Name: Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden standart ön beyin organoidleri üretme yöntemini. Bu teknik, erken insan kortikal gelişimini modellemek ve nörogelişimsel bozuklukları araştırmak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Bakanlığı yenilik bilim ve araştırma Kuzey Ren-Vestfalya (Junior araştırma grubu) ve dönem NET NÖRON, JTC 2015 nörogelişimsel bozukluklar, kök-MCD tarafından desteklenmiştir.

1. nesil IPSC toplamları
<ol><li>Tek hücreli monolayer kültürler IPSC kolonilerden nesil<ol>
<li>Bir membran kaplı özü (BME) 6-şey tabak hazırlamak. BME buz için 2-3 h 4 ° C'de erimek, soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal orta F12 ile seyreltik (DMEM-F12; 1:50 seyreltme), 1 mL/seyreltilmiş BME çözümün de plaka kapak ve plaka gecede 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Orta Aspire edin ve bozulmamış IPSC kolonileri 6-şey plaka ile 0,5 mM EDTA fosfat tamponlu tuz (PBS) en az 2 Wells önce iki kez kuluçka kolonileri 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) PBS (RT) oda sıcaklığında 4 dk ile yıkayın. EDTA çözüm Aspire edin ve yavaşça koloniler çanak alt 5 mL DMEM-F12 orta ile kapalı yıkayarak ayır. Onları bir 15 mL tüp içinde toplamak ve onları Santrifüjü (1200 x g , RT, 4 dk) tarafından cips. Not: iPSCs piyasada bulunan fibroblast yeniden programlanan başarıyla kullanılan10oldu.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin ve hücre-ayrılma reaktif 6 dk. 37 ° C'de için 500 µL ile IPSC kolonileri kuluçkaya</li>
		<li>Damlalıklı hücre süspansiyon kalan hücre kümeleri tek hücrelere kırmak için 1 mL pipet ile birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı.</li>
		<li>DMEM-F12 4 mL hücre-ayrılma reaktif sulandırmak için hücre süspansiyon ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri aşağı vasıl 1200 x g 4 dk RT. az için spin</li>
		<li>5 mikron ile desteklenmiş IPSC orta 2 mL hücrelerde resuspend Y-27632 ve tohum hücreleri kaplı BME 6-şey plaka bir kuyunun içine. Not: Bir tek hücreli monolayer IPSC kültürler için Malzemeler tablo belirtilen IPSC aracı kullanın.</li>
		<li>Ertesi gün, orta Y-27632 eksik taze IPSC orta ile değiştirin. Bu noktadan sonra orta iPSCs % 100 birleşmesi kadar her gün değişen hücreler kültür devam. Hücre ve başlangıç Wells confluency bağlı olarak, bu 2-4 gün arasında sürer.</li>
		<li>Bir kez Konfluent geçiş iPSCs. Orta Aspire edin ve hücre-ayrılma reaktif 500 µL hücreleri üzerinde uygulayın.</li>
		<li>5-10 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya Yavaşça hücreleri ayırmak için plaka rock.</li>
		<li>Kuyu hücrelerden yıkayın ve onları bir 15 mL tüp içinde toplamak 2 mL DMEM-F12 kullanma. DMEM-F12 toplam hacmi 5 mL için ekleyin.</li>
		<li>Spin aşağı vasıl 1200 x g RT, 4 dk için hücreleri ve süpernatant Aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri tohum 5 mikron ile desteklenmiş IPSC orta Y-27632 bir 1:2.1: 4 oranı bir BME tarih 6-şey plaka (2 mL/iyi orta) kaplı.</li>
		<li>2-5 gün için hücreleri kültür ve Y-27632 her gün eksik IPSC orta değiştirmek devam edin. Bir kez Konfluent geçit iPSCs (adımları 1.1.4-1.1.8). Not: Bir monolayer IPSC agrega üretimi için hücrelere kültür koşullarına uyum sağlamak için kullanmadan önce Malzemeler tablo belirtilen IPSC Orta olarak iPSCs en az 2 pasajlar için kültür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPSC agrega üretimi için % 70-90 birleşmesi olduklarında monolayer IPSC kültürler kullanın. Not: tek hücreleri vurgulamak daha az eğilimli olduğu gibi kültür şartlarına adapte IPSC ayrılma ve toplama işlemi sırasında hücre ölümüne yol açar. Monolayer IPSC kültürler tipik pluripotent Morfoloji farklılaşma hiçbir kanıt ile görüntülemeniz gerekiyor. Kültürler Mikoplazma kirlenme için düzenli olarak sınayın. Sadece Mikoplazma ücretsiz IPSC kültürleri ile çalışır.<ol>
<li>6-şey plaka bir kuyu kültür ortamından Aspire edin ve hücre-ayrılma reaktif 500 µL hücreleri üzerinde uygulayın.</li>
		<li>5-10 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya Yavaşça hücreleri ayırmak için plaka rock.</li>
		<li>Kuyu hücrelerden yıkayın ve onları bir 15 mL tüp içinde toplamak 2 mL DMEM-F12 kullanma. DMEM-F12 toplam hacmi 10 mL için ekleyin.</li>
		<li>Hücre sayımı için 25 µL hücre süspansiyon üzerinden alıp trypan ölü hücreleri işaretlemek için mavi 25 µL ile karıştırın. Bir sayım odası kullanarak yaşayan hücreleri saymak.</li>
		<li>Yeterince hücre (IPSC toplama başına 4.500 hücreleri) hücre süspansiyon 15 mL tüp içinde toplamak.</li>
		<li>Spin aşağı vasıl 1200 x g RT, 4 dk için hücreleri ve süpernatant Aspire edin.</li>
		<li>50 µM ile desteklenmiş IPSC orta uygun bir cilt hücrelerinde resuspend 150 µL başına 4.500 canlı hücre elde etmek için Y-27632. Not: Y-27632 yüksek konsantrasyon kullanarak (50 µM) iPSCs yaşam için önemlidir.</li>
		<li>Her 150 µL plaka iyi bir düşük-eki 96-şey U-alt plaka ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka yerleştirin. Not: IPSC toplamları oluşturma sırasında en az 6 organoids (bkz: Bölüm 5) 20 gün kalite kontrol için gerekli olan göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. indüksiyon ön Neuroectoderm
<ol><li>Yakından IPSC toplamları Morfoloji değişikliklerini her gün bir 4 X veya 10 X güç lens kullanarak doku kültürü mikroskop altında izlemeye. Günde 1, hücre toplamları açık sınırları ile gözlemlemek. Kültür IPSC toplamları kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2devam ediyor. Not: Ölü hücreler/iyi belirli sayıda normal ve organoid üretimi etkilemez.</li>
	<li>2 gün'den başlayan ve her geçen gün ile yavaşça yaklaşık 2/3 orta alt hücre toplamları bozmadan alıyorum tarafından devam IPSC toplamları besleme. Y-27632 eksik IPSC orta ek bir 100 µL ekleyin. Not: 4-6 gün içinde hücre toplamları çapı 350-450 µm olmak ve düzgün kenarlara sergilemek.</li>
