MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

MALDI Görüntüleme kütle spektrometresi, organizmaların, fizyolojik ve patolojik durumların göstergesi olan nispi metabolit bolluğunu ve dağılımını ölçmemize ve görselleştirmemize izin veren metabolomik alanında benzersiz bir ilerlemedir. MALDI Görüntülemenin temel avantajı, etiketlemeye ihtiyaç duymadan C2'deki metabolitleri tespit etme yeteneğidir. Prosedürü gösteren, Dr.Patricia Casita'nın laboratuvarından bir yüksek lisans öğrencisi olan Sami Sauma'ya sahibiz.

Yuki Chen ve Kelly Veerasammy, laboratuvarımdan öğrenci araştırmacılar. Hasattan sonra, dokuyu hemen sıvı bir azot, soğutulmuş, alüminyum folyo tekneye ve bir polistiren kutuya yerleştirin. Dokunun boyutuna göre dokuyu 2 ila 10 dakika dondurmak için polistiren kutusunun kapağını kapatın.

Doku yeterince donduğunda, tekneyi çıkarmak için forseps kullanın ve folyo içinde sabitlenmiş dokuyu kuru buz üzerinde kriyostata taşıyın. Dokuyu bölmeden önce, slaytlarda nefes almamaya dikkat edin. Analiz için uygun sayıda MALDI uyumlu indiyum kalay oksit kaplı cam slaytların iletkenliğini test etmek için eldiven ve dirence ayarlanmış bir volt metre kullanın.

Etiketlemeden sonra, slaytları temiz bir kağıt havlu ve eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış %70 etanolle temizlenmiş bir kriyostat üzerine yerleştirin. Doku örneğini kriyostata yerleştirin ve doku tipine göre kriyostat odasının ve numune kafasının sıcaklığını ayarlayın. Dokunun 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verdikten sonra, dokuyu aynaya monte etmek için kriyo doku gömme bileşiği kullanın.

Ve temiz bir bıçağı sahneye yerleştirin ve kilitleyin, İstenen kesme açısını elde etmek için sahnenin konumunu ve numunenin açısını ayarlayın. Ve ilgilenilen bölge ortaya çıkana kadar dokuyu bölümlere ayırın. İstenilen bölgeye ulaşıldığında, önceden soğutulmuş bir fırça kullanarak 10 ila 12 mikron kalınlığında bölümler elde edin, ancak her bir bölümü, elde edildikleri gibi her bir slaydın etiketli tarafına dikkatlice ancak hızlı bir şekilde toplayın.

Kızağa güvenli bir şekilde monte edilmesini sağlamak için bölümleri ısıtmak için kızakların altına parmağınızı yerleştirin. Bölümler 5 ila 10 saniye içinde şeffaf hale gelecek ve yaklaşık 30 ila 60 saniye sonra opak hale gelecektir. Tüm bölümler toplandığında, slaytları sürgü tutucuya yerleştirin ve kuru buz üzerinde bir desekratöre taşıyın.

Alternatif olarak, slaytlar bir vakum kutusunda taşınabilir. Slaytları kurutuculu bir dezenfektana yerleştirin ve slaytları 45 ila 60 dakika vakumla kurutun. Kuruduktan sonra, hemen kullanılmayacaksa, kızakları sürgü taşıyıcıya yerleştirin ve taşıyıcıyı nitrojenle doldurun.

Tutucuyu parafilm ile kapatın ve tutucuyu fermuarlı bir torbaya koyun. Daha sonra ilk fermuarlı torbayı, altı aya kadar eksi 80 santigrat derece saklama için kurutucu içeren ikinci etiketli bir fermuarlı torbaya yerleştirin. Dehidrasyondan sonra, doku bölümlerinin dışındaki slaytların boş alanlarına X işaretleri yerleştirmek için kalın bir nokta gümüş işaretleyici kullanın ve her gümüş X'in üzerine ikinci bir siyah X yerleştirmek için siyah bir ince nokta işaretleyici kullanın.

Numune konumunu plastik kapak üzerinde ana hatlarıyla belirtin ve slaytı ve MALDI hedefini düz yataklı bir tarayıcının yüzeyine yerleştirin. Ardından slaydı önizleyin ve istediğiniz alanı seçin. Slaytı 16 bit gri tonlamalı, inç başına 2.400 nokta şeklinde tarayın ve görüntüyü daha sonra kullanmak üzere kaydedin.

