Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

Bu prosedürün genel amacı, peptit kütle spektrometresi görüntülemesi için bir doku örneğini tekrarlanabilir şekilde hazırlamaktır. Bu yöntem, acemi kütle spektrometresi kullanıcılarının uzun ampirik belirlemelerden geçmeden kendi görüntüleme kütle spektrometrisi iş akışlarını geliştirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olması, uygulanmasının basit olması ve uygun maliyetli metodolojiler kullanmasıdır.

Nitroselüloz kaplı slaytları hazırlamak için, iletken indiyum kalay oksit mikroskobu slaytının bir kenarına 40 mikrolitre sıvı nitroselüloz pipetleyin. Normal bir cam mikroskop lamı kullanarak, eşit bir ince film kaplama oluşturmak için nitroselülozu yüzey gerilimi altında slayt boyunca sürükleyin. Nitroselülozun oda sıcaklığında 20 saniye kurumasını bekleyin ve ardından oda sıcaklığında ihtiyaç duyulana kadar saklayın.

Ardından, standart bir plastik petri kabının alt yarısına sığacak kadar büyük bir parça kalın kurutma kağıdı keserek özel buhar odaları oluşturun. Kağıdı, ortada mikroskop lamıyla aynı boyutta dikdörtgen bir şerit bırakacak şekilde kesin. Kağıdın petri kabındaki konumunu koruması için yeterince fazla bırakın.

FFPE dokusu için, bölümleri metin protokolünde açıklandığı gibi nitroselüloz önceden kaplanmış ITO kızaklarının üzerine şamandırayla monte edin. Kalan parafini iki dakika boyunca çıkarmak için slaytları taze ksilene batırın. Deparafinize edilmiş numuneleri, slaytları hacim için %70 hacim etanol su çözeltisi ve ardından %100 etanolden oluşan kademeli bir çözücü serisine 30 saniye daldırarak yıkayın.

Ardından, slaytları iki dakika boyunca Carnoy'un sıvısına batırın. Son olarak, slaytları 30 saniye boyunca tekrar %100 etanol, ultra saf su ve %100 etanol serisine daldırın. Örnek slaytları, üstüne 20 milimolar tris HCO ile doldurulmuş plastik bir slayt kutusuna yükleyin.

Kutuyu kapatın ve 500 mililitre su içeren bir su banyosuna yerleştirin ve kutunun banyonun dibine temas etmesine izin verin. Daha sonra kutuyu 70 kilopaskal çalışma basıncına ulaşabilen bir düdüklü tencerede 120 santigrat derecede 15 dakika ısıtın. Slaytları çıkarın, soğumalarını bekleyin ve ortam sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın.

Hidrolize edildikten sonra, önce 10 mikrolitre solüsyonu doku bölümünün kenarına pipetleyerek numuneleri ultra saf suda 10 mikrolitre tripsin solüsyonu ile kaplayın. Ardından, aynı pipet ucunu kullanarak, damlacığı yüzey gerilimi altında dokunun tüm yüzeyi boyunca sürükleyin. Numunelerin ortam sıcaklığında kurumasına izin verdikten sonra, sürgünün her iki kenarına otoklav bandı ile önceden yapılmış buhar odasının üst kısmına monte edin.

%100 asetonitril ve 50 milimolar amonyum bikarbonat hacim karışımı için bire bir hacim içeren bir çözeltinin 600 mikrolitresini, parmak eşit şekilde ıslak görünene kadar petri kabının alt kısmındaki kurutma kağıdı parmağına dikkatlice pipetleyin. Pipetleme kritik derecede önemlidir çünkü yanlış pipetleme, matrisinizin ve yüzey analoidlerinizin delokalizasyonuna neden olur ve bu da numunenizde bulunan uzamsal bilgileri yok eder. Buhar haznesinin üst yarısını alt yarıya yerleştirin, kağıt parmağının ve numune slaytının mükemmel bir şekilde hizalandığından emin olun ve hazneyi ekvatorunun etrafını parafin film ile kapatın.

Tam sindirime izin vermek için numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde bırakın. Sindirildikten sonra, numune slaytını beş basamaklı bir mikroanalitik terazinin üzerinde bırakın. Sürgüyü süblimasyon aparatının soğutma parmağına monte edin ve buhar odası için tarif edildiği gibi bakır bantla sabitleyin.