	<li>Bu aşamada, havuzu hücre bir kesim 100 µL pipet ucu ile bir düşük-eki 6 cm tabak (en fazla 20 toplamları/çanak) içine DMEM-F12 içeren N2 ek (1: 200), B27 ek (1: 100), glikoz (0.2 mg/mL), döngüsel kortikal indüksiyon ortamda toplar Adenozin monofosfattır (kampı; 0.15 µg/mL), %0,5 non-gerekli amino asitler (NEAA), % 1'l-alanyl-L-glutamine, heparin (10 µg/mL) ve bileşikleri LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) ve inhibitörü Wnt yanıt-1 (IWR-1) (10 µg/mL). 6-cm çanak aktarmadan sonra 3 gün kortikal indüksiyon orta değiştirerek hücre toplamları besleme.</li>
	<li>Yakından bir 4 X güç lens ile doku kültürü mikroskop altında kortikal indüksiyon sırasında morfolojik değişiklikleri izlemek. Not: Kortikal indüksiyon ortamda 4-5 gün sonra hücre toplamları kenarlarını nöroektodermal farklılaşma gösteren yüzeyde aydınlatmak başlamalıdır. Bu aşamada, Radyal pseudostratified epitel organizasyonu ortaya çıkıyor. Bölüm 3 hücre toplamları BME dizey içinde katıştırmak için devam edin.</li>
</ol>3. nöroektodermal gömme bir matris iskele toplar
<ol><li>BME 4 ° c için 2-3 h. Aliquot su katılmamış BME yeterli miktarda buz çözme.</li>
	<li>Bir plastik parafin film sayfası katıştırma işlemi için hazırlanın. 4 cm x 4 cm büyük steril makas kullanarak plastik parafin film parçaları, plastik bir parça koy, 100 µL ipuçları için bir boş 100 µL ipucu tepsi üzerinde film alkol ve plastik parafin film sayfasında küçük Gamze (1 di oluşturulur eldivenli bir parmak ile basın kesim mple/gerekli hücre toplama). Plastik parafin film % 70 etanol ile temiz ve UV ışığı ile ışınlatayım (güç: 15 Watt, dalga boyu: 435 nm) 30 dk için kapalı steril tezgah altında.</li>
	<li>Her hücre toplama 1.5-2 mm çapında açılış ile 100 µL kesme ucu kullanarak plastik parafin film sayfasının bir çukur aktarın. İki toplamları hücre durumda erimiş, onları ayrı değil ama onları birlikte bir çukur için transfer.</li>
	<li>Yavaşça kesilmemiş bir 100 µL pipet ucu kullanarak hücre toplamları çevreleyen orta Aspire edin. Not: Bu agrega zarar verir gibi içine belgili tanımlık uç, hücre toplamları değil emmek için dikkatli olun.</li>
	<li>Su katılmamış BME 40 µL her hücre toplamak için ekleyin.</li>
	<li>Her hücrenin ortasında BME toplama bırakın kesilmemiş bir 100 µL pipet ucu kullanarak konum. Not: Pipet ucu ile gelişmekte olan neuroepithelium zarar vermeyecek çok dikkatli olun.</li>
	<li>Dikkatle plastik parafin film sayfası içine 10 cm Petri kabına steril forseps (veya başka bir yeterli hücre kültür tabak) kullanarak transfer ve 15-20 dk BME kuvvetlendirmek izin vermek için kuluçka çanak yerleştirin.</li>
	<li>Bu arada, kortikal indüksiyon orta 5 mL içeren bir düşük-eki 6 cm yemek hazırlamak.</li>
	<li>BME polimerizasyon sonra plastik parafin film sayfasından hücre toplamları içeren damlacıklar kaldırın. Steril forseps kullanarak üzerinden plastik parafin film çevirmek ve hafifçe sıkmak hücre toplamları içine biraz eğik (yaklaşık 30 °) damlacıkları plastik parafin film sayfası düşmek kadar düşük-eki 6 cm çanak. En fazla 16 hücre toplamları bir 6 cm çanak içine aktarın.</li>
	<li>Hücre toplamları 37 ° C'de kuluçkaya devam</li>
</ol>4. nesil nöroektodermal toplamları üzerinden ön-türü Organoids
<ol><li>Bir gün sonra BME dizey içinde katıştırma organoid kültür yemekleri eğme açısını 5 ° ve 14 d/d, bir hücre kültür kuluçka makinesine yüklü, sallanan bir hücre kültür shaker yerleştirin.</li>
	<li>Organoids her gün izlemek. Homojen neuroepithelial döngü benzeri yapıları BME matris içinde katıştırma sonra yavaş yavaş geliştirmek.</li>
	<li>Neuroepithelial döngü yapıları görünür olduğunda, orta DMEM-F12 N2 ek (1: 200), B27 ek (1: 100), glikoz (0.2 mg/mL), kamp (0.15 µg/mL), %0,5 içeren organoid farklılaşma Orta olarak değiştirin NEAA, % 1'l-alanyl-L-glutamine, insülin (2,5 µg/mL)</li>
	<li>Organoid farklılaşma orta yerine 3-4 istenen ayırt etme süresi noktası ulaşılana kadar günde. Sonra (bkz Bölüm 5) düzeltme organoids. Not: Zaman zaman, doku tomurcukları optik yarı saydam doku döngü yapıları olmadan sergileyebilirler. Bu ideal olmasa da, bu kortikal yapılar gelişimi etkilemiyor. Organoids organoid farklılaşma ortamda 40 güne kadar kültürlü. Bir süre organoid farklılaşma orta 1:50 ile desteklenen genişletilmiş kültür (40-100 gün) BME doku karmaşıklığı artırmak ve nöronal hayatta kalma ve olgunlaşma14,15izin veren BDNF ve GDNF ile.</li>
</ol>5. fiksasyon ve ön-tipi Organoids doğrulama
<ol><li>Doğrulama için gün 20 6 organoids toplamak. 3 organoids mRNA yalıtım ve PCR analizleri için kullanın. Ek 3 organoids PBS fiksasyon ve sıralı immunocytochemical analizleri için bir açılış 3-3.5 mm kesim 1 mL pipet ucu kullanarak içeren bir 24-şey plaka aktarın.</li>
	<li>Organoids dikkatle PBS aspirating ve taze PBS ile 5 mL pipet kullanarak yerine tarafından iki kez yıkayın. Organoids 15 dakika soğuk %4 paraformaldehyde (PFA) (pH 7,4) düzeltmek. Uyarı: İngiltere'de yılın bilinen bir insan kanserojen olduğunu dikkatli olun. Tüm iş nitril eldiven giymiş bir kimyasal duman mahallede yapılmalıdır. Bu koruyucu gözlük giymek için tavsiye edilir. Formaldehit korneanın geri dönüşümsüz hasara neden olabilir.</li>
	<li>PFA dikkatle Aspire edin ve oda sıcaklığında PBS 10 dakikadır kullanarak yıkama üç kez.</li>
	<li>PBS yerine koymak ile % 30 Sükroz eriyik (wt/vol, PBS tabanlı) ve örnekleri 4 ° C'de organoids kurutmak izin vermek için saklayın. Organoids için daha fazla alay kadar 7 gün saklanabilir.</li>
	<li>Fiksasyon sonra bir gün susuz organoids yaklaşık 1:50 10 dk organoids görselleştirme cryosectioning işlemi sırasında izin vermek için trypan mavi ekleyerek önceden leke.</li>
	<li>% 10 sukroz, % 7.5 jelatin wt/vol PBS, içeren gömme orta hazırlamak ve sıvı kadar 75 ° C sıcak.</li>
	<li>% 30 Sükroz çözüm ile gömme orta yerine ve ısıtma yüzeyi (60 ° C) 24-şey tabağa 15dk için organoids equilibrate transfer.</li>
	<li>Gömme media tabakası ile gömme kalıp alt kapak ve polimerize Buza koyun.</li>
