Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Bu prosedürün genel amacı, karmaşık protein sistemlerinin dinamiklerini, işbirliği gibi ilişkili etkileşimlere odaklanarak nicel bir şekilde incelemektir. Bu yöntem, protein komplekslerinin ve bunların dinamik etkileşimlerinin merkezi öneme sahip olduğu kantitatif biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dinamik çok renkli tek moleküllü FRET'in biyolojik olarak ilgili sistemlere uygulanmasına izin vermesidir.

Akış odasını monte etmeden önce, 40 mikron kalınlığında şeffaf bir yapışkan filmde bir akış kanalı kesin, filmin yapışkan olmayan tarafına hızlı sabitleme yapıştırıcısı püskürtün ve yapıştırıcının kurumasını bekleyin. Akış odası montajına başlamak için, giriş ve çıkış delikleri olan üç milimetre kalınlığında bir PEG, biotin, PEG işlevselleştirilmiş erimiş kuvars sürgü edinin. Tavan filminin sprey yapıştırıcı kaplı tarafını, kanalı giriş ve çıkış kancalarıyla hizalayarak sürgünün işlevsel tarafına uygulayın.

Slaytı sıcak bir plaka üzerinde bir dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Basıncı eşit olarak dağıtmak için ekstra bir mikroskop lamı kullanarak filmi 30 saniye boyunca slaydın üzerine bastırın. Ve sonra düzeneğin bir dakika soğumasına izin verin.

Yapıştırıcıyı kaplayan koruyucu tabakayı soyun. Akış odasını oluşturmak için açıkta kalan yapıştırıcının üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Odayı bir dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın.

Hazneyi kapatmak ve monte edilen haznenin soğumasını sağlamak için kapak contasını yapıştırıcının üzerine 30 saniye boyunca bastırın. Akış odasını prizmanın üzerine yerleştirmeden önce prizma yüzüne bir damla gliserol uygulayın. Akış odasını çok renkli prizma tipi TIRF mikroskobu için bir tutucuya monte edin.

İşiniz bittiğinde giriş ve çıkış borusunu bağlayın. Cihazı üç renk ölçümü için yapılandırmaya başlamak için elektron çarpımı CCD kamera yazılımını açın, EMCCD sensörünü mümkün olan en düşük sıcaklığa ayarlayın. Kamera dikey kaydırma hızını 3,3 mikrosaniyeye ayarlayın, normal dikey saat voltajını seçin, yatay okuma hızını 16 bit'te 17 Milihertz'e, ön amplifikasyon kazancını üçe ve elektron çarpanı kazanç seviyesini 1000'e ayarlayın.

Harici alım tetiklemesini seçin. Pozlama süresini 70 milisaniye olarak ayarlayın. Ve film kayıt süresi 750 çekim döngüsüne kadar.

Ölçüm dosyaları için yeni bir klasör oluşturun. EMCCD yazılımında otomatik kaydetmeyi etkinleştirin ve film karesi dosya formatını TIFF olarak ayarlayın. Otomatik kaydetme dosyası yolunu yeni oluşturulan klasöre ayarlayın.

Ardından, akusto-optik ayarlanabilir filtreyi, lazer kontrol yazılımını ve lazerleri AOTF, optik deklanşörler ve kameraları senkronize eden tetikleme yazılımını kontrol eden yazılımı açın. Prizmaya girmeden önce lazer gücünü yaklaşık üç miliwatt'a ayarlamak için AOTF'yi kullanın. Alternatif lazer uyarımı için tüm cihazları senkronize eden tetikleme modelini yükleyin, ardından numune tutucuyu cihaza monte edin.

Giriş borusunun ucunu deney tamponunu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Çıkış hortumunu çekme moduna ayarlanmış bir şırınga pompasına bağlayın. Hazneyi 150 mikrolitre tamponla yıkayın.

CCD kamerayı işlevsel arayüze odaklayın, uyarma ışınlarını hizalayın ve floresan kirleticileri ağartın. Daha sonra, mililitre başına 0.25 miligramlık 300 mikrolitre deglikosile edilmiş avidin ve tampon içine akıtın ve bir dakika boyunca inkübe edin. Bağlanmamış deglikosile avidin'i hazneden tampon ile yıkayın.

Daha sonra, yüzey işlevselleştirme kusurlarını engellemek için hazneden mililitre başına 0.5 miligram BSA konsantrasyonuna sahip 300 mikrolitre tampon akıtın. Daha sonra, akış odasını, yeterli yüzey yoğunluğu elde edilene kadar artan Hsp90 konsantrasyonlarında BSA içeren tamponda 150 mikrolitrelik biyotinile floresan etiketli Hsp90 ile yükleyin. Bağlanmamış proteini hazneden 300 mikrolitre BSA içeren tampon ile yıkayın.

Hazneye 25 nanomolar etiketli AMP-PMP ve BSA içeren tampon çözeltisinden 150 mikrolitre yükleyin ve beş dakika inkübe edin. Yükleme ve inkübasyonu bir kez tekrarlayın. Ardından, görüş alanını istediğiniz gibi değiştirmek için numune odasını uyarma ışınına dik olarak hareket ettirmek için bir Piezo step kullanın.

Gerekirse görüntü odağını ayarlayın. Gösterildiği gibi sinyal al düğmesine tıklayarak kamera yazılımında kamera kayıtlarını başlatın. Veri toplamaya başlamak için tetikleyici yazılımda uyarma alma döngülerini başlatın.