Kızaklara matris uygulamak için, valfin yükte konumlandırıldığından emin olarak otomatik matris püskürtücü ünitesini açın ve püskürtücü yazılımını başlatın. Egzoz fanının düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin ve iletişim sekmesi altında sistemin doğru şekilde iletişim kurduğunu onaylayın. Solvent pompasını inç kare başına yaklaşık 100 pound'luk bir geri basınçla dakikada 500 mikrolitrede başlatın.

Matris püskürtücüye basınçlı hava akışını başlatmak için nitrojen tankını inç kare başına 30 pound'a ayarlayın. Püskürtücünün önündeki basınç regülatörünü inç kare başına 10 pound'a ayarlayın ve püskürtücü memesi sıcaklığını istediğiniz gibi ayarlayın. Valf ve yük konumunda, döngüyü altı mililitre bir matrisle doldurmadan önce halkayı yedi mililitre% 70 metanol ile yıkamak için şırıngayı kullanın.

Tutucuya ve püskürtücüye boş bir cam sürgü yerleştirin, hareketi önlemek için her iki ucunu da bantlayın ve akış hızının ve sıcaklığın sabit olduğunu kontrol edin. Nozul sıcaklığını ayarlamak ve pompa akış hızını seçilen yönteme uyacak şekilde ayarlamak için başlat düğmesine basın. Valfi yükten püskürtmeye geçirin ve devam et'e tıklayın.

Sistemin tamamlanmasına izin verildi. Biriktirme bittiğinde, valfi spreyden yüke geçirin ve devam et'e tıklayın. Mikroskop altında matris kodlama modelini inceleyin.

İnce matris kristalinin eşit bir tabakası gözlenirse, matrisi az önce gösterildiği gibi uygun numune slaytlarına yerleştirin. Tüm kızaklar işlendiğinde, püskürtücü memesinin tıkanmasını önlemek için sistemi üreticinin talimatlarına göre temizleyin. Burada, her 100 Dalton aralığından seçilen kütle deşarj spektrumlarının MALDI MS Görüntüleme veri analizinden elde edilen çıktı görüntüleri, küçük moleküllü metabolitlerden yüksek moleküler ağırlıklı lipitlere kadar spektrumların tanımlanması için faydayı açıkça göstermektedir.

Her yol, doğum sonrası 1, 21 ve 60. günlerde toplanan üç dokuda belirli bir metabolit türünün hem uzamsal hem de spektral bilgilerini içeren saygılı, iyon ısı haritalarını gösterir. MALDI MSI metodolojisinin güçlü yönlerinden biri, gelişimsel kilometre taşlarına veya belirli anatomik yapılara kütle / yük oranı ile tanımlanan belirli türlerin özgüllüğünü ayırt etme yeteneğidir. Bu analizde, bazı metabolitlerin doğum sonrası birinci gün yenidoğanlarda veya doğum sonrası 60. gün yetişkinlerinde zenginleştirildiği veya test edilen yaşlar arasında eşit olarak dağıldığı gözlenmiştir.

Diğer moleküler türlerin gri madde, beyaz madde veya beyin omurilik sıvısı ve ventriküller açısından spesifik olarak zenginleştirildiği gözlendi. Hipoksantin, glutamik asit, N-asetil aspartik asit, araşidonik asit ve çeşitli lipitler dahil olmak üzere temsili metabolitlerin mekansal dağılımı da analiz edildi. Metabolik durumun doğruluğunu korumak için, uygun örnek diseksiyonu, saklama ve siro kesitleme, yapay metabolik değişiklikleri önlemek için çok önemlidir.

MALDI deneyinizi gerçekleştirdikten sonra, bulduğunuz metabolitlerin kimliklerini doğrulamak isteyebilirsiniz. Bu, mirko-ekstraksiyon ve sıvı kromatografi tandem MS ile elde edilebilir. MALDI MS Imaging, uzamsal çözünürlükle metabolik tabanlı sorgulamayı kolaylaştırır ve araştırmacılara metabolik verileri kantitatif ve görsel bir ortamda tespit etme fırsatı verir. Son zamanlarda nörodejeneratif bozukluklarda diyetin etkisine, bağırsak mikrobiyomu ile beyin arasındaki ilişkiye çok fazla ilgi var.

Ve bu nedenle, nörobilimde metabolizma çalışmasının, nöro gelişimden nörodejenerasyona kadar muazzam bir önemi olmuştur. Bağırsak-beyin etkileşiminin ana gerçeği. Ve bu bağlamda, MALDI Görüntüleme tesisi fikri, belirli bir manipülasyonun beyinde sahip olabileceği etkiyi görselleştirmek için gerçekten olağanüstü teknolojiler sağlayabilir.