	<li>Transfer polimerli gömme orta içeren gömmenin organoids 24-şey plaka Kalıpları ekle ek gömme orta üstte böylece organoids kaplıdır ve kalıp hızla dondurma banyo () % 100 etanol/kuru buzun içinde yer Sıcaklık -30-50 ° c arasında olmalı) şok dondurma için en az 1 dakika için.</li>
	<li>Kuru buz geçici olarak üzerinde Pensler ve onları-80 ° C'de veya doğrudan cryosectioning ile devam ya da mağaza ile kalıp yerleştirin.</li>
	<li>Cryosection organoids 20 µm kalınlık ve toplamak tutmak mikroskop slaytlardaki bölümler slaytlarda (sıralı uptake) bölümleri sipariş izlemek. Bunları-80 ° C'de saklamak veya doğrudan immunocytochemical boyama gerçekleştirmeden önce slaytlar üzerinde birkaç saat boyunca kurumaya bölümler de olanak sağlar.</li>
</ol>

<ol><li>Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+Stem+Cell+Models+of+Primate+Cortical+Development+Identify+Species-Specific+Differences+in+Progenitor+Behavior+Contributing+to+Brain+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).</li>
<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+radial+glia+in+the+outer+subventricular+zone+of+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex.</a> Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Eiraku, M., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+layered+neural+structures+in+three-dimensional+culture+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Iefremova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Organoid-Based+Model+of+Cortical+Development+Identifies+Non-Cell-Autonomous+Defects+in+Wnt+Signaling+Contributing+to+Miller-Dieker+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome.</a> Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+self-organization+and+cortical+plate+formation+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. , (2017).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+by+Cdk1+induces+Plk1-mediated+vimentin+phosphorylation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis.</a> J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).</li>
<li>Heidebrecht, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p100%3A+a+novel+proliferation-associated+nuclear+protein+specifically+restricted+to+cell+cycle+phases+S%2C+G2%2C+and+M%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M.</a> Blood. 90 (1), 226-233 (1997).</li>
<li>Kosodo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interkinetic+nuclear+migration+by+cell+cycle-coupled+active+and+passive+mechanisms+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain.</a> EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Chenn, A., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+size+by+control+of+cell+cycle+exit+in+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors.</a> Science. 297 (5580), 365-369 (2002).</li>
<li>Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fused+cerebral+organoids+model+interactions+between+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fused cerebral organoids model interactions between brain regions.</a> Nat Methods. , (2017).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Beyin organoids ilgili tür arka plan ve karmaşık 3D düzenleme hücre doku bağlamda sağladıkları gibi insan beyni geliştirme vitro eğitim için güçlü bir araç temsil eder. Bunun üzerine, onlar insan hayvan modelleri ve indirgemeci insan iki boyutlu monolayer hücre kültürü teknikleri arasında köprü. Onların uygulamaları ancak, tekrarlanabilirlik9eksikliği tarafından engel vardır. Biz büyük örnek örnek değişkenlik IPSC kendiliğinden organize kapasitesini faktörler desenlendirme için onların amenability birleştirerek üstesinden gelir bir ön-tipi organoid Protokolü geliştirdik. Özellikle, iPSCs kendi kendine organizasyon teşvik etmek ve daha sonra TGF-β/SMAD kültürler bir BMP (LDN-193189) için teşhir ederek dorsal korteks farklılaşma tanıtmak sinyal inhibe toplanan ve TGF-β reseptör inhibitörü (A83-01) tip ı. Ayrıca, Wnt yolu (IWR) posteriorization önlemek için inhibe bir bileşik uygulandı. 'İç' beyin organoid protokolleri19aksine, hangi temel kendinden montajlı oldukça heterojen beyin organoids sebebiyet veren ve büyük toplu iş iş varyasyonları sergilenmesi dış denetim (verimliliği tarafından ölçülen polarize Sinirsel ektoderm oluşumu15), burada tekrarlanarak açıklanan protokol homojen ön özel organoids insan iPSCs oluşturur.
Bu ön-tipi organoids nörogelişimsel çalışmaları, gen işlevi çalışmaları, evrimsel çalışmaları gibi uygulamaları çeşitli kullanılabilir hastalığı modelleme ve büyük olasılıkla, uyuşturucu test ve tedavi amaçlı. Protokol ise en erken insan kortikal gelişim yönlerini incelemek uygun. Örneğin vRGC davranış insan özgü yönlerini incelemek için ön-tipi organoids kullandık. Daha ayrıntılı olarak, lissencephaly, insan bir kortikal malformasyon kortikal katlama, çevre bir devamsızlık tarafından karakterize şiddetli bir formla ilişkili patofizyolojik değişiklikler ele. Fare beyni, doğal olarak lissencephalic olduğu gibi bu hastalık sadece bazı yönlerini farelerde modellenebilir. Organoid sistemi lissencephaly iPSCs için hasta kaynaklı uygularken, biz güvenilir hastalık insan özgü yönlerini özetlemek ve temel mekanizmaları belirlemek. Daha ayrıntılı olarak, hasta kaynaklı organoids asimetrik hücre bölünmesi için vRGCs simetrik bir anahtarla neden boyutunda önemli bir azalma göstermek göstermek olabilir. Bu anahtarı vRGCs Mikrotubul ağ, VZ niş mimarisini bozulma kuruluştaki değişiklikler ile ilişkili ve N-cadherin/β-catenin Engelli an harekete geçirmek için önde gelen hücre adezyon moleküllerinin ifade değişmiş Eksen10işaret. Not: vRGC bölümü modları Yönetmeliği β catenin bağımlı insan özgü β-catenin farelerde overexpression teğet korteks genişleme yol açar gibi ve daha sonra kortikal20katlanır olmak sürüldü. Böylece, bizim veri ön-tipi organoid sistemi ölçülebilir bir şekilde erken kortikal gelişim vitroinsan özgü yönlerini incelemek için umut verici bir araç temsil eden vurgulayın.
