Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi

Bu Dupleks Dijital PCR Analizinin genel amacı, sulardaki genel ve insan kaynaklı fekal kontaminasyonu eş zamanlı olarak nicelleştirmektir. Bu Analiz, rekreasyonel su kalitesi izlemede, sularda ne kadar genel fekal indikatörün (örneğin Enterococcus) ve daha da önemlisi, insan fekal kontaminasyonu ile ilişkili HF183 Marker'ın bulunduğuna dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu Analizin temel avantajı, tek bir reaksiyonda iki hedefi miktarlandırmasıdır ve qPCR ile karşılaştırıldığında, standart eğrilerle çalışma gereksinimini, dolayısıyla buna bağlı yanlılığı ve değişkenliği ortadan kaldırır. Prosedürü Kıdemli Araştırma Teknisyenimiz Meredith Raith uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, öncelikle protokol metninde açıklandığı şekilde, tüm primerler için Moleküler Sınıf Su içinde ve problar için TEPH 8 Tamponu içinde 100 Micromole per liter stok konsantrasyonlar hazırlayın.

Ardından, uygun miktarlarda Digital PCR karışımı, ileri ve geri primerler, floresan prob ve Nükleaz İçermeyen Su karıştırarak bir Master Mix hazırlayın. Çözeltiye hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek, karıştırmak için pipetle en az 10 kez aşağı yukarı çekme işlemi yapın. dPCR Master Mix, konvansiyonel qPCR Master Mix'ten daha viskoz olduğundan, homojen bir çözelti oluşturmak için pipetle karıştırma tekniğini kullanmak gereklidir.

Bu, daha sonraki aşamalarda doğru dPCR kantifikasyonu yapılmasını sağlar. Örnekleri çift kopya (duplicate) olarak çalıştırmak için Damlacık Üretimi Deney Karışımını hazırlamak üzere, standart bir PCR plakasına 36 µL Master Mix pipetleyin. Her bir 36 µL Master Mix'e, plaka üzerindeki karşılık gelen replika kuyucuklarını boş bırakacak şekilde 12 µL DNA şablonu karıştırın.

Analizin düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontroller ekleyin. Plak içinde kontaminasyon olmadığını doğrulamak ve veri analizi için daha sonra floresan baz çizgisini belirlemek amacıyla Kalıp İçermeyen Kontroller veya NTC'ler ekleyin. Droplet Generatörü'nü kurmadan önce, çok kanallı bir pipet kullanarak Analiz Karışımlarını yaklaşık 15 kez aşağı yukarı pipetleyip karıştırın.

Karışım içerisinde hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için pipet ucunun sıvının içinde kaldığından emin olun. Ardından, sekiz kuyu içeren birinci kartuşu beyaz bir kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş tutucuyu kapatarak kilitleyin. Birinci kartuş artık sabitlenmiştir ve damlacıklar oluşturulurken tutucudan yerinden çıkmayacaktır.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, hava kabarcığı oluşturmadan 20 µL Assay Mixture'ı kartuşun üzerinde örnek olarak işaretlenmiş orta pozisyonuna nazikçe aktarın. Kartuşun üzerinde yağ olarak işaretlenmiş sol tarafına 70 µL Droplet Generation yağı pipetleyin. Kartuşu, contanın düz olduğundan ve kartuşun kenarına doğru olan dört işaret tarafından eşit şekilde tutulduğundan emin olarak bir conta ile kapatın.

Kapağı açmak ve kartuşu yerleştirmek için Droplet Generator üzerindeki yeşil ışıklı düğmeye basın. Jeneratörü kapatmak için düğmeye tekrar basın. Kapak kapandıktan sonra yeşil düğme söner ve kapak tekrar açılamaz.

Damlacık Oluşturma işlemi hemen başlayacak ve yaklaşık bir dakika boyunca devam edecektir. Damlacık Oluşturma işlemi sürerken, ikinci kartuşu ikinci beyaz kartuş tutucuya yerleştirin ve birinci kartuşta olduğu gibi hazırlayın. Damlacık Oluşturma tamamlandığında, sönük yanan düğme yeşile dönecektir.

Damlacık Üreteci kapağını açın, birinci kartuşu içeren beyaz kartuş tutucuyu çıkarıp kenara ayırın. İkinci kartuşu Damlacık Üreteci'ne yerleştirin. Birinci kartuştaki contayı çıkarıp atın.

