Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Bu yöntem, bilim adamlarının pankreas adacıklarının üretken kullanımını en üst düzeye çıkarmasına ve doğal doku mimarisindeki her bir örnek üzerinde birden fazla sonucu değerlendirmesine yardımcı olabilir. Bu yeni gömme yönteminin ana avantajı, adacıkların iyi tanımlanmış bir alana eşit olarak dağıtılması ve bu düşük bolluktaki malzemeden deneysel verimi optimize eden kesit düzlemine birçok adacık yerleştirilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Doktor Yahui Kong olacak.

Bu prosedüre başlamak için, düşük bağlayıcı bir p200 pipet ucu ve stereo mikroskop altında kalibre edilmiş bir ızgara kullanarak 250 adacık eşdeğerini elle seçin. Bunları her 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikrofüj tüpüne aktarmak. Adacıkların mikrofüj tüpünün dibine çökmesine izin verin.

Ardından, süpernatantın çoğunu dikkatlice çıkarmak için yeni bir p200 uçlu bir pipet kullanın. Herhangi bir adacığı kaldırmadığınızdan emin olun. Bir mililitre PBS ekleyin ve hız yerçekiminin 200 katına ulaşana kadar sallanan kovalı bir santrifüjde santrifüjleyin ve ardından dönüşü durdurun.

Süpernatanı çıkarın. Bu PBS yıkama işleminin tamamını toplam iki yıkama döngüsü için tekrarlayın. Daha sonra, 500 mikrolitre% 10 formalin çözeltisi veya% 4 taze yapılmış paraformaldehit ekleyin.

Numunenin oda sıcaklığında 30 dakika sabitlenmesine izin verin. Bundan sonra, sabitleyiciyi çıkarmak için p200 uçlu bir pipet kullanın. Bir mililitre PBS ekleyin ve hız 200 kez yerçekimine ulaşana kadar santrifüjleyin ve ardından dönüşü durdurun.

Süpernatanı çıkarın ve ardından toplam iki yıkama döngüsü için tüm PBS yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. İstenilen jeli metin protokolünde belirtildiği gibi 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde hazırlayın. Ardından, jeli ısıtmak için bu mikrosantrifüj tüplerini 70 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin.

Numune başına 10 mikrolitre agaroz mavisi boncuğu temiz bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için kesilmiş bir mikropipet ucu kullanın. Boncuklara bir mililitre PBS ekleyin, ardından bir dakika boyunca yerçekiminin 800 katında santrifüjleyin. PBS'yi çıkarın ve bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.

İkinci yıkamadan sonra, boncukları uygun miktarda PBS ile tekrar askıya alın. Hız yerçekiminin 200 katına ulaşana kadar adacıkları içeren tüpleri santrifüjleyin ve ardından dönüşü durdurun. Süpernatantın çoğunu çıkarın.

Bir makas kullanarak, her numune için 10 mikrolitrelik bir mikropipet ucunun ucunu kesin. Her numune için temiz bir kesme ucu kullanarak her adacık tüpüne 10 mikrolitre boncuk ekleyin. Daha sonra hız yerçekiminin 200 katına ulaşana kadar santrifüjleyin.

Bundan sonra, mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarmak için kesilmemiş 200 mikrolitre ve ardından 10 mikrolitrelik bir uç kullanın. Numune tanımlaması için mikroskop slaytlarını etiketleyin ve ısıtılmış jel ile ısı bloğunun yanındaki tezgahın üzerine yerleştirin. Bir makas kullanarak, numune başına birkaç düşük bağlayıcı mikropipet ucunun uçlarını kesin.

Kesilmiş bir uçla donatılmış bir mikropipet kullanarak, adacıklar ve boncuklar içeren bir tüpe ılık jel ekleyin. Herhangi bir baloncuk oluşmasını önleyerek hemen karıştırın. Bu karışımı, dış jel halkası için boşluk bırakırken sürgünün kenarına yakın bir disk oluşturan bir slayta uygulayın.

Ardından, adacıkları ve boncukları yerleştirmek için slayta birkaç kez hafifçe vurun. Numune tüpüne 20 mikrolitre ılık jel ekleyin ve yeni jeli kalan adacıklar ve boncuklarla karıştırın. Bu karışımı orijinal diski çevreleyen aynı slayta uygulayın.

Disk istenen boyut ve kalınlığa gelene kadar her uygulama için önceden kesilmiş yeni uçlar kullanarak gerektiği kadar tekrarlayın. Her diski ayrı ayrı hazırladığınızdan ve her iki tarafa birden fazla disk yerleştiriyorsanız numune sırasını takip ettiğinizden emin olun. Ardından, slaytları düz bir ıslak buz yüzeyine yerleştirin ve üzerlerini örtün.