Polimerlerin organoids daha olgun nöronal fenotipleri ulaşmak için uzun süreler korumak için gelecek için büyük bir sorun olduğunu. Bu aşağıdakilerden birini veya birkaçını tarafından fark: bir biyoreaktör sistemi14organoids kültür, yüzen uygulama farklılaşma orta sinir büyüme veya nöronal hayatta kalma faktörler ile ilave15, iskele. Son olarak, beyin karmaşıklık kontrollü bir artış farklı bölgesel kimlik21,22serebral organoids ile ön-tipi organoids füzyon tarafından elde.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan ön-tipi organoid Protokolü erken kortikal yapılar içinde vitroüretimi için kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir aracı sunuyor. Son derece homojen erken kortikal dokusu ile birden çok IPSC hattında yükselişi ve güvenilir bir şekilde bireysel özel kortikal doku oluşturmak için kullanılması gereken Protokolü verir. Böylece, sistem özellikle yüksek seviyede homojenliği ve tekrarlanabilirlik gibi hastalık modelleme gerektiren uygulamalar için uygundur.

İnsan beyni açıkça en karmaşık organ biridir ve tüm insan fikri yetenekleri için sorumludur. Böylece, insan özgü beyin gelişimi daha derin bir anlayış insan bilişsel yetenekleri anlayış için kritik bir önkoşuldur. Geleneksel olarak, Transjenik hayvanlar beyin gelişimi çalışmaya model organizmalar görev yaptı. Bu modeller beyin gelişimi prensipleri temel içgörü sağladı. Şimdi ortak bir özelliği tüm memeliler içinde beyin gelişiminin kesin bir koreografi progenitör yayılması, neurogenesis ve nöronal göç olduğunu biliyoruz. Ancak, model organizmalar, kemirgenler ve insanlarda, yeni korteksimiz özellikle gibi beyni arasında önemli yapısal farklılıklar vardır. Artan bir kök ve progenitör hücrelerin çoğalması yanı sıra dış Radyal glia hücreleri (oRGCs), kemirgenler1 çok nadir bulunan nesil primat kortikal evrim katkıda için önerilen birincil mekanizmaları vardır ,2,3.
Model insan beyin korteksi geliştirme yöntemleri, PSC kaynaklı telencephalic progenitör hücreler ve serebral korteks projeksiyon nöronlar nesil monolayer kültürler olarak içerir. Bunlar farklılaşma standart iletişim kuralları yeniden yürütme kortikal neurogenesis4klişeleşmiş zamansal sırasını gibi insan kortikal geliştirme bazı yönlerini. Organogenesis kayma desenlendirme ve morfogenetik gibi gelişimsel süreçleri Rekapitülasyon gelince onlar, ancak, yetersiz kalmaktadır. 3D organoid kültürler için kök hücre biyolojisi daha yeni gelişmeler vitro insan organogenesis araştırma devrim PSC'ler yol açtı. Organotypic yapıları kendi kendine organize etmek PSC'ler kapasitesini kullanan, organların böbrek, bağırsak, göz ve beyin de dahil olmak üzere önemli yapısal ve işlevsel özellikleri yansıtan çeşitli organoids kurulan5olmuştur. Böyle organoids birlikte gruplamak ve dağınık şekilde gelişen organlar vivo içinde5,-6çok benzer düzenlemek birden fazla organ özgü hücresel alt türlerinden birini içerir. Buna ek olarak, hücre kompozisyon, lineage ilişki ve gen ağ çalışmaları tek hücreli RNA sıralama kullanarak insan beyin organoids sadakatle gen ifade programları gibi insan cenin yeni korteksimiz gelişiminin önemli yönü özetlemek ortaya 7 , 8. defa geniş uygulama engelledi, önemli bir dezavantajı olduğunu, ancak, büyük toplu iş toplu iş varyasyonları ve organoid organoid heterojenlik9.
Burada, bir basit ve standart ön-tipi organoid kültür sistemi için detaylı bir protokol sağlar. Anahtar özellik bu sistemin bu PSC kaynaklı organoids neredeyse özel dorsal telencephalic kimlik verimli ve tekrarlanarak oluşturur olduğunu. Protokol yöntemleri bizim son Hücre raporları kağıt10içinde kullanılan temel alır. İPSCs kendi kendine organizasyon kapasitesini kortikal neuroepithelium seçici indüksiyon ile birleştirir ve homojen erken dorsal telencephalic doku kültürleri 3 hafta içinde. sağlam oluşturabilir Daha önce raporlanmış SMAD sinyal ve PSC farklılaşma birlikte ön nöroektodermal lineage11,12 doğru katıştırma, hangi matrisiyle kılavuzları Wnt inhibisyon stratejisi Protokolü oluşturur büyük ve sürekli neuroepithelial yapıları13oluşumu teşvik etmektedir. Bağımsız başına birkaç klonlar ile çeşitli IPSC satırlarındaki açıklanan yöntemi başarıyla kullanmıştır. Biz bu sistemi tekrarlanabilirlik ve homojenliği hastalığı modelleme gibi büyük öneme sahip olan aşağı akım uygulamaları için uygun olduğunu gösterdi. Hastalarda şiddetli bir kortikal malformasyon elde iPSCs için iletişim kuralı uygulamak zaman hastalık vitro patolojik işaretlerinden özetlemek ve fenotipik için önde gelen yeni moleküler mekanizmalar belirlemek için başardık 10değiştirir. Açıklanan organoid Protokolü indirgemeci kortikal monolayer PSC elde edilen kültür ve in vivo çalışmalar arasındaki boşluğu kapatmak için kullanılması gereken ve bu erken benzetimini yapmak için bir güvenilir ve istikrarlı hücre tabanlı modeli sistemi temsil öneririz Sağlık ve hastalık insan vücudu dışında insan kortikal geliştirme.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>StemGent</td><td>130-106-274</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>1 ila 100</td></tr><tr><td>Bodrum membran özütü (örneğin Geltrex)</td><td>Gibco</td><td>A14132-02</td><td></td></tr><tr><td>Siklik adenozin monofosfat (cAMP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>0.15 ve mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Hücre ayrışma reaktifi (TrypLE Express)</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Sayma odası, örneğin Fuchs-Rosenthal</td>, <td>Karl Hecht</td><td>40449001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoz</td>, <td>Carl Roth</td>, <td>HN06.3</td><td>0.2 mg/mL</td></tr>, <tr><td>DMEM-F12, L-Glutamin</td>, <td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kalıpları (Tissue-Tek Cryomold)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>0.5 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td>10 ug / mL</td></tr><tr><td>WNT yanıtı inhibitörü (IWR-1)</td> <td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>BML-WN103-0005</td><td>10 ug / mL</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td>2.5 ve mikro; Tek katmanlı kültürler için g/mL</td></tr><tr><td>IPSC ortamı (Pluripro)</td><td>Hücre Yönlendirme Sistemleri</td><td>MK01</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamin (GlutaMax)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Düşük yapışma 6 cm plakalar</td><td>Labomedic</td><td>2081646L</td><td></td></tr><tr><td>Düşük yapışma 10 cm plakalar</td><td>Labomedic</td><td>2081646O</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-171</td><td>180 