Name: Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Keşfedin formalin sabitlenmiş doku örneklerini görüntüleme kütle spektrometrisi için matris destekli hazırlama yöntemini. Bu teknik, yeni başlayan araştırmacıların kendi iş akışlarını geliştirmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar bu iş onların doktora burs programı sayesinde Alzheimer hastalığı araştırma ve PKW için layık bir ark keşif hibe (DP160102063) parçası finansman için Sydney Tıp Okulu Vakfı ve Blues ve Vakfı kabul etmek istiyorum.

Dikkat: Tüm ilgili güvenlik önlemleri uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) (Örneğin, laboratuvar mont, nitril eldiven, koruyucu gözlük, vb) dahil olmak üzere bu yordamı uygularken takip edilmesi gereken
1. hazırlanması reaktifler ve ekipman
<ol><li>
Çözümler hazırlanması
	<ol>
<li>Mix Carnoy'nın sıvı 500 mL hazırlamak için % 100 etanol (alkol), kloroform ve buzul Asetik asit 6:3:1 v/v/v oranı temiz cam Schott şişede.</li>
		<li>Sıvı nitroselüloz (NC) yapmak için 40 mg/mL nihai bir konsantrasyon için nazik ajitasyon tarafından düzgün aseton içinde NC membran (western Blot yaygın olarak kullanılan) geçiyoruz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NC kaplı slaytların hazırlanması
	<ol>
<li>Kan hazırlanması için kullanılan benzer bir teknik NC hazırlamak histolojik inceleme20 için smear kullanım slayt kaplı.</li>
		<li>Bir kenarından bir iletken indiyum kalay oksit (ITO) mikroskop slaydın üzerine sıvı NC 40 µL pipet. Normal cam mikroskop slayt kullanarak, NC yüzey gerilimi altında bile ince film kaplama oluşturmak için slayt üzerinde sürükleyin.</li>
		<li>NC 20 s ve oda sıcaklığında gerekinceye kadar sonra mağaza oda sıcaklığında kurumasını sağlar. Doku korunur ve toz ücretsiz sağlanan örnekler bu koşullar altında bir belirsiz olabilir. Not: Bu yöntem hazırlık daha çok bilinen adıyla "ince film" ve NC viskozite yanı sıra kendi kendine slaytta seviyeye yüzey gerilimi eksikliğine dayanan bir üniforma kaplama üretecek. Tam kapsama yerine NC çizgiler yaratacak slaytların hazırlanması çok hızlı hareketli olduğunda alınması gereken tek bakım. Dikkat: sıvı NC çok çabuk kurur, düzgün yayıldı önce çözüm kurutma önlemek için hızlı bir şekilde çalışması için gerekli. Son derece enerjik bir bileşik olarak sıvı durumuna NC gerçekleştirirken ve yangın patlama önlemek için ateşleme kaynağı başvurmalıdır değil de özen gösterilmelidir. NC aynı zamanda kurutma ve soğuk yanıklar deri veya eldivenli elleri ile uzun süreli temas gelmek için izin Eğer neden olabilir zaman endotermik geçişler uğrar. Tüm ilişkili riskleri en aza indirmek için yalnızca küçük tutarları her anda hazırlanmalıdır (< 1 mL tavsiye edilir). Bir kez kuru oda sıcaklığında stabil. Ancak, NC de büyük miktarlarda varolduğunda patlayıcı kalabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Özel buhar odaları oluşturulması
	<ol>
<li>Kalın Bloting kağıt makas alt sığdırmak için büyük bir çift ile standart plastik petri kabına (94 mm çapında ve 3 mm kalınlığında) yarısı kesilmiş.</li>
		<li>Şehir merkezinde kağıt Petri kabına (ek şekil 1) konumunda korumak yeterli fazla bırakarak bir mikroskop slaytla aynı boyutta bir dikdörtgen şerit bırakarak kağıdı kesin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku bölümleri hazırlanması
<ol><li>
FFPE doku21.
	<ol>
<li>İstenen doku blok ve 12 µm kalınlık bir standart Bank bağlı microtome ve float Mount NC üzerine de ITO slaytları ön kaplamalı bölümü seçin.</li>
		<li>2 min için kalan parafin kaldırmak için taze Ksilen içindeki slaytları daldırın ve ikinci kez işlemi yineleyin. Not: parafin blok özellikle yaygın veya doku parafin blok karşılaştırıldığında görece küçük olduğunda, örnekleri 60 ° C'de yıkama Ksilen içinde önce çoğunluk uzak erimeye ısıtmalı olabilir.</li>
		<li>Kademeli bir çözelti serisi slaytları batış tarafından deparaffinized örnekleri yıkama: % 70 Hacmen Alkol/su, %100 alkol, Carnoy'nın sıvı, %100 alkol, ultra saf su ve % 100 alkol. Her batma süresi 30 olmalıdır s, 2 dk son gerekir Carnoy'nın sıvı hariç. Dikkat: Carnoy'nın sıvı ve Ksilen gerekir depolanabilir ve eğer inhale çok zehirli oldukları gibi bir duman başlık, kullanılan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formalin sabit dondurulmuş (FFF) doku Not: Örnekleri zaten, uygun şekilde örnek türüne göre dondurulmuş olması.<ol>
<li>Microtome 20 dk22çalışma sıcaklığı, doku bloğunu equilibrate. Not: Denge sıcaklığı doku türüne bağlıdır.</li>
