Heparinized StarPEG Nanocoating ile pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği

Bu yöntem, pankreas adacık transplantasyonunda immüno-rejeksiyon, transplantasyon sonrası adacık revaskülarizasyonu ve sağkalım gibi büyük zorlukların çözülmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, benimsenmesi kolay bu yaklaşımın, pankreas adacığının hücresel manzarasını yeniden şekillendirerek canlı hücrelerin yüzey mühendisliğini mümkün kılmasıdır: greft fonksiyonunu, sağkalımı ve nihayetinde adacık transplantasyonunun terapötik etkinliğini iyileştirecektir. Bu tekniğin etkileri hücre bazlı tedavilere doğru uzanır, çünkü hücre bazlı tedavilerin terapötik sonucu da düşük hücre retansiyonu ve zayıf sağkalım ile sınırlıdır.

Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Jingyi Yang'dır. İlk olarak, 6.9 gram Heparin tartın ve bir Eppendorf tüpünde 2 mililitre buz gibi deiyonize suda çözün. Bir Eppendorf tüpünde 0,5 mililitre buz gibi soğuk deiyonize suda 0,23 gram NHS'yi çözün.

Daha sonra, 0.77 gram EDC'yi 50 mililitrelik konik bir tüpte 0.5 mililitre buz gibi soğuk deiyonize suda çözün. NHS ve EDC çözeltilerini 50 mililitrelik konik bir tüpte karıştırın. Karışık çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika beklettikten sonra, fazla EDC ve NHS'yi çıkarmak için 12.000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin.

Bunu takiben, çözeltiye 30 mililitre soğuk etanol ekleyin ve 10 dakika boyunca 12.000 RPM'de santrifüjleyin. Şimdi, 50 mililitrelik konik bir tüpe 1 mililitre %10 starPEG MI yardımı ekleyin. Daha sonra aynı 50 mililitrelik konik tüpe 0.67 mililitre% 10 Heparin NHS çözeltisi ekleyin.

Viskoz berrak bir çözelti elde etmek için karışık çözeltiyi 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Daha önce çıkarılmış 200 fare adacığını diseksiyon mikroskobu altında elle seçin ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Adacıklara 500 mikrolitre PBS ekleyin ve dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1.200 RPM'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın, 250 mikrolitre Heparin PEG çözeltisi ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Adacıkların Heparin PEG çözeltisi ile iyice karışmasını sağlamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bunu takiben, karışımı bir dakika boyunca 1.200 RPM'de santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı çıkarın ve 500 mikrolitre PBS ekleyin. İyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir dakika boyunca 1.200 RPM'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve adacıkları daha sonra kullanmak üzere saklayın.

Daha sonra, kaplanmış adacıklara% 10 FBS ile desteklenmiş bir ila iki mililitre RPM I 1640 ekleyin. Ve bu adacıkları yüksüz steril bir bakteri kültürü kabına aktarın. Son olarak, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında FAM-Heparin-PEG kaplı adacıkların morfolojisini ve floresan sinyallerini gözlemleyin.

Heparin-PEG nano kaplama FTIR spektrumunda HİDROKSAL gruplarına karşılık gelen karakteristik Heparin pikleri gözlenmiştir. Bu piklerin genliğindeki azalma, yıldız-PEG MI yardımcı amid grupları ile Heparin karbonal grubu arasındaki konjugasyonu temsil eder. Amid karbonal germe titreşimine karşılık gelen tepe de azaltıldı, bu da Heparin karboksilat grupları ile süksimidal seksonat ve yıldız-PEG MI yardımcı amin arasında yeterli reaksiyonu gösterdi.

Bir elektron mikroskobu verilerinin taranması, Heparin-PEG nano kaplamanın yüksek derecede birbirine bağlı gözenekli yapısını gösterir, bu da in vivo dağıtım sırasında hücre sağkalımı için uygun olabileceğini düşündürür. Yeşil floresan ile gösterilen ince bir nano kaplama tabakası, adacık hacminde veya boyutunda belirgin değişikliklere neden olmaksızın, kaplanmış adacıkların yüzeyi boyunca eşit bir şekilde biriktirildi. Heparin-PEG kaplı fare adacığı, kültürde sağlam adacık canlılığı sergiledi.

Heparin-PEG kaplı adacıklarla birlikte kültürlenen adacık endotel hücrelerinden önemli ölçüde daha ileri vasküler oluşum belirgindi, bu da uzun mikro damar benzeri yapılar ve ağ benzeri vasküler yapılarla gösterildi. Adacıklar, bir alt uyarıcı glikoz seviyesi ile desteklenmiş fizyolojik bir tuz çözeltisi ile perfüze edildiğinde, tüm tedavi gruplarında düşük bir insülin sekresyonu seviyesi gözlenmiştir. Adacıklar süper fizyolojik bir glikoz seviyesi ile uyarıldığında, insülin sekresyonunda bir artış gözlendi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, adacık canlılığını korumak için uygun şekilde yapılırsa kaplama bir dakika içinde yapılabilir.