nM N2</td></tr><tr><td>Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>1 ila 200</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td>%0.50</td></tr> <tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>%4.00</td></tr> <tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Plastik parafin filmi (Parafilm)</td><td>MARKA: GMBH + CO KG</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632</td><td>Hücre Yönlendirme Sistemleri</td><td>SM02-100</td><td>5 & M veya 50 &mikro; M</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler 15 mL</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>734-0451&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları, örneğin Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü 6 oyuklu plaka</td><td>Falcon</td><td>734-0019</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü 24 kuyulu plaka</td><td>Falcon</td><td>734-0949</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavi leke</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra düşük bağlayıcı 96 kuyulu lipidür kaplama plakası A-U96</td><td>Amsbio</td><td>AMS.51011610</td><td></td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>Covance</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Otx2 R</td><td>& D Sistemleri</td><td>ab9566</td><td></td></tr><tr><td>Emx1</td><td>Sigma</td><td>HPA006421</td><td></td></tr><tr><td>N-kaderin</td><td>BD</td><td>610921</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Life Tech</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>P-Vimentin</td><td>Biozol</td><td>D076-3</td><td></td></tr><tr><td>Tpx2</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB500-179</td><td></td></tr><tr><td>Asetillenmiş &alfa;-tubulin&nbsp;</td><td>NEB / CS</td><td>5335</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti ms</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti rb</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anti ms</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anti rb</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr></tbody></table>

standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin organoids insan nesil pluripotent kök hücreler indüklenen

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan korteks son derece genişletilir ve biliş gibi yüksek beyin fonksiyonu sağlayan belirli işlevsel alanları ile karmaşık bir yapı sergiler. İnsan Beyin korteksi geliştirme eğitim çabaları model sistemleri kullanılabilirlik tarafından sınırlı sahip. Kemirgen çalışmaları sonuçlarından insan sistemi için çeviri türler farklılıklar tarafından kısıtlanır ve insan birincil dokular üzerinde çalışmalar etik kaygılar yanı sıra doku kullanılabilirlik eksikliği tarafından engel vardır. İnsan pluripotent kök hücre (PSC) teknolojisinde son geliştirme bir belirli ölçüde insan özgü beyin geliştirme vitroiçin taklit üç boyutlu (3D) kendi kendini düzenleyen organotypic kültür sistemleri, nesil içerir. Şu anda, çeşitli protokoller için tüm beyin ya da beyin bölgesi belirli organoids nesil mevcuttur. Homojen ve tekrarlanabilir ön türü organoids nesil PSC (IPSC), biz daha önce kurulan indüklenen ve burada, açıklamak için yöntem PSC içsel yeteneği güdümlü farklılaşma doğru kendi kendine organize şekilde birleştirir anterior nöroektodermal soy ve sürekli neuroepithelium oluşumunu desteklemek için gömme matris. Daha ayrıntılı olarak, bu iletişim kuralını içerir: (1) IPSC toplamları IPSC kolonileri dönüşüm Konfluent monolayer kültürüne; de dahil olmak üzere, nesil (2) ön neuroectoderm indüksiyon; (3 nöroektodermal agrega bir matris iskele katıştırma; (4) ön-tipi organoids nöroektodermal toplamları üzerinden üretimi; ve (5) fiksasyon ve doğrulanmasını ön-türü organoids. Bu nedenle, bu iletişim kuralı standart ve tekrarlanabilir IPSC kaynaklı kortikal doku yapıları vitroüretimi için kolayca uygulanabilir bir sistem sağlar.

Burada tipik olarak açıklanan standart ön-türü organoid Protokolü neredeyse sadece dorsal kortikal kimlik kültürleri son derece homojen organoid insan iPSCs ekimi ( şekil 1 ' de özetlenen Protokolü 20 gün içinde oluşturur A). bu tanımlanan protokolü, saat süresince çeşitli kalite kontrol adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir burada olarak: '(farklılaşma süreci devam) git' ve 'No' (suboptimal kültürler, tavsiye edilir toplu işlem sona erdirme) (Resim 1 ). İyi resimler ve notlar alarak her kalite kontrol adım belgelemek için önerilir.
Ön-tipi organoids üreten ilk kritik adım yüksek kaliteli IPSC kültürleri ile başlamaktır. İPSCs farklılaştırılmış hücrelerin büyük kesir içermeyen önemlidir. Sadece mevcut IPSC kültürler (1B, C rakamlar) başlangıç nüfus farklılaşmamış hücreleri homojen bir monolayer olarak kullanın. Buna ek olarak, IPSC toplama için belli bir hücre numarası ile başlamak çok önemlidir. 2 günde IPSC toplamları ilk detaylı bir incelemesi gerçekleştirilmelidir. Düzensiz görünen toplamları veya toplamları ile boşluklar atılır ('vazgeçtik') (rakamlar 1 d, E) olmalıdır, ancak bu aşamada agrega kompakt cep tomurcukları düzgün kenarlara ('Git') ile oluşmuş. Kalite kontrol bir adım Protokolü'nün 10 gün yapılmalıdır. Zaman bu noktada, hücre toplamları pürüzsüz ve optik yarı saydam doku Dış yüzeyde suboptimal sinirsel indüksiyon böyle dokusu yokluğu gösterir, ancak indüksiyon neuroectoderm ('Git') temsil eden ('No') göstermelidir (rakamlar 1F, G ). Sadece yarı saydam yüzey (şekil 1F) sergi toplamları BME matris gömülü olması. Katıştırıldıktan sonra kortikal organoids hızlı bir şekilde genişleyecektir sürekli neuroepithelial döngü benzeri yapılar gelişecektir. Organoids şekil 1H, J ' ('Git') gösterildiği gibi gelişmiş polarize sinirsel ektoderm olsun 15 gün ve gün 20 kortikal indüksiyon verimliliğini inceleyerek analiz. Organoids böyle neuroepithelial tomurcukları ( 'Resim 1ben Kiçinde gösterildiği gibi No'), eleştirel gelişmiş değil bu durumda sorun giderme için gerçekleştirilen kalite kontrol adımları gözden geçirin. Ne zaman sıkı bir şekilde takip protokolü, yüksek standart organoid toplu işlemleri olacak oluşturulan (2A, B rakamlar), hangi-ecek göstermek ≥ % 90 homojenliği polarize sinirsel ektoderm oluşumu içinde ve toplu işlemler (Şekil 2C) arasında. Polarize sinirsel ektoderm oluşumu değişken verimliliği için önde gelen bir yaygın hata IPSC toplama başlangıç cep numarasını artırmaktır veya kültürler veya içeren kültürleri ile başlamak için düşük kaliteli IPSC kültürler Mikoplazma gibi kontamine hücreleri ayrıştırılan.