		<li>12 µm ve tezcan Dağı bir microtome kullanarak doku bölümler üzerine önceden hazırlanmış bir NC ITO kaplı bölümüne kaydırın.</li>
		<li>Slaytları karanlıkta bankta bir vakum desiccator saklayın. Not: Örnekleri bu koşullar altında birkaç hafta saklanır.</li>
		<li>Kademeli bir çözelti serisi örneklerinde FFPE doku (2.1.3) belirtildiği gibi yıkayın. Not: Gerek yoktur Ksilen deparaffinisation adım için örnek gömülü değil gibi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Metilen Crosslink hidroliz
<ol><li>Top 20 mmol tris-HCl ile (pH 8.8) dolu bir plastik slayt kutusu içine örnek slaytlar (FFF veya FFPE) yükleyin. Kutuyu kapatın ve 500 mL su, alt dokunmak kutusunu izin içeren bir su banyosunda yerleştirin. Sonra 70 kPa, işletme basıncında elde edebilirsiniz bir düdüklü tencere içinde 120 ° C'de 15 dakika ısı.</li>
	<li>Slaytları Kaldır, onları soğutmak izin ve koyup 15 dakika ortam sıcaklığında kuruyuncaya kadar bırakın.</li>
</ol>4. doku sindirim
<ol><li>Hidrolize kez örnekleri 10 µL tripsin çözüm (1 mg/mL) ile pipetting 10 µL üzerine doku bölümünün kenarından çözümün tarafından ultra saf su içinde kat sonra aynı pipet ucu kullanarak, damlacık doku yüzeyin altında bütün yüzeyi boyunca sürükleyin gerilim. Not: pipet ucu ve enzim doku kenarları sınırlarının dışına yaymak üzerinde doku yüzeyi çizilmemesi önlemek.</li>
	<li>Ortam sıcaklığında kurumaya örnekleri sağlar.</li>
	<li>Kuru bir kez, daha önce inşa edilmiş buhar odası (aşağı bakacak şekilde doku) üst içinde örnekleri slayt (ek Şekil 2) her iki kenarında otoklav bandı ile bağlayın.</li>
	<li>Parmak eşit olarak ıslak gibi görünüyor kadar % 100 Asetonitril ve 50 mM amonyum bikarbonat dikkatle petri kabına alt kısmında Bloting kağıt parmak üzerine 1:1 v/v karışımı içeren bir çözüm 600 µL pipet.</li>
	<li>Buhar odası üst yarısı yarım kağıt parmak ve örnek slayt sağlanması mükemmel hizalamak alt yerleştirin ve parafin film ile onun Ekvator çevresinde odası mühür.</li>
	<li>Örnek gece tam sindirim izin vermek için 37 ° C kuluçka makinesine bırakın.</li>
</ol>5. matris kaplama süblimasyon ile
<ol><li>Bir kere sindirilmiş, örnek slayt bir 5 haneli microanalytical denge üzerinde tartın.</li>
	<li>Slayt süblimasyon aparatı soğutma parmak üzerine monte ve buhar odası (ek şekil 3) açıklandığı gibi aynı şekilde bakır bant ile sabitleyin. Not: Slayt eşit olarak soğutma finger ile temas sağlamak için bir katman bakır bant yüzey seviyeye soğutma parmak dibinde yer alıyor. Bu slayt eşit olan matris bile birikimi neden soğutmalı sağlar.</li>
	<li>α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) matris 300 mg odası ve yayılmasını eşit matris kristaller ince bir tabaka oluşturmak için alt cam petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Süblimatör montaj ve tamamlayan bir at nalı kelepçe ile güvenli. Birleştirilmiş birim 15-20 cm bir imbik stand bağlı metal halka yerleştirerek 220 ° C'de ısıtılmış bir kum Hamamı yukarıda askıya alma.</li>
	<li>Odası vakum kaynağına bağlanmak, vakum meşgul ve 5 min için ~ 25 mTorr aşağı stabilize etmek sağlar.</li>
	<li>Soğutma parmak buz ile üst paketi ve 50 mL su ekleyin. Aparatı devam etmeden önce başka bir 5 min için yerleşmek izin verir.</li>
	<li>Odası kum, kum tamamen odası, alt bağlantı kurduğunda sağlanması yüzeyine daha düşük ve 0,22 mg/cm2 ideal bir kaplama oluşturmak 45 dk için bırakın Dikkat: cam, yüksek vakum aparatı, herhangi bir hasar olarak işleme tahliye ederken, felaket hatası cam odasının içinde yol açabilir zaman özen gösterilmelidir.</li>
	<li>45 dk sonra metal halka yükselterek kum banyodan odası kaldırmak ve odası delik. Not: bir kez Bacalı odası, slayt kaldırılmalıdır çok hızlı su hava dondurucu parmak ve örnek slayt üzerinde yoğunlaşmaya başlar.</li>
	<li>Slayt kaldırın ve tartmak istediğiniz kaplama elde emin olmak için. Not: Eğer yetersiz kaplama elde elde istenen Kaplama kalınlığı kadar sadece süblimasyon slayt için işlemi yineleyin.</li>
</ol>6. Rekristalizasyon
<ol><li>Bir kez yüceltilmiş, daha önce inşa edilmiş buhar odası üst içinde örnek slayt (aşağı bakacak şekilde açıklanan önceki doku) olarak bağlayın.</li>
	<li>Hatta bir kaplama emin olmak için petri kabına alt kısmında Bloting kağıda dikkatle suda % 100 Asetonitril ve % 0.1 v/v trifluoroacetic asit karışımı bir 1:1 (v/v) içeren bir çözüm 600 µL pipet.</li>
