Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu prosedürün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerinden yüksek derecede standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir ön beyin tipi organoidler üretmektir. Bu yöntem, yeni geliştirme NTZ'lerinin mekanizmalarını modellemek için güçlü bir araçtır. Özellikle, erken insan kortikal oluşumu ile ilgili temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, bireysel organoidler ve organoid partiler arasında çok az varyasyon ile insan kortikal dokusunun standartlaştırılmış ve zaman açısından verimli bir şekilde üretilmesine izin vermesidir. Organoid teknolojisi, insan beyninin gelişimi, yapısı ve işlevi hakkında, özellikle de daha düşük türlerin beyin modellerinde bulunmayan yönler için içgörü sağlayabilir. Pluripotent kök hücre agregatları oluşturmak için, kök hücre kültürleri %70 ila 90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri ayırmak için altı kuyucuklu kültür plakasının bir kuyucuğuna 500 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin.

Tek tabakalı kültür koşullarına adapte edilmiş indüklenmiş pluripotent kök hücreler, ayrışma ve agregasyon prosedürü sırasında strese bağlı hücre ölümüne daha az eğilimli oldukları için agrega oluşturmak için iyi bir hücre tipidir. 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika sonra, plakaya hafifçe vurun ve hücreleri kuyu dibinden yıkamak için iki mililitre DMEM / F-12 kullanın. Elde edilen hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücre çözeltisinin hacmini daha fazla DMEM / F-12 ortamı ile 10 mililitreye getirin.

Saydıktan sonra, pluripotent kök hücre agregatı başına üçüncü hücrelere 4.5 kez 10 kez yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri, 150 mikrolitre orta konsantrasyonda 4.5 kez 10 ila üçüncü hücreler elde etmek için 50 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş uygun hacimde pluripotent kök hücre ortamında askıya alıyoruz. Daha sonra, 96 oyuklu düşük bağlantılı U-alt plakanın ayrı kuyucuklarına 150 mikrolitre hücre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Anterior nöroektoderm indüksiyonunu izlemek için, pluripotent kök hücre agregatlarının morfolojik değişikliklerini her gün düşük büyütme altında yakından gözlemlemek için bir doku kültürü mikroskobu kullanın. Birinci gün, net sınırları olan hücre agregaları gözlenmelidir. İkinci günde, her bir oyuğun dibindeki hücre agregalarını bozmadan, ortamın yaklaşık üçte ikisini dikkatlice aspire edin ve atılan ortamı 100 mikrolitre taze pluripotent kök hücre ortamı ile değiştirin.

Dört ila altı gün sonra, hücre agregaları çapa 350 ila 450 mikrometre çapa ulaştığında ve pürüzsüz kenarlar sergilediğinde, 20 agregayı beş mililitre kortikal indüksiyon ortamı içeren tek bir altı santimetre düşük bağlantı kültür plakasına aktarmak için modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Kortikal indüksiyon ortamını her üç günde bir taze ortamla değiştirin ve agregaların morfolojisini 4X hedefi altında günlük olarak izleyin. Kortikal indüksiyon ortamında dört ila beş gün sonra, hücre agregatlarının kenarları yüzeyde parlamaya başlamalı, bu da nöroektodermal farklılaşmayı göstermeli ve psödostratifiye bir epitelin radyal organizasyonu ortaya çıkmalıdır.

Nöroektodermal agregaları bir matris iskelesine gömmek için, bazal membran ekstraktını iki ila üç saat boyunca buz üzerinde çözdürün. Ekstrakt çözülürken, plastik parafin filmini 16 organoid başına dört x dört santimetre kareye kesmek için steril makas kullanın ve her bir film parçasını boş bir 100 mikrolitrelik mikropipet ucu tepsisine yerleştirin. Parafin filme eldivenli bir parmak ucunuzla küçük çukurlar görünecek şekilde bastırın ve filmi %70 etanol ile temizleyin.

30 dakika boyunca kapalı, steril bir biyogüvenlik kabininde UV radyasyonundan sonra, her bir hücre agregasını filmdeki bir çukura aktarmak için bir buçuk ila iki milimetre açıklığa sahip modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Tüm agregalar aktarıldığında, ortamı her çukurdan dikkatlice aspire etmek için kesilmemiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve her hücre agregasına 40 mikrolitre seyreltilmemiş bazal membran özü ekleyin. Gelişmekte olan nöroepitele zarar vereceğinden, pipet ucuna kaba manipülasyon veya aspirasyon yoluyla organoidlere zarar vermemeye dikkat edin.