Oluşturulan organoids dorsal telencephalic kimlik detaylı bir doğrulama 20 gün yapılmalıdır. Bu amaçla, 3 organoids sabit ve ayirt analizleri için kullanılan gerekir. Tabakalı neuroepithelial döngüler (şekil 3A) hızlı nöral kök hücre işaretçisi Sox2 (şekil 3B, D), Pax6 ve Otx2 ön işaretleri (rakamlar 3 c, E) ve dorsal kortikal marker Emx1 (Resim 3 F). kortikal bu döngü daha fazla N-cadherin ve ZO-1 (rakamlar 3 g, H), ventrikül bölge Radyal glia hücre (vRGC) bir apikal yerelleştirme tarafından karakterize edilmektedir-apikal yapıları (Bazal tarafına yayılan Mikrotubul türetilmiş Şekil 3 ben), ve apikal için fosforile vimentin olumlu leke hücre bölünmesi bulunmaktadır (p-Vimentin, şekil 3J). Hücre ölümü organoid yapıları içinde bulunabilir. Merkez apoptosis normaldir ve kortikal doku gelişimini etkilemez. Ayrıca, 3 organoids protokol polimerlerin değerlendirmek için gen ifade analizleri tarafından kullanılmalıdır. Ön-tipi organoids ifadesi dorsal ön işaretleri (FoxG1, Otx2, Emx1), orta (FoxA2, Pax5) ifade göster ve arka beyin (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) işaretleri tespit (şekil 3K) değil.
Kalite kontrol organoids toplu halde apikal Radyal gliyal hücreler bölünme boyutunda analizleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu amaçla, biz Çift Kişilik p-Vimentin ve Tpx2 karşı antikor kullanarak boyama yapmak öneririz (şekil 3J). P-Vimentin CDK1 tarafından mitoz sırasında fosforile ve çekirdeğinde, böylece tüm çekirdeklerin Mitotik faz16işaretleme yer alır. Tpx2 Mitotik iğ ve apikal işlemler sırasında interkinetic nükleer geçiş17,18görselleştirebilirsiniz Mikrotubul ilişkili proteindir. Bu işaretçileri kullanarak, vRGC division üç yönden prensip olarak çözümlenebilir: ister division uçak hizalanmış dikey (gösteren simetrik hücre bölünmesi), yatay veya oblik ((I) ister division apikal yanında, (II) yer alır hücre asimetrik hücre bölünmesi olduğunu gösterir) apikal yüzey ve (III) olup Mikrotubul organize merkezleri oluşan normalde.
Organoids da daha fazla daha karmaşık kortikal doku organize ve tabakalı yapıları farklı. Kortikal gün 35 ± 2 organoids içinde Ventriküler bölge (VZ)-, bir iç ve dış subventricular bölgesi (SVZ) yanı sıra kortikal plaka (CP) - alan gibi yapılarından oluşur. VZ ve iç ve dış SVZ içinde vRGCs, ara ataları (IPS) ve hücreleri oRGCs hatırlatan tespit edilebilir. Buna ek olarak, bir katmanlı korteks ilk oluşumu CP-gibi bir alanda Tbr1 ve içinde Ctip2 ve üst kortikal nöronlar Satb2, ifade ifade derin kortikal nöronlar ile görülebilir yanı sıra dış bölgelerde10Reelin ifade hücrelerde.
<img alt="Kortikal organoid oluşum diyagramı, iPSC agregasyonu, nöral indüksiyon, mikroskopi sonuçları." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Resim 1 : Organoid Protokolü ve 'go' ve 'No' ölçütleri örnek şematik bakış. (A)protokol şematik bakış. CI orta: kortikal indüksiyon orta; CD: kortikal farklılaşma orta. (B-C) Görüntü bir en uygun % 90 Konfluent IPSC monolayer kültür (B) ve farklılaşma (C) sergileyen bir uygun olmayan IPSC kültür. (D-E) Bir IPSC toplam boyutu, hücre yoğunluğu ve yüzey görünümü (D) en iyi ve her iki hücre sergileyen iki 'No' hücre toplamları yedek boşluklar (E, üst toplama) ya da düzensiz (E, alt toplamak) iki gün kenarları Aşağıdaki hücre toplama. (F-G) Yarı saydam ve pürüzsüz kenarlar (F) ve optik eksik hücre toplamları sergilenmesi hücre toplamları (G) takas. Sarı çizginin ilgi alanı görselleştirme. (H-K) Sürekli neuroepithelial döngüler (H, J) ile en iyi bir organoid ve Radyal geliştirmek için başarısız bir organoid gün 15 ve gün 20, sırasıyla görüntüsü neuroectoderm (ben, K) düzenlenir. Ölçek çubukları, B-C 500 µm; D-K 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Nöral organoid büyüme evreleri ve çubuk grafik karşılaştırması; nöroepitel radyalizasyonu üzerine çalışma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Resim 2 : Homojenliği ve tekrarlanabilirlik ön-tipi organoid Protokolü'nün. (A-B) Organoids gün 15(a)ve gün 26 (B) bir toplu iş temsilcisi alan parlak görüntüler. Günde 20 organoids (C) kantitatif analiz. Dış yüzeyde bir neuroepithelium, Açık kenarlık ve Radyal hücresel mimarisi kanıtı ile optik net yüzeysel doku olarak parlak alanındaki tanınabilir görüntüleyen Organoids sayılabilir (n = IPSC satır başına 3 en az 16 organoids ile deneme). Ölçek barlar, A-B: 500 µm. hata çubukları ± SD <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="İmmün boyama ile nöral farklılaşma diyagramı; Organoid kesitlerde Sox2, Pax6, DAPI belirteçleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3 : Ön-tipi organoids doğrulama günde 20. (A-J) Immunocytochemical organoids karakterizasyonu. Organoids birden fazla neuroepithelial döngüler (A,) DAPI ile counterstained düzenlemek. Neuroepithelial döngüler express nöral kök hücre işaretçisi Sox2 içinde organize hücreleri (B, D), ön işaretleri Pax6 tabakalı (C, D) ve Otx2 (E), yanı sıra dorsal ön işaret Emx1 (F). Kortikal döngü yapıları iyi yapisan Kavşağı kemer N-cadherin (G) ve zona occludens protein 1 (ZO-1; birikimi ile en apikal yan sergiledi. H). ventrikül RGCs Mikrotubul (acetylated α-tübülin, Ac-küvet tarafından lekeli) ağları genişletmek apikal döngü yapıları (Ben) Bazal tarafında. P-vimentin (p-VIM) ifade Proliferasyona hücrelerin apikal yüzeyde yer almaktadır. Mitotik iğ Tpx2. temsilcisi daha yüksek büyütme görüntü dikey tarafından lekeli ve yatay bölümü uçak (J) sağ tarafta gösterilir. (K) RT-PCR analiz için bölgeye özgü transkripsiyon faktörleri günde 20 organoids iki bağımsız kümesi türetilmiş 2 farklı IPSC satırlarından. FB: fetal Beyin kontrolü; AB: Yetişkin Beyin kontrolü. Ölçek çubukları, A-D 200 µm; E-ben 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Epitope</td>
			<td>Seyreltme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sox2</td>
			<td>1 - 300</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax6</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1</td>
			<td>1 - 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-cadherin</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZO-1</td>