	<li>Odası montajı, Kağıt sekmesini ve mikroskop slayt sağlanması mükemmel hizalamak ve 37 ° C kuluçka 1 h için bırakın. Dikkat: odası mühür değil. Not: recrystallized sonra normalde sarı ton matrisin beyaz için değiştirmek, daha az parlak bak ve çok düz gözükmek. Bu o Rekristalizasyon doğru sahne aldı gösterir.</li>
	<li>Örnek şimdi analiz için hazırdır.</li>
</ol>7. araçları
<ol><li>Dijital bir görüntü oluşturmak için bir düz Yataklı tarayıcı içinde slayt tarama.</li>
	<li>Örnek Kütle Spektrometre yük ve ardından uygun yazılım platformu kullanarak çözümleyebilirsiniz.</li>
	<li>Pozitif iyon reflektron modunda 750-3.500 Da, istenen sonuca uygulanabilir bir nokta çözünürlük ile kitlesel bir dizi örnekleri analiz. Çoğu durumda, 20-50 µm raster genişliği yeterli, kullanılan15ancak 10 µm küçük olabilir. Dikkat: Maldı UV lazerler iyonizan radyasyon kaynağıdır ve doğrudan görülmemelidir. Lazer aleti işlem öncesinde koruyucu içinde yer alıyor olun.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Biological+Samples%3A+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-Ion+Mobility+Mass+Spectrometry+of+Lipids+in+Negative+Ion+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+methods+%3A+advancing+methods+and+applications%22%5BJournal%5D)">MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode.</a> Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-instrument-based+method+for+the+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+spinal+cord+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry+profiling+of+N-glycans+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+clinical+tissue+blocks+and+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays.</a> PLoS One. 9 (9), 10655(2014).</li>
<li>Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+high+resolution+in+mass+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space.</a> Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+statistical+data+analysis+and+current+computational+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11(2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).</li>
<li>O'Rourke, M., Padula, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5695">The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis.</a> Protocol Exchange. , (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+of+visual+data+representation+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry.</a> Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Casadonte, R., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).</li>
<li>Ong, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Identification+of+Peptides+Associated+with+Cephalic+Ganglia+Regeneration+in+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea.</a> J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-smear+showing+Experimental+Infection+with+Herpetomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas.</a> Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55(1925).</li>
<li>Gorrie, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+OEC-derived+cell+transplants+in+rodent+spinal+cord+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury.</a> Brain Res. 1337, 8-20 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Tissue+Derivatization+via+Electrospray+Deposition+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Endogenous+Fatty+Acids+in+Rat+Brain+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues.</a> Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+NIMS+and+MALDI+platforms+for+neuropeptide+and+lipid+mass+spectrometric+imaging+in+C.+borealis+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue.</a> Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+pressure+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+tissues+and+cells+at+1.4-mum+lateral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution.</a> Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometric+imaging+of+biological+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections.</a> Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).</li>
<li>Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+gallotannins+and+monoterpene+glucosides+in+the+root+of+Paeonia+lactiflora%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora.</a> Sci Rep. 6, 36074(2016).</li>
<li>Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+biomolecular+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of biomolecular information.</a> Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).</li>
<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışması veya ifşa etmek ticari faiz yazarlar var

