Name: Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, kalibrasyonsuz floresans dalgalanma spektroskopisi ile protein homo-oligomerizasyonunu in vitro nicel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, ilaç taraması ve kanser ilaç geliştirmede protein etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Wellcome Trust tarafından desteklenen 105278/Z/14/2 adında için vermek Wellcome Güven Merkezi insan genetiği için Wellcome güven çekirdek Ödülü 203852/Z/16/2 tarafından finanse edilmektedir. C.S. Grup çalışmalarında kanser Araştırmaları İngiltere (C20724/A14414) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı hibe 647278 altında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