Veri analizine başlamak için analiz yazılımını açın ve iki kameranın kaydedilmiş filmlerini içe aktarın. Potansiyel tek moleküllere karşılık gelen floresan yoğunluğu izlerini belirlemek için izleri bul'a tıklayın. Her molekül için, aynı uyarma rengine sahip o noktanın tüm izlerinin toplamını hesaplayın.

Eklem ham yoğunluğunda kabaca düz bir plato ve tüm uyarma renkleri için tek bir ağartma adımı için tüm kanallardaki yoğunluk profillerini değerlendirin. Uygun algılama kanallarında anti korelasyonlu davranış ve izde kırmızı floresan oluşumu olup olmadığına bakın. Tüm kriterler karşılanıyorsa, daha fazla analiz için floresan izlerini kaydedin.

Sadece belirtilen molekül bu örnekteki kriterleri karşılamaktadır. Düz platoları olmayan, anti korelasyon yerine yanıp sönme olayları gösteren veya birden fazla ağartma adımı olan izleri hariç tutun. İz seçimi, tüm tek molekül tekniklerinde kritik bir adımdır.

Yalnızca iyi tanımlanmış kriterleri karşılayan izler seçilmelidir. İşte bu kriterler anti korelasyon, tek beyazlatma adımları ve düz platolardır. Ardından, kaydedilen molekülleri birbiri ardına görüntüleyin ve bir dizi yoğunluk izi, tüm kat dörtlüsünün zaten ağartılmış olduğu bir zaman aralığı seçin.

Bu zaman aralığı için ışın arka plan yoğunluğunu hesaplayın, ardından yanıp sönme olaylarına sahip izleri hariç tuttuğunuzdan emin olarak, Hsp90 üzerindeki her iki boyanın da bulunduğu FRET verimlilik aralığını seçin. Kısmi floresan izlerini hesaplayın. İzlerde düşük sinyal-gürültü oranına sahip molekülleri hariç tutun.

Ardından, kısmi floresan verilerinin 2B projeksiyonlarını oluşturun ve göreceli popülasyon hesaplama aracını başlatın. Init'e tıklayın. İlgilenilen zirvenin etrafına bir çokgen çizin.

Ve bu zirve için göreli nüfusu hesaplamak için tıklama sayısı. Kısmi floresan verilerinin 3D histogramını oluşturun ve histogramı normalleştirin. 3B Gauss uyumu için başlangıç parametrelerinin fazlasını alın ve durum popülasyonlarını parametre vektörünün sonuna ekleyin.

Verileri sığdırın ve sonuçları görüntüleyin. 3B kısmi floresan alanındaki her durumun konumunu ve genişliğini tanımladıktan sonra, Gizli Markov Modeli arayüzünü başlatın. Uygun durum sayısını, giriş sinyalinin boyut sayısını ve giriş türünü seçin.

Geçiş olasılıkları için maksimum olabilirlik tahmincilerini belirlemek için HMM parametrelerini optimize edin. Veri alt kümeleri için popülasyon seçimini, sığdırmayı ve HMM optimizasyonunu tekrarlayın. Son olarak, geçiş olasılıkları için güven aralığını hesaplayın ve daha fazla analiz için verileri basitleştirmek için konformasyonel durumları daraltın.

Hsp90 proteininin konformasyonel durumları, etiketli raportör nükleotid AMP-PMP varlığında üç renkli tek moleküllü FRET ile incelenmiştir. Beş konformasyonel durum, floresan yoğunlukları ile ayırt edilebilirdi ve bu durumlardan dördü işlevsel olarak farklıydı. Üç renkli tek moleküllü FRET, bir 3D uzayı kapsayan kısmi floresan verileriyle sonuçlandı.

Deney koşulları altında teorik olarak beklenen tüm durumlar, 2B projeksiyonlarda kısmi çiçeklenme ile ayırt edilebildiğinden, durumları ayırmaya yardımcı olmak için 2B projeksiyonlar kullanıldı. Bu durumların göreceli popülasyonları 2B projeksiyonlardan belirlendi ve 3B Gauss uyumları için kısıtlamalar olarak kullanıldı. Sonraki topluluk 3D HMM optimizasyonu ve modellemesi, çıkarılan durum geçiş olasılıklarını sağladı.

Çıkarılan her hız sabiti için güven aralıkları hesaplandı. Deneylerin ek 250 mikromolar etiketlenmemiş AMP-PMP varlığında tekrarlanması, bir nükleotidin bağlanmasının Hsp90 dimerindeki ikinci bağlanma bölgesi üzerindeki etkisini aydınlattı. Bağlı ve bağlanmamış konformasyonların daraltılması, ek etiketlenmemiş AMP-PMP'nin varlığında ve yokluğunda floresan AMP-PMP'nin Hsp90'dan ayrışması için ortalama bekleme süresinin hesaplanmasına izin verdi.

Bu videoyu izledikten sonra, çok renkli FRET ve TIRF mikroskobu kullanarak dinamik bir protein sisteminden kinetik bilginin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, yaşam bilimlerindeki araştırmacıların çoklu protein sistemlerindeki ilişkili etkileşimleri belirlemelerinin yolunu açmaktadır. Bu, kooperatifçilik gibi temel düzenleyici mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılması için önemlidir.