Bu protokol analitler delocalization ortadan kaldırılması sırasında üretimi ionizable moleküler türlerin en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. En önemli faktörler örnek sindirerek ya da süblimasyon24sonra recrystallizing matris, uygularken aynı geçersiz kılma kuralı kullanarak içerir; Yani, bu buharı, hatta bir birikimi matris veya aksi durumda, oluşturulan saklanır ve gereken. Rekristalizasyon ve sindirim, eşit altında örnek için solvent yıkama pipetting başka bir yerde daha fazla solvent b...

Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme yirmi yılda1,2biomolecules de dahil olmak üzere bir dizi analiz, bir görüntü dayalı teknik olarak istihdam: lipidler3, peptidler2 ,4, proteinler2,5, metabolitleri6,7, N-glukanlardir8ve tedavi uyuşturucu9,10gibi sentetik moleküller. Bu teknik yardımcı programı gösteren yayınlar sayısı önemli ölçüde son on yılda6,11,12,13üzerinde büyüdü. Bazı moleküllerin, lipitler, onlar kolayca onların kimyasal yapısı nedeniyle iyonize ve böylece küçük önceden hazırlık3istemek yolu ile maldı MSI, analiz etmek nispeten kolaydır. Ancak, peptidler gibi daha zor hedefler için kapsamlı ve genellikle karmaşık14etkili bu moleküllerin iyonize için gereken adımlar vardır. Şu anda bu adrese amacı veya doku bu benzersiz görsel tekniği15için hazırlamak için istihdam edilmektedir metodolojileri tekrarlanabilirlik göstermek çok az yayın vardır. Bu nedenle, biz gözlemler derlenmiş ve en iyi duruma getirmeleri uygulanan tek bir, uygulanması kolay, küçük hiçbir değişiklik, peptidler bir formaldehit üzerinden analizi için gerekli metodoloji çapraz bağlı doku kaynak14.
Bu makale, algılama ve peptidler, formalin sabit dondurulmuş (FFF) ve parafin gömülü (FFPE) doku bölümleri formalin sabit üretilen kayma eşleştirme için doğrulanmış, düşük maliyetli tekrarlanabilir metodoloji anlatmıştık. Bu metodoloji gerektirmez veya üzerinde herhangi bir özel araçları3kullanmaz. Özellikle, özel numune hazırlama peptidler analiz etmek gerekli birçok yönlerini ele; adımları antijen alma16 ve matris kaplama gibi. Bizim iletişim kuralı da ucuz ekipmanları ve Kimyasalları, böylece bu metodoloji aksi takdirde diğer robot aparatı17göze mümkün olacaktır bir toplumun erişilebilir hale getirme kullanır.
Bir elle numune hazırlama yöntemi geliştirmek arkasındaki mantık iki kat: Öncelikle, bir Süblimatör kullanımı ~ 1 µm uzunluğu18, bir şey daha yaygın püskürtme ile ulaşılmaz olan matris kristalleri ile tutarlı ve homojen bir kaplama oluşturur teknikleri. İkinci olarak, maliyeti nispeten küçük kurmak: özel aparat toplam maliyeti oldu < 1500 $ AUD. Biz maliyet etkinliği açısından dahil hiçbir robot makine olduğunda örnek başına fiyat çok daha ucuz olduğunu unutmayın. Süblimasyon kullanımı daha önce ancak, en iyi bizim bildiğim için bu süreci tanımlamak ve hazırlık örnek adım adım metodolojileri değil rapor ne de literatürde açıklanan bildirilmiştir.
Bu iletişim kuralı bir maldı Kütle Spektrometre erişiminiz var demektir ve faiz19bir biyo-molekül ile ilgili olarak mekansal bilgi üreten niyet kimsin araştırmacılar yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Özünde, maldı MSI histolojik bu eleme bir çeşit antikor üzerinde dayanmaz veya2lekeleri var.

