaretli numunenin orta konumuna nazikçe aktarın. 70 mikrolitre Damlacık Oluşturma yağını kartuşun sol tarafına, işaretli yağa pipetleyin. Kartuşu bir contayla kapatın, contanın düz olduğundan ve kartuşun kenarına doğru dört kene tarafından eşit şekilde tutulduğundan emin olun.

Kapıyı açmak ve kartuşu yerleştirmek için Damlacık Jeneratörü üzerindeki yeşil ışıklı düğmeye basın. Jeneratörü kapatmak için düğmeye tekrar basın. Kapı kapandıktan sonra yeşil düğme kararır ve kapı tekrar açılamaz.

Damlacık Oluşumu hemen başlayacak ve yaklaşık bir dakika devam edecektir. Damlacık Oluşturma devam ederken, kartuş iki'yi ikinci bir beyaz kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş bir'le aynı şekilde hazırlayın. Damlacık Üretimi tamamlandığında, loş ışıklı düğme yeşile dönecektir.

Damlacık Jeneratörü kapağını açın, kartuş içeren beyaz kartuş tutucuyu çıkarın ve bir kenara koyun. Kartuş ikisini Damlacık Jeneratörüne yerleştirin. Contayı birinci kartuştan çıkarın ve atın.

Eylem yeni oluşan damlacıkları kırabileceğinden beyaz kartuş tutucunun düğmesini açmayın. 40 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, uçları 45 derecelik bir açıyla işaretlenmiş damlacıkların üçüncü sütununa yerleştirin ve tüm damlacıkları yavaşça pipetleyin. Pipet ucunu kuyu duvarına yaklaşık yarıya kadar koyarak ve damlacıkları yavaşça dışarı atarak bunları son PCR plakasına aktarın.

Aynı şekilde, kartuş iki için Damlacık Oluşturma işlemi tamamlandığında, contayı kartuş ikiden çıkarın ve üretilen damlacıkları son PCR plakasına aktarın. Plakanın üzerine delinebilir bir folyo kapak yerleştirin ve bir plaka kapatıcıya yerleştirin. Kapatıcıyı 180 santigrat dereceye ayarlayın, kapatıcıda oynat düğmesine basın ve 10 saniye boyunca kapatın.

Bu prosedüre başlamak için, kapalı son PCR plakasını termocycler'a yerleştirin. Son PCR plakası ile uyumlu ve saniyede iki santigrat derece sıcaklık rampa hızına sahip bir termodöngüleyici kullanın. Aşağıdaki termal programı çalıştırın: 95 santigrat derecede on dakika, ardından 94 santigrat derecede 30 saniyelik 40 döngü ve 60 santigrat derecede 60 saniye ve ardından 98 santigrat derecede on dakikalık bir tutma yapın.

Döngü tamamlandıktan sonra, her bir kuyucuktaki her damlacıktaki floresanların otomatik ölçümü için plakayı bir Damlacık Okuyucuya aktarın. Damlacık Okumaya devam etmeden önce damlacıkların oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Damlacık Okumayı ayarlamak için beraberindeki yazılımı açarak başlayın.

Boş bir 96 kuyulu plakanın şemasını içeren varsayılan kurulum menüsünde, Örnek, Tahlil 1 ve Tahlil 2 olmak üzere üç bölüm içeren menüyü açmak için A1 kuyusuna çift tıklayın. Örnek bölümünde, Ad etiketli kutuya Örnek Kimliği'ni yazın ve sağdaki Uygula işaretli kutuyu işaretleyin. Ardından, deney etiketli açılır menüyü tıklayın, Nadir Olay Algılama için KIRMIZI'yı seçin ve Enter'a tıklayın.

Tahlil 1 olarak gösterilen bölüme geçin. Ad bölümünde, Tahlil'i doldurun ve Enter'a tıklayın. Tür etiketli aşağıdaki kutuda, açılır menüyü tıklayın, Kanal 1 Bilinmeyen'i seçin ve Enter'a tıklayın.

Tahlil 2 ile gösterilen bölüme geçin. Ad bölümünde, Tahlil'i doldurun ve Enter'a tıklayın. Tür etiketli kutunun altındaki açılır menüyü tıklayın, Kanal 2 Bilinmeyen'i seçin ve Enter'a tıklayın.

Önceki adımlardan elde edilen tüm bilgiler artık kuyuda A1.Name damlacıklar içeren sonraki tüm kuyularda mevcuttur. Toplam kurulum süresinden tasarruf etmek için, aynı anda birden fazla kuyu seçmek için shift veya kontrole tıklayın. Plakanın dijital görüntüsü fiziksel plakayı yansıttığında, menünün sağ alt kısmındaki Tamam'a basın.

Plaka şemasının üst kısmında görünen yeni menüde, Şablon'un altında Farklı Kaydet'i seçin ve plakayı adlandırıp kaydedin. Ekranın sol tarafında, Çalıştır'a tıklayın ve açılan Çalıştırma Seçenekleri penceresinde uygun Boya Seti'ni seçin. Veri toplama işlemi başlar ve yazılımda gerçek zamanlı olarak görüntülenir.

Okuyucu tamamlandığında ve Çalıştır Tamamlandı yazan bir kutu görüntülendiğinde, Tamam'ı tıklatın. Pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki ayrımı kontrol edin. NTC kuyularındaki tüm damlacıklardaki floresanların taban çizgisine yakın olduğundan emin olun. Etkinlikler etiketli düğmeye tıklayın.

Alt kısımda, Tek adlı kutuya tıklayın ve sunulan Histogramın sağında, kuyucuk başına kabul edilen damlacıkların toplam sayısını göstermek için Toplam adlı kutuya tıklayın. Kontrol tuşunu basılı tutarak ve hariç tutulacak kuyulara tıklayarak 10.000'den az damlacık içeren kuyuları hariç tutun. Floresan eşiğini, her iki hedef için NTC kuyularındaki negatif damlacıkların yaklaşık bir standart sapmasına ayarlamak için 1D Genlik ile gösterilen düğmeye tıklayın.

Ekranın en solunda, iki eşik düğmesini gösteren Otomatik Analiz'in altında, sağdaki düz pembe yatay bir çizginin geçtiği simgeyi seçin. Genlik Grafiklerinin her birinin altındaki Eşik Ayarla'nın solundaki kutuya tıklayın ve uygun floresan eşik değerlerini girin. Mikrolitre reaksiyon başına kopyadaki hedef konsantrasyonlar daha sonra otomatik olarak hesaplanır.

1D Genlik ekranının sol üst köşesindeki Dışa Aktar düğmesine tıklayarak sonuçları bir CSV dosyasında dışa aktarın. CSV dosyasında, mikrolitre reaksiyon başına hedef kopyasından mikrolitre DNA şablonu başına hedef kopyasına dönüştürmek için dışa aktarılan hedef konsantrasyonu dört ile çarpın. Bu şekil, Dijital PCR Testinin dubleks ve simpleks formatlarını karşılaştırır.

Sol ve sağ paneller, dubleks ve simpleks sonuçlar arasındaki karşılık gelen korelasyon katsayıları ile sırasıyla Enterococcus ve HF183 Quantification'ı görüntüler. Düz çizgiler regresyon çizgilerini gösterir ve gri gölgeleme karşılık gelen standart hataları gösterir. Farklı numune türleri sembollerle belirtilmiştir.

Sonuçlar oldukça tutarlıdır ve Enterococcus ve HF183'ün bir reaksiyonda aynı anda mı yoksa iki reaksiyonda ayrı ayrı mı ölçüldüğü genellikle ayırt edilemez. Dijital PCR Testi, qPCR muadilleri tarafından tolere edilenden bir ila iki kat daha yüksek konsantrasyonlarda inhibitörü de tolere edebilir. Bu şekil, PCR'yi inhibe eden hümik asit konsantrasyonlarındaki artışla birlikte temiz kanalizasyon DNA'sındaki HF183 markörünün qPCR ve Dijital PCR Miktar Tayinini göstermektedir.

İnhibitörlerin yokluğunda beklenen HF183 Kantifikasyonu, iki yatay noktalı çizgi arasında %95'lik bir güven kesişimi olarak tanımlanır. Üçgenlerle gösterilen dijital PCR, mikrolitre reaksiyonu başına 15 nanogramlık bir hümik asit konsantrasyonuna kadar doğru miktar tayini sağlamaya devam ederken, çaprazlarla gösterilen qPCR, mikrolitre başına bir nanogramda hafife alınmaya başlar ve mikrolitre başına beş nanogramda tamamen inhibe edilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu enteral HF183 Dubleks Damlacık Dijital PCR Testi veya diğer benzer Testin farklı primerler ve problar kullanılarak nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalısınız.

2015 yılında su araştırmalarında yayınlanan bu Dubleks Testin geliştirilmesinden bu yana, genel dışkı indikatör bakterileri, mikrobiyal izleme belirteçlerini ve su kaynaklı patojenleri hedef alan bir dizi başka Dijital PCR Testi geliştirdik ve doğruladık. Bu Tahliller, hedeflerinin doğrudan ve tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlar ve Su Kalitesi Testi alanında qPCR Testlerine faydalı alternatifler haline gelir.