			<td>1 - 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>P-Vimentin</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tpx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetylated α-tübülin</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 ms anti</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 anti rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 ms anti</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 anti rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Antikor organoids gün 20 Kalite kontrolü için.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Astar</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 ileri</td>
			<td>tgcaggggttcttctgtgat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 ters</td>
			<td>agggtcagagcaattgacca</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 ileri</td>
			<td>ccctcccatttctgtacgttt</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 ters</td>
			<td>ctggcggctcttagagat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 ileri</td>
			<td>agacgcaggtgaaggtgtgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 ters</td>
			<td>caggcaggcaggctctcc</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 ileri</td>
			<td>ccaccaccaaccccacaaaatg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 ters</td>
			<td>tgcaacaccgtctccccaaagt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 ileri</td>
			<td>aggatgccgctgatggagtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 ters</td>
			<td>tggaggagtgaatcagcttgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 ileri</td>
			<td>tttagccgttcgcttagagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 ters</td>
			<td>cggatagctggagacaggag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 ileri</td>
			<td>ttcagcaaaatgccctctct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 ters</td>
			<td>taggccagctccacagttct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 ileri</td>
			<td>acacccgctaacaaatgagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 ters</td>
			<td>gcacgaaagatgagggagag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 ileri</td>
			<td>gaactgaggagcggactcac</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 ters</td>
			<td>ctgggatcagggagtcttca</td>
		</tr>
<tr>
<td>ileri 18s</td>
			<td>ttccttggaccggcgcaag</td>
		</tr>
<tr>
<td>18s ters</td>
			<td>gccgcatcgccggtcgg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Astar ve gen ifade profil için astar serileri.

Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Bu prosedürün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerinden yüksek derecede standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir ön beyin tipi organoidler üretmektir. Bu yöntem, yeni geliştirme NTZ'lerinin mekanizmalarını modellemek için güçlü bir araçtır. Özellikle, erken insan kortikal oluşumu ile ilgili temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin ana avantajı, bireysel organoidler ve organoid partiler arasında çok az varyasyon ile insan kortikal dokusunun standartlaştırılmış ve zaman açısından verimli bir şekilde üretilmesine izin vermesidir. Organoid teknolojisi, insan beyninin gelişimi, yapısı ve işlevi hakkında, özellikle de daha düşük türlerin beyin modellerinde bulunmayan yönler için içgörü sağlayabilir. Pluripotent kök hücre agregatları oluşturmak için, kök hücre kültürleri %70 ila 90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri ayırmak için altı kuyucuklu kültür plakasının bir kuyucuğuna 500 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin.Tek tabakalı kültür koşullarına adapte edilmiş indüklenmiş pluripotent kök hücreler, ayrışma ve agregasyon prosedürü sırasında strese bağlı hücre ölümüne daha az eğilimli oldukları için agrega oluşturmak için iyi bir hücre tipidir. 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika sonra, plakaya hafifçe vurun ve hücreleri kuyu dibinden yıkamak için iki mililitre DMEM / F-12 kullanın. Elde edilen hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücre çözeltisinin hacmini daha fazla DMEM / F-12 ortamı ile 10 mililitreye getirin.Saydıktan sonra, pluripotent kök hücre agregatı başına üçüncü hücrelere 4.5 kez 10 kez yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri, 150 mikrolitre orta konsantrasyonda 4.5 kez 10 ila üçüncü hücreler elde etmek için 50 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş uygun hacimde pluripotent kök hücre ortamında askıya alıyoruz. Daha sonra, 96 oyuklu düşük bağlantılı U-alt plakanın ayrı kuyucuklarına 150 mikrolitre hücre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.Anterior nöroektoderm indüksiyonunu izlemek için, pluripotent kök hücre agregatlarının morfolojik değişikliklerini her gün düşük büyütme altında yakından gözlemlemek için bir doku kültürü mikroskobu kullanın. Birinci gün, net sınırları olan hücre agregaları gözlenmelidir. İkinci günde, her bir oyuğun dibindeki hücre agregalarını bozmadan, ortamın yaklaşık üçte ikisini dikkatlice aspire edin ve atılan ortamı 100 mikrolitre taze pluripotent kök hücre ortamı ile değiştirin.Dört ila altı gün sonra, hücre agregaları çapa 350 ila 450 mikrometre çapa ulaştığında ve pürüzsüz kenarlar sergilediğinde, 20 agregayı beş mililitre kortikal indüksiyon ortamı içeren tek bir altı santimetre düşük bağlantı kültür plakasına aktarmak için modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Kortikal indüksiyon ortamını her üç günde bir taze ortamla değiştirin ve agregaların morfolojisini 4X hedefi altında günlük olarak izleyin. Kortikal indüksiyon ortamında dört ila beş gün sonra, hücre agregatlarının kenarları yüzeyde parlamaya başlamalı, bu da nöroektodermal farklılaşmayı göstermeli ve psödostratifiye bir epitelin radyal organizasyonu ortaya çıkmalıdır.Nöroektodermal agregaları bir matris iskelesine gömmek için, bazal membran ekstraktını iki ila üç saat boyunca buz üzerinde çözdürün. Ekstrakt çözülürken, plastik parafin filmini 16 organoid başına dört x dört santimetre kareye kesmek için steril makas kullanın ve her bir film parçasını boş bir 100 mikrolitrelik mikropipet ucu tepsisine yerleştirin. Parafin filme eldivenli bir parmak ucunuzla küçük çukurlar görünecek şekilde bastırın ve filmi %70 etanol ile temizleyin.30 dakika boyunca kapalı, steril bir biyogüvenlik kabininde UV radyasyonundan sonra, her bir hücre agregasını filmdeki bir çukura aktarmak için bir buçuk ila iki milimetre açıklığa sahip modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Tüm agregalar aktarıldığında, ortamı her çukurdan dikkatlice aspire etmek için kesilmemiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve her hücre