<table><tbody><tr><td>Cryo Microtome</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Doku hazırlığı ve kesiti için.</td></tr><tr><td>İndiyum Kalay Oksit Mikroskobu slaytlar</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Doku hazırlığı ve kesiti için.</td></tr><tr><td>Coplin Kavanozları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Doku hazırlığı ve kesiti için.</td></tr><tr><td>Düdüklü Tencere</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Doku hazırlığı ve kesiti için.</td></tr><tr><td>Süblimatör</td><td>Kimyasal Cam</td><td>NA</td><td>Süblimasyon prosedürü için. Tasarım olarak CG-3038'e benzer, ancak özel olarak üretildi&nbsp;</td></tr><tr><td>Kum banyosu</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Süblimasyon prosedürü için. İnce dereceli nehir kumu, katlanmış alüminyum folyoda tutulur, dışarıdan temin edilir, belirli bir şirketten değil,</td></tr><tr><td>Cam Petri Kabı</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165100</td><td>Süblimasyon prosedürü için.</td></tr><tr><td>Süblimasyon</td> prosedürü için Vakum Pompası <td>NA</td><td>NA</td><td>. Eski bir kütle spektrometresinden yedek parça olarak temin edilmiştir.</td></tr><tr><td>Süblimasyon prosedürü için</td> <td>soğuk tuzak</td><td>Kimyasal Cam</td><td>CG-4510-02</td>.</tr><tr><td>Sıcak Tabak</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>Süblimasyon prosedürü için.</td></tr><tr><td>Süblimasyon prosedürü için</td> <td>plastik petri kabı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z717223</td>.</tr><tr><td>37 & derece; C inkübatörü</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Süblimasyon prosedürü için. Uygulanamaz, kuvöz steril değildir ve 30 yaşın üzerindedir.</td></tr><tr><td>Kurutma kağıdı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Süblimasyon prosedürü için.</td></tr><tr><td>Nitroselüloz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Slaytların yıkanması için.</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Slaytların yıkanması için.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>Slaytların yıkanması için.</td></tr><tr><td>% 100 EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Slaytların yıkanması için.</td></tr><tr><td>% 70 EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Slaytların yıkanması için. % 95 stok etanolden laboratuvarda üretilmiştir ve nbsp;</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Slaytların yıkanması için.</td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Slaytların yıkanması için.</td></tr><tr>Proteolitik bölünme için <td>Tris HCL pH 8.8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>. 1M'ye kadar yapılan toz ve ardından %32 HCl ila PH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q Ultra Saf Su</td><td>ile dengeleme Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Proteolitik bölünme için. Proteolitik bölünme için sartorious su arıtma sistemi</td></tr><tr><td>Amonyum Birkarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td> ile evde gerçekleştirilen <td>arıtma.</td></tr><tr><td>Proteolitik bölünme için</td> <td>Tripsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td>.</tr><tr>Yeniden <td>kristalleştirme için</td> <td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td>.</tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Yeniden kristalleşme için.</td></tr><tr><td>Trifloroasetik Asit (TFA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Yeniden kristalleşme için.</td></tr></tbody></table>

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Biomolecules N-glukanlardir için bir ana bilgisayardan uyuşturucu ve lipidler bu teknik analiz eder bu yana matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kullanımı, kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme hızlı bir şekilde, genişledi. Çeşitli örnek hazırlama teknikleri mevcut olmasına rağmen peptidler doku korunmuş formaldehit üzerinden tespit bu tür kitle spektrometrik analizi için en zor sorunlardan biri kalır. Bu nedenle, biz oluşturulan ve ionizable peptidler en fazla alabilme örnek içinde yer alan uzamsal bilgileri korur sağlam bir metodoloji en iyi duruma getirilmiş. Biz de bu maliyet etkin ve basit bir şekilde elde etmek böylece otomatik araçları kullanarak bağlandığınızda oluşabilir potansiyel önyargı veya hazırlık hata ortadan kaldırarak nişan. Sonuçta bir tekrarlanabilir ve ucuz iletişim kuralıdır.