Agregaları her damlanın ortasına yerleştirmek için pipet ucunu kullanın ve plastik parafin film tabakasını dikkatlice 10 santimetrelik bir petri kabına aktarmak için steril forseps kullanın. Çanağı 15 ila 20 dakika inkübatöre yerleştirin. Ekstrakt katılaşırken, altı santimetrelik düşük ataşman kültür kabına beş milimetre taze kortikal indüksiyon ortamı ekleyin.

Kuluçka işleminin sonunda, parafin film tabakasını ters çevirin ve her altı santimetrelik tabağa 16 polimerize damlacığı hafifçe sıkmak için steril forseps kullanın. Daha sonra agregaları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi gün, organoid kültür kaplarını, agregalar ilgilenilen farklılaşma aşamasına ulaşana kadar, günlük ışık mikroskobu izleme ile bir hücre kültürü inkübatörü içinde 14 rpm'de beş derecelik bir açıyla eğilmiş, sallanan bir hücre kültürü çalkalayıcısına aktarın.

20. günde, agrega kültürlerinden altı organoid toplamak için üç ila üç buçuk mililitre açıklığa sahip modifiye edilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Organoidlerin üçünü 500 mikrolitre PBS içeren 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yerleştirin ve organoidleri yıkama başına 500 mikrolitre taze PBS ile iki kez yıkamak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. İkinci yıkamadan sonra, organoidleri 15 dakika boyunca soğuk% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından oda sıcaklığında PBS'de 10 dakikalık üç yıkama ve dört santigrat derecede% 30 sükroz çözeltisinde son bir gece dehidrasyonu yapın.

Ertesi gün, kriyoseksiyon prosedürü sırasında organoidlerin görselleştirilmesine izin vermek için susuz organoidleri 10 dakika boyunca bir ila 50 Tripan Blue seyreltme ile önceden boyayın ve sakarozları taze hazırlanmış gömme ortamı ile değiştirin. Gömme ortamındaki organoidleri dengelemek için plakayı 60 derecelik bir ısıtma yastığı üzerinde 15 dakika ısıtın ve organoid başına bir gömme kalıbının altını taze gömme ortamı ile kaplayın. Gömme ortamını katılaştırmak için kalıbı buzun üzerine yerleştirin, organoidleri gömme kalıplarına aktarın ve her bir organoid kaplanana kadar yeni gömme ortamı ekleyin.

Daha sonra organoidleri %100 etanol kuru buz dondurma banyosunda en az bir dakika şokla dondurun ve immünositokimyasal analiz için her organoidin 20 mikrometre kalınlığında kesitlerini elde etmek için bir kriyostat kullanın. Ön beyin tipi organoidler oluşturmak için, yalnızca başlangıç popülasyonunda farklılaşmamış hücrelerin homojen bir tek tabakası olarak ortaya çıkan IPSC kültürlerini kullanın. İkinci günde, agregalar pürüzsüz kenarlı kompakt hücre tomurcukları oluşturmuş olmalıdır.

10. gün agregaları, dış yüzeyde nöroektodermin indüksiyonunu temsil eden pürüzsüz ve optik olarak pürüzsüz ve optik olarak yarı saydam doku göstermelidir. Protokol yakından takip edilirse, partiler içinde ve arasında polarize nöroektoderm oluşumunda %90'a eşit veya daha fazla homojenlik gösteren yüksek standartlaştırılmış organoid partiler üretilecektir. 20. gün organoidlerinin immünositokimyasal analizi, nöral kök hücre belirteci Sox2'yi, ön beyin belirteçleri Pax6 ve Otx2'yi ve dorsal kortikal belirteç Emx1'i eksprese eden tabakalı nöroepitelyal döngüleri ortaya çıkarır.

Bu kortikal döngüler ayrıca N-kaderin ve ZO-1'in apikal lokalizasyonu, yapıların apikalinden bazal tarafına kadar uzanan ventriküler bölge radyal glial hücre türevi mikrotübül ve fosforile vimentin için pozitif boyanan apikal yerleşimli bölme hücreleri ile karakterize edilir. Apikal radyal glial hücrelerin bölünme düzlemini analiz etmek için, mitotik iğ ve interkinetik nükleer göç sırasında apikal süreçleri görselleştirmek için kullanılabilen mikrotübül ile ilişkili bir protein olan vimentin ve Tpx2 için çift boyama gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinden yüksek düzeyde standartlaştırılmış ve homojen ön beyin tipi organoidlerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik, nörodokuya özgü bir şekilde düzenlenmiş karmaşık bir 3D hücre modeli kullanarak nörogelişimsel bozuklukların insana özgü yönlerinin incelenmesini kolaylaştırır. Tekniğe hakim olduktan sonra, bu kortikal organoidler, hastalık modellemesi ve potansiyel olarak ilaç testi veya tedavisi dahil olmak üzere nörogelişimsel, evrimsel veya gen fonksiyonu çalışmaları gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.