Slaytları 10 dakika veya jel katılaşana kadar dinlendirin. Ardından, her birinin arkasını kurutduğunuzdan emin olarak slaytları çıkarın. Her numune için bir biyopsi işleme ve gömme doku kaseti etiketleyin.

Diski camdan kurtarmak için her yönden nazikçe itmek için tıraş bıçağının kör kenarını kullanın. Kolayca kaydığında, diski yavaşça slayttan itin ve diski düz tarafı aşağı bakacak şekilde doğrudan kağıdın üzerine yerleştirin. Cam slayttan kağıda kaydırırken farklı diskleri sağlam tutmak zor olabilir.

Diskte bir kırışıklık meydana gelirse, orijinal konumuna geri dönmesine izin verin, daha fazla jel ekleyin ve slaytı yeniden jelleştirin. Hareketi önlemek için kağıdı diskin etrafına katlayın. Bunu kasete aktarın ve ardından kaseti kapatın.

Kaseti PBS ile dolu bir behere batırın. Bu çalışmada, bölüm başına yüksek bir adacık verimini verimli bir şekilde elde etmek için modifiye edilmiş bir jel disk tabanlı gömme yöntemi kullanılmıştır. Kemirgen adacıklarının morfolojisi, pürüzsüz yuvarlak bir yüzey ve kompakt bir küresel şekil sergileyen adacık ortamında izolasyon sonrası geri kazanımdan sonra belirgin şekilde daha sağlamdır.

İnsan adacık morfolojisinin, varış gününde mi yoksa sevkiyat sonrası gece boyunca toparlandıktan sonra mı gömülü olduğuna bakılmaksızın benzer olması, adacıkların sevkiyattan önce izolasyon stresinden kurtulmasından kaynaklanıyor olabilir. Karşılaştırıldığında, eski mikro tüp tekniği ile elde edilen parafin kesitlerinin, bölüm başına daha az adacık ve yoğun paketlenmiş adacıklar ve boncuklar ile daha küçük bir doku kesit alanına sahip olduğu görülmektedir. Burada gösterildiği gibi, bu teknik, histolojik ve immünofloresan boyama için yüksek kaliteli adacık bölümleri üretebilir.

İnsülin ve glukagon boyama, insan, fare ve sıçan adacıkları arasındaki bilinen mimari farklılıkları gösteren adacık mimarisinin çeşitli bileşimini ve heterojenliğini gösterir. Bu görüntüler aynı zamanda aynı adacıkların seri kesitlerini de temsil eder. Bu tekniğin aynı adacıklardan birden fazla bölüm elde edebildiğini göstermek.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik mikrosantrifüj tekniğine göre zaman kazandırır. Diskin bir tüp yerine düz bir yüzey üzerinde oluşturulması, diskin işlenmek üzere kasete fiziksel olarak aktarılmasını kolaylaştırır. Bu yöntem adacık biyolojisi hakkında bilgi verebilse de, bölünmesi zor olan diğer hücre bloklarına veya kırılgan dokulara da uygulanabilir.

Bu prosedürü denerken, dokuyu küçük bir alanda konsantre etmek ve diski düz bir yüzeyde oluşturmak için küçük hacimli bir jel kullanmayı unutmamak önemlidir. Doku verimini artırmak için düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri ve pipet uçları kullanmak da çok önemlidir. Bu teknik, adacık biyolojisi alanındaki araştırmacıların, kendi doğal mimarilerinde tüm kültürlenmiş adacıklarda hücre tipi bileşimini ve heterojenliğini, hücre-hücre etkileşimini ve gen regülasyonunu keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.

Tek bir deneysel koşuldan birçok adacık içeren 10 veya daha fazla bölüm oluşturma yeteneği, aynı malzeme üzerinde birden fazla sonucun nicelleştirilmesine olanak tanıyarak deneysel verimliliği artırır. Bu tekniği sınırlı miktarda doku örneklerine uygulamak, diğer alanlara da fayda sağlayabilir. Bu yordamın öğelerinin kullanıcı gereksinimlerini karşılayacak şekilde değiştirilmesi gerekebilir.

Fiksasyon yoğunluğu ve bölünme optimize edilmelidir. Bu teknik kullanılarak daha kalın veya daha büyük disk oluşturulabilir. Gömme için basit işleme adımlarının iç içe yerleştirilmesi ve optimize edilmesi gerekebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tüm kültürlenmiş pankreas adacıklarının parafin bölümleri için yüksek kaliteli bir agaroz hücre bloğunun nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.