Doğru izlediyseniz, bu protokol açıkça olmadan herhangi bir çizik veya diğer deformasyonlar (şekil 1) dokusunun brüt Morfoloji temsil görüntüleri üretir. Doğru gerçekleştirilen numune hazırlama için ideal doğrulama olduğunu molekül olarak değiştirerek farklı fiziksel yapıları birbirinden ayırt yeteneği (Şekil 2) izlendi.
Örnekleri yanlış hazırlanan varsa belirlemek için...

Bu iletişim kuralı için görüntüleme kütle spektrometresi mukadder doku sabit formalin süblimasyon tabanlı hazırlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem açıklanır.

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Bu prosedürün genel amacı, peptit kütle spektrometresi görüntülemesi için bir doku örneğini tekrarlanabilir şekilde hazırlamaktır. Bu yöntem, acemi kütle spektrometresi kullanıcılarının uzun ampirik belirlemelerden geçmeden kendi görüntüleme kütle spektrometrisi iş akışlarını geliştirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olması, uygulanmasının basit olması ve uygun maliyetli metodolojiler kullanmasıdır.Nitroselüloz kaplı slaytları hazırlamak için, iletken indiyum kalay oksit mikroskobu slaytının bir kenarına 40 mikrolitre sıvı nitroselüloz pipetleyin. Normal bir cam mikroskop lamı kullanarak, eşit bir ince film kaplama oluşturmak için nitroselülozu yüzey gerilimi altında slayt boyunca sürükleyin. Nitroselülozun oda sıcaklığında 20 saniye kurumasını bekleyin ve ardından oda sıcaklığında ihtiyaç duyulana kadar saklayın.Ardından, standart bir plastik petri kabının alt yarısına sığacak kadar büyük bir parça kalın kurutma kağıdı keserek özel buhar odaları oluşturun. Kağıdı, ortada mikroskop lamıyla aynı boyutta dikdörtgen bir şerit bırakacak şekilde kesin. Kağıdın petri kabındaki konumunu koruması için yeterince fazla bırakın.FFPE dokusu için,

optimal-preparation-formalin-fixed-samples-for-peptide-based-matrix

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Arşiv formalin sabit ve (FFPE) gömülü parafin klinik numuneleri hastalıkların araştırılması için değerli bir malzemedir. Burada microdissected FFPE doku derinlemesine proteomik analizini sağlayan bir örnek hazırlama iş akışını göstermektedir.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) daha küçük moleküllerin doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir; üzerinde endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için DT kullanımı için protokoller Bir ultra çözünürlüklü kuadrupol-FTICR alet üzerinde pozitif iyon MALDI-MS tarafından doku kesitlerinin yüzey burada verilmektedir.

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre çizgileri, 3D hücre kültürleri, biyolojik araştırmaları için değerli bir model olarak yetiştirilebilir. Bu protokol numune hazırlama platformu gelişmeler de dahil olmak üzere 3D hücre kültürleri, kütle spektrometresi görüntüleme açıklanır. Bu protokolün amacı kütle spektrometresi görüntüleme analizi için 3D hücre kültürleri hazırlamak için kullanıcılardan etmektir.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Karbonhidrat iyon sinyalleri maldı kütle spektrometresi reform kristal yapılar tarafından örnek hazırlama sürecinde güçlendirmeye yönelik bir protokol gösterilmiştir.

Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Proteom karakterizasyonu oküler mikrovasküler yatak birçok oküler patolojiler insanlarda derinlemesine anlayış için çok önemli. Bu çalışmada protein çıkarma ve küçük kan damarlarının kütle spektrometresi esaslı proteomik analizleri kapları modeli olarak domuz kısa arka silier arterler istihdam üzerinden numune hazırlama için etkili, hızlı ve güçlü bir yöntem gösterir.

Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Bu protokol, MALDI-IMS analizi için düşük su içeriğine sahip sert tohum numune kesitlerinin hazırlanması, analitlerin orijinal dağılımının ve bolluğunun korunması ve yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük sağlanması hakkında ayrıntılı rehberliği tanımlamayı amaçlamıştır.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon-Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi için Sert Palmiye Tohumlarının Hazırlanması

Keşfedin formalin sabitlenmiş doku örneklerini görüntüleme kütle spektrometrisi için matris destekli hazırlama yöntemini. Bu teknik, yeni başlayan araştırmacıların kendi iş akışlarını geliştirmesini sağlar.

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli (Video) | JoVE Journal

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

Daha fazla video keşfet