agregasına 40 mikrolitre seyreltilmemiş bazal membran özü ekleyin. Gelişmekte olan nöroepitele zarar vereceğinden, pipet ucuna kaba manipülasyon veya aspirasyon yoluyla organoidlere zarar vermemeye dikkat edin.Agregaları her damlanın ortasına yerleştirmek için pipet ucunu kullanın ve plastik parafin film tabakasını dikkatlice 10 santimetrelik bir petri kabına aktarmak için steril forseps kullanın. Çanağı 15 ila 20 dakika inkübatöre yerleştirin. Ekstrakt katılaşırken, altı santimetrelik düşük ataşman kültür kabına beş milimetre taze kortikal indüksiyon ortamı ekleyin.Kuluçka işleminin sonunda, parafin film tabakasını ters çevirin ve her altı santimetrelik tabağa 16 polimerize damlacığı hafifçe sıkmak için steril forseps kullanın. Daha sonra agregaları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi gün, organoid kültür kaplarını, agregalar ilgilenilen farklılaşma aşamasına ulaşana kadar, günlük ışık mikroskobu izleme ile bir hücre kültürü inkübatörü içinde 14 rpm'de beş derecelik bir açıyla eğilmiş, sallanan bir hücre kültürü çalkalayıcısına aktarın.20. günde, agrega kültürlerinden altı organoid toplamak için üç ila üç buçuk mililitre açıklığa sahip modifiye edilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Organoidlerin üçünü 500 mikrolitre PBS içeren 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yerleştirin ve organoidleri yıkama başına 500 mikrolitre taze PBS ile iki kez yıkamak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. İkinci yıkamadan sonra, organoidleri 15 dakika boyunca soğuk% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından oda sıcaklığında PBS'de 10 dakikalık üç yıkama ve dört santigrat derecede% 30 sükroz çözeltisinde son bir gece dehidrasyonu yapın.Ertesi gün, kriyoseksiyon prosedürü sırasında organoidlerin görselleştirilmesine izin vermek için susuz organoidleri 10 dakika boyunca bir ila 50 Tripan Blue seyreltme ile önceden boyayın ve sakarozları taze hazırlanmış gömme ortamı ile değiştirin. Gömme ortamındaki organoidleri dengelemek için plakayı 60 derecelik bir ısıtma yastığı üzerinde 15 dakika ısıtın ve organoid başına bir gömme kalıbının altını taze gömme ortamı ile kaplayın. Gömme ortamını katılaştırmak için kalıbı buzun üzerine yerleştirin, organoidleri gömme kalıplarına aktarın ve her bir organoid kaplanana kadar yeni gömme ortamı ekleyin.Daha sonra organoidleri %100 etanol kuru buz dondurma banyosunda en az bir dakika şokla dondurun ve immünositokimyasal analiz için her organoidin 20 mikrometre kalınlığında kesitlerini elde etmek için bir kriyostat kullanın. Ön beyin tipi organoidler oluşturmak için, yalnızca başlangıç popülasyonunda farklılaşmamış hücrelerin homojen bir tek tabakası olarak ortaya çıkan IPSC kültürlerini kullanın. İkinci günde, agregalar pürüzsüz kenarlı kompakt hücre tomurcukları oluşturmuş olmalıdır.10. gün agregaları, dış yüzeyde nöroektodermin indüksiyonunu temsil eden pürüzsüz ve optik olarak pürüzsüz ve optik olarak yarı saydam doku göstermelidir. Protokol yakından takip edilirse, partiler içinde ve arasında polarize nöroektoderm oluşumunda %90'a eşit veya daha fazla homojenlik gösteren yüksek standartlaştırılmış organoid partiler üretilecektir. 20. gün organoidlerinin immünositokimyasal analizi, nöral kök hücre belirteci Sox2'yi, ön beyin belirteçleri Pax6 ve Otx2'yi ve dorsal kortikal belirteç Emx1'i eksprese eden tabakalı nöroepitelyal döngüleri ortaya çıkarır.Bu kortikal döngüler ayrıca N-kaderin ve ZO-1'in apikal lokalizasyonu, yapıların apikalinden bazal tarafına kadar uzanan ventriküler bölge radyal glial hücre türevi mikrotübül ve fosforile vimentin için pozitif boyanan apikal yerleşimli bölme hücreleri ile karakterize edilir. Apikal radyal glial hücrelerin bölünme düzlemini analiz etmek için, mitotik iğ ve interkinetik nükleer göç sırasında apikal süreçleri görselleştirmek için kullanılabilen mikrotübül ile ilişkili bir protein olan vimentin ve Tpx2 için çift boyama gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinden yüksek düzeyde standartlaştırılmış ve homojen ön beyin tipi organoidlerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bu teknik, nörodokuya özgü bir şekilde düzenlenmiş karmaşık bir 3D hücre modeli kullanarak nörogelişimsel bozuklukların insana özgü yönlerinin incelenmesini kolaylaştırır. Tekniğe hakim olduktan sonra, bu kortikal organoidler, hastalık modellemesi ve potansiyel olarak ilaç testi veya tedavisi dahil olmak üzere nörogelişimsel, evrimsel veya gen fonksiyonu çalışmaları gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

generation-standardized-reproducible-forebrain-type-cerebral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan beyni organoidleri üretmek için bir yöntemi göstermektedir. Nörosferin, diğer mikrop tabakalarının oluşumunu baskılayan bir nöroektodermal tabaka oluşturduğunu gösterir. Nöroküreler bir 3D jel matrisine gömülüdür ve nöroepitelyal tomurcuklar oluşturur. Organoid medya ile inkübe edildiğinde, bu nöroepitelyal tomurcuklar belirli beyin bölgelerine farklılaşır ve bu da olgun beyin organoidlerinin oluşumuna neden olur.

İnsan Beyni Organoidlerini Oluşturmak için İn Vitro Bir Yöntem

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) küresel beyin organoidlerine dönüşümünü göstermektedir. Spesifik inhibitörler kullanılarak, hPSC'ler, nöroektodermal koloniler oluşturan bir nöronal soya doğru farklılaşmaya yönlendirilir. Daha sonra, kolonilerin kendi kendine örgütlenmesini ve çoğalmasını teşvik eden ve sonuçta küresel beyin organoidlerinin oluşumuna yol açan özel büyüme faktörleri tanıtılır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Sferoid Üretimi

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ön beyin tipi organoidlerin oluşturulmasını ana hatlarıyla belirterek, kök hücre agregatlarından beynin korteksini taklit eden ve çeşitli nöron tiplerine farklılaşan karmaşık yapılara ilerlemeyi göstermektedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Ön Beyin Tipi Serebral Organoidlerin Üretilmesi

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Öğrenin, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden standart ön beyin organoidleri üretme yöntemini. Bu teknik, erken insan kortikal gelişimini modellemek ve nörogelişimsel bozuklukları araştırmak için güçlü bir araç sunar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Daha fazla video keşfet