Heparinized StarPEG Nanocoating ile pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği
23 Haziran 2018
Bu iletişim kuralı yüzey Mühendisliği pankreas adacıkları heparin dahil starPEG nanocoating nanocoating N- hydroxysuccinimide grupları ve adacık Amin grupları arasında pseudo-bioorthogonal Kimya yoluyla kullanarak elde amaçlamaktadır hücre zarı.
Bu yöntem, pankreas adacık transplantasyonunda immüno-rejeksiyon, transplantasyon sonrası adacık revaskülarizasyonu ve sağkalım gibi büyük zorlukların çözülmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, benimsenmesi kolay bu yaklaşımın, pankreas adacığının hücresel manzarasını yeniden şekillendirerek canlı hücrelerin yüzey mühendisliğini mümkün kılmasıdır: greft fonksiyonunu, sağkalımı ve nihayetinde adacık transplantasyonunun terapötik etkinliğini iyileştirecektir. Bu tekniğin etkileri hücre bazlı tedavilere doğru uzanır, çünkü hücre bazlı tedavilerin terapötik sonucu da düşük hücre retansiyonu ve zayıf sağkalım ile sınırlıdır.
Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Jingyi Yang'dır. İlk olarak, 6.9 gram Heparin tartın ve bir Eppendorf tüpünde 2 mililitre buz gibi deiyonize suda çözün. Bir Eppendorf tüpünde 0,5 mililitre buz gibi soğuk deiyonize suda 0,23 gram NHS'yi çözün.
Daha sonra, 0.77 gram EDC'yi 50 mililitrelik konik bir tüpte 0.5 mililitre buz gibi soğuk deiyonize suda çözün. NHS ve EDC çözeltilerini 50 mililitrelik konik bir tüpte karıştırın. Karışık çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika beklettikten sonra, fazla EDC ve NHS'yi çıkarmak için 12.000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin.
Bunu takiben, çözeltiye 30 mililitre soğuk etanol ekleyin ve 10 dakika boyunca 12.000 RPM'de santrifüjleyin. Şimdi, 50 mililitrelik konik bir tüpe 1 mililitre %10 starPEG MI yardımı ekleyin. Daha sonra aynı 50 mililitrelik konik tüpe 0.67 mililitre% 10 Heparin NHS çözeltisi ekleyin.
Viskoz berrak bir çözelti elde etmek için karışık çözeltiyi 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Daha önce çıkarılmış 200 fare adacığını diseksiyon mikroskobu altında elle seçin ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Adacıklara 500 mikrolitre PBS ekleyin ve dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1.200 RPM'de santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkarın, 250 mikrolitre Heparin PEG çözeltisi ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Adacıkların Heparin PEG çözeltisi ile iyice karışmasını sağlamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bunu takiben, karışımı bir dakika boyunca 1.200 RPM'de santrifüjleyin.
Ardından, süpernatanı çıkarın ve 500 mikrolitre PBS ekleyin. İyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir dakika boyunca 1.200 RPM'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve adacıkları daha sonra kullanmak üzere saklayın.
Daha sonra, kaplanmış adacıklara% 10 FBS ile desteklenmiş bir ila iki mililitre RPM I 1640 ekleyin. Ve bu adacıkları yüksüz steril bir bakteri kültürü kabına aktarın. Son olarak, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında FAM-Heparin-PEG kaplı adacıkların morfolojisini ve floresan sinyallerini gözlemleyin.
Heparin-PEG nano kaplama FTIR spektrumunda HİDROKSAL gruplarına karşılık gelen karakteristik Heparin pikleri gözlenmiştir. Bu piklerin genliğindeki azalma, yıldız-PEG MI yardımcı amid grupları ile Heparin karbonal grubu arasındaki konjugasyonu temsil eder. Amid karbonal germe titreşimine karşılık gelen tepe de azaltıldı, bu da Heparin karboksilat grupları ile süksimidal seksonat ve yıldız-PEG MI yardımcı amin arasında yeterli reaksiyonu gösterdi.
Bir elektron mikroskobu verilerinin taranması, Heparin-PEG nano kaplamanın yüksek derecede birbirine bağlı gözenekli yapısını gösterir, bu da in vivo dağıtım sırasında hücre sağkalımı için uygun olabileceğini düşündürür. Yeşil floresan ile gösterilen ince bir nano kaplama tabakası, adacık hacminde veya boyutunda belirgin değişikliklere neden olmaksızın, kaplanmış adacıkların yüzeyi boyunca eşit bir şekilde biriktirildi. Heparin-PEG kaplı fare adacığı, kültürde sağlam adacık canlılığı sergiledi.
Heparin-PEG kaplı adacıklarla birlikte kültürlenen adacık endotel hücrelerinden önemli ölçüde daha ileri vasküler oluşum belirgindi, bu da uzun mikro damar benzeri yapılar ve ağ benzeri vasküler yapılarla gösterildi. Adacıklar, bir alt uyarıcı glikoz seviyesi ile desteklenmiş fizyolojik bir tuz çözeltisi ile perfüze edildiğinde, tüm tedavi gruplarında düşük bir insülin sekresyonu seviyesi gözlenmiştir. Adacıklar süper fizyolojik bir glikoz seviyesi ile uyarıldığında, insülin sekresyonunda bir artış gözlendi.
Bir kez ustalaştıktan sonra, adacık canlılığını korumak için uygun şekilde yapılırsa kaplama bir dakika içinde yapılabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, pankreatik adalarda heparin içeren starPEG nano kaplama kullanarak yüzey mühendisliği için bir yöntem tanımlar. Bu teknik, greftin işlevselliğini ve hayatta kalmasını artırarak adacıklar naklinde sonuçları iyileştirmeyi amaçlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre tabanlı terapiler
- Nakil biyolojisi
- Yüzey mühendisliği
Arka Plan
- Pankreatik ada nakli, immün red ve düşük ada hayatta kalma gibi zorluklarla karşı karşıya.
- Adaların hücresel yapısının iyileştirilmesi, terapötik etkinliği artırabilir.
- Heparin-PEG nano kaplama bu zorluklara potansiyel bir çözüm sunar.
- Bu yöntem kolayca benimsenebilir ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir.
Çalışmanın Amacı
- Pankreatik adalarda hayatta kalmayı ve işlevselliği artıran bir kaplama tekniği geliştirmek.
- Hücre tabanlı terapilerde düşük hücre tutulumuna ilişkin sorunları ele almak.
- Hücre tabanlı terapilerin etkinliğini artırmak için heparin-PEG nano kaplamanın etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Heparin ve NHS çözeltilerinin hazırlanması.
- Nano kaplama için NHS ve EDC çözeltilerinin karıştırılması.
- Fare adallarının heparin-PEG çözeltisiyle kaplama işlemi.
- Floresan mikroskop altında ada morfolojisi ve canlılığının gözlemlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Heparin-PEG kaplı adalarda kültürde canlılık artışı gözlendi.
- Eş kültürlenen ada endotel hücrelerinde gelişmiş vasküler oluşum gözlendi.
- Kaplı adalarda insülin salgısı glikoz stimülasyonuna duyarlıydı.
- Kaplama, ada hacmini veya boyutu önemli ölçüde değiştirmedi.
Sonuçlar
- Heparin-PEG nano kaplama, ada nakil sonuçlarını iyileştirmek için umut verici bir yöntemdir.
- Bu teknik, hücre tabanlı terapilerin etkinliğini artırabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, yüzey mühendisliği gerektiren diğer hücre tiplerine kadar genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