300 miligram CHCA matrisini odanın altındaki bir cam petri kabına yerleştirin ve ince bir matris kristalleri tabakası oluşturmak için eşit şekilde yayın. Süblimatörü monte edin. Ve iki yarıyı at nalı kelepçesi ile sabitleyin.

Monte edilmiş üniteyi, bir imbik standına bağlı metal bir halkaya yerleştirerek, önceden 220 santigrat dereceye ısıtılmış bir kum banyosunun 15 ila 20 santimetre üzerine asın. Hazneyi vakum kaynağına bağlayın, vakumu devreye sokun ve beş dakika boyunca yaklaşık 25 militorr'a kadar stabilize olmasına izin verin. Soğutma parmağını buzla üstüne koyun ve 50 mililitre su ekleyin.

Devam etmeden önce cihazın beş dakika daha oturmasına izin verin. Hazneyi standın yüzeyine indirin ve kumun haznenin tabanına tamamen temas ettiğinden emin olun. Santimetre kare başına 0.22 miligramlık ideal bir kaplama oluşturmak için 45 dakika bekletin.

45 dakika sonra, metal halkayı kaldırarak hazneyi kum banyosundan çıkarın ve hazneyi boşaltın. Süblimleştirildikten sonra, numune slaytını daha önce olduğu gibi önceden inşa edilmiş buhar odasının üstüne monte edin. Eşit bir kaplama sağlamak için su içinde asetonitril ve trifloroasetik asit hacim karışımı için bire bir hacim içeren bir çözeltiden 600 mikrolitreyi petri kabının alt kısmındaki kurutma kağıdına dikkatlice pipetleyin.

Ardından, kağıt tırnağının ve mikroskop slaytının mükemmel şekilde hizalandığından emin olarak hazneyi monte edin. Odayı bir saat boyunca 37 santigrat derece inkübatörde bırakın. Dijital bir görüntü oluşturmak için slaydı düz yataklı bir tarayıcıda tarayın.

Numuneyi kütle spektrometresine yükleyin ve ardından uygun yazılım platformunu kullanarak analiz edin. Son olarak, örnekleri metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Burada, 50 mikronda görüntülenen ve iyi makro yapı ve beyaz madde ile gri madde arasındaki net farkı gösteren, doğru işlenmiş bir doku örneği gösterilmektedir.

Başarılı bir şekilde karşılaştırılan numuneler, farklı doku konumlarında net bir farklılaşma gösterecektir. Burada, beyaz bölgelerle temsil edildiği gibi, beyaz madde bölgesinde 1.085'lik bir kütle-yük oranı ile temsil edilen peptidin açık bir yukarı regülasyon bölgesi vardır. Buna karşılık, yanlış hazırlanmış bu örnek, büyük ölçekli bir yerelleştirme düzeyi göstermektedir.

Üç panel boyunca mevcut olan moleküllerin desenleri, biyolojik bölgeler veya görüntülenen moleküllerin bolluğundaki farklılıklar arasında net bir tanım olmadığını açıkça göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, peptit görüntüleme analizi için kendi numunelerinizi nasıl hazırlayacağınız konusunda gerçekten iyi bir fikre sahip olmalısınız. Uygun prosedürle, bu yöntem iki gün boyunca sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir ve bir gece boyunca sindirim adımına izin verir.

Bu metodolojiyi hazırlarken, her adımda dikkatli olmak önemlidir. Dokuda meydana gelen herhangi bir fiziksel hasar, numunenizde bulunan uzamsal bilgileri yok edecektir. Kendi IMS uzay araştırmalarımıza ilk başladığımızda bu metodoloji fikrine sahiptik ve yayınlanmış başka kesin metodolojiler olmadığını fark ettik.

Küçük modifikasyonlarla, metodolojimiz proteinlerin, peptitlerin, lipitlerin ve diğer küçük moleküllerin analizine uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, görüntüleme kütle spektrometresi verileriniz için bir referans noktası elde etmek amacıyla numunenize immünofloresan ve hematoksilen ve eozin boyama gibi diğer histolojik teknikler uygulanabilir. Sıvı nitroselüloz gibi potansiyel olarak patlayıcı kimyasallarla çalışırken, doğru güvenlik prosedürlerini sürdürmek önemlidir.

Çalışma hacimlerini en aza indirmek ve atıklarınızı hemen bertaraf etmek kritik derecede önemlidir.