Yeni oluşturulan damlacıklar bozulabileceği için beyaz kartuş tutucuyu yerinden çıkarmayın. 40 µL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, uçları kartuşun damlacıklar şeklinde işaretlenmiş üçüncü sütununa 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve tüm damlacıkları yavaşça çekin. Pipet ucunu kuyucuk duvarının yaklaşık orta kısmına dayayarak ve damlacıkları yavaşça boşaltarak onları son PCR plakasına aktarın.

Aynı şekilde, ikinci kartuş için Damlacık Üretimi tamamlandığında, contayı ikinci kartuşun üzerinden çıkarın ve üretilen damlacıkları nihai PCR plakasına aktarın. Plakanın üzerine delinebilir bir folyo kapak yerleştirin ve plakayı bir plaka kapatıcıya yerleştirin. Kapatıcıyı 180 degrees celsius'ye ayarlayın, kapatıcıdaki başlatma düğmesine basın ve 10 saniye boyunca mühürleyin.

Bu prosedüre başlamak için, mühürlenmiş final PCR plağını termosikletöre yerleştirin. Final PCR plağıyla uyumlu ve saniyede iki santigrat derece sıcaklık artış hızına sahip bir termosikletör kullanın. Şu termal programı çalıştırın: 95 °C'de on dakika, ardından 94 °C'de 30 saniye ve 60 °C'de 60 saniyelik 40 döngü ve son olarak 98 °C'de on dakikalık bir bekletme.

Döngüler tamamlandığında, her kuyucuktaki her damlacıktaki floresanların otomatik olarak ölçülmesi için plakayı bir Droplet Reader'a aktarın. Damlacık Okuma işlemine geçmeden önce damlacıkların oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Damlacık Okuma işlemini kurmak için beraberindeki yazılımı açarak başlayın.

Boş bir 96 kuyucuklu plaka şemasının bulunduğu varsayılan kurulum menüsünde, Örnek, Assay 1 ve Assay 2 şeklinde üç bölüm içeren menüyü açmak için A1 kuyucuğuna çift tıklayın. Örnek bölümünde, Name etiketli kutuya Örnek ID'sini yazın ve sağdaki Apply kutucuğunu işaretleyin. Ardından, experiment etiketli açılır menüye tıklayın, Rare Event Detection (Nadir Olay Tespiti) için RED seçeneğini seçin ve Enter'a tıklayın.

Assay 1 olarak belirtilen bölüme gidin. Name (İsim) bölümünde, Assay kısmını doldurun ve Enter'a tıklayın. Aşağıda Type (Tür) olarak etiketlenen kutuda, açılır menüye tıklayın, Channel 1 Unknown seçeneğini belirleyin ve Enter'a tıklayın.

Assay 2 olarak belirtilen bölüme geçin. Name (İsim) bölümünde, Assay kısmını doldurun ve Enter'a tıklayın. Altındaki Type (Tür) etiketli kutuda, açılır menüye tıklayarak Channel 2 Unknown seçeneğini belirleyin ve Enter'a tıklayın.

Önceki adımlardan gelen tüm bilgiler şu an A1 kuyucuğunda bulunmaktadır. Damlacık içeren tüm sonraki kuyucukları isimlendirin. Toplam kurulum süresini kısaltmak için, birden fazla kuyucuğu aynı anda seçmek üzere shift veya control tuşuna tıklayın. Plakanın dijital temsili fiziksel plaka ile eşleştiğinde, menünün sağ alt köşesindeki OK düğmesine basın.

Plaka şemasının üst kısmında beliren yeni menüde, Şablon altında Farklı Kaydet'i seçip plakaya bir isim vererek kaydedin. Ekranın solunda yer alan Çalıştır'a tıklayın ve açılan Çalıştırma Seçenekleri penceresinde uygun Boya Setini seçin. Veri toplama işlemi başlayacak ve yazılımda gerçek zamanlı olarak görüntülenecektir.

Okuyucu işlemi tamamladığında ve "Run Complete" (Çalışma Tamamlandı) belirten bir kutu göründüğünde, OK'ye tıklayın. Pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki ayrımı kontrol edin. NTC kuyucuklarındaki tüm damlacıklarda floresan değerlerinin temel çizgiye yakın olduğundan emin olun. Events (Olaylar) etiketli düğmeye tıklayın.

Alt kısımda, Single adlı kutucuğa tıklayın ve sunulan Histogram'ın sağında, kuyucuk başına kabul edilen toplam damlacık sayısını görüntülemek için Total adlı kutucuğa tıklayın. Kontrol tuşuna basılı tutarak ve hariç tutulacak kuyucuklara tıklayarak, 10,000 damlacıktan daha az içeren tüm kuyucukları hariç tutun. Her iki hedef için NTC kuyucuklarındaki negatif damlacıkların yaklaşık bir standart sapmasında floresan eşiğini ayarlamak için 1D Amplitude ile belirtilen düğmeye tıklayın.

Ekranın en solunda, iki eşik düğmesini gösteren Auto Analyze kısmının altında, içinden düz pembe yatay bir çizgi geçen sağdaki simgeyi seçin. Her bir Genlik Grafiğinin (Amplitude Graphs) altındaki Set Threshold kutusunun solundaki kutucuğa tıklayın ve uygun floresan eşik değerlerini girin. Mikrolitre reaksiyon başına kopya cinsinden hedef konsantrasyonlar daha sonra otomatik olarak hesaplanır.

1D Genlik (Amplitude) ekranının sol üst köşesindeki Export butonuna tıklayarak sonuçları bir CSV dosyası olarak dışa aktarın. CSV dosyasında, dışa aktarılan hedef konsantrasyonunu mikrolitre reaksiyon başına hedef kopya sayısından, mikrolitre DNA kalıbı başına hedef kopya sayısına dönüştürmek için dörtle çarpın. Bu şekil, Dijital PCR Analizinin dupleks ve simpleks formatlarını karşılaştırmaktadır.

Sol ve sağ paneller sırasıyla Enterococcus ve HF183 miktar belirlemelerini ve duplex ile simplex sonuçları arasındaki ilgili korelasyon katsayılarını göstermektedir. Düz çizgiler regresyon çizgilerini, gri gölgelendirme ise ilgili standart hataları belirtmektedir. Farklı örnek türleri sembollerle gösterilmiştir.

Enterococcus ve HF183'ün tek bir reaksiyonda eş zamanlı olarak veya iki ayrı reaksiyonda ayrı ayrı ölçülmesi durumunda sonuçlar oldukça tutarlıdır ve genellikle ayırt edilemez. Dijital PCR Analizi, qPCR karşılıklarının tolere edebildiğinden bir ila iki büyüklük sırası daha yüksek konsantrasyonlardaki inhibitörlere karşı da dayanıklılık gösterebilir. Bu şekil, PCR'ı inhibe eden hümik asit konsantrasyonu artırılmış temiz kanalizasyon DNA'sı ile desteklenmiş HF183 markörünün qPCR ve Dijital PCR Kantifikasyonunu göstermektedir.

İnhibitörlerin yokluğunda beklenen HF183 kantifikasyonu, iki yatay noktalı çizgi arasındaki %95 güven aralığı olarak tanımlanmıştır. Üçgenlerle belirtilen dijital PCR, reaksiyon başına 15 nanogram/µL hümik asit konsantrasyonuna kadar doğru kantifikasyon sağlamaya devam ederken; çarpılarla belirtilen qPCR, 1 nanogram/µL seviyesinde düşük tahmin etmeye başlar ve 5 nanogram/µL seviyesinde tamamen inhibe olur. Bu videoyu izledikten sonra, bu enteral HF183 Düpleks Droplet Dijital PCR Analizini veya farklı primerler ve problar kullanan benzer diğer analizleri nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

2015 yılında Water Research dergisinde yayınlanan bu Duplex Assay'in geliştirilmesinden bu yana, genel fekal indikatör bakterileri, mikrobiyal izleme belirteçlerini ve suyla bulaşan patojenleri hedefleyen bir dizi başka Dijital PCR Assay geliştirdik ve doğruladık. Bu Assay'ler, hedeflerinin doğrudan ve tarafsız nicelendirmesini sağlamakta olup Su Kalitesi Testi alanında qPCR Assay'lerine yararlı alternatifler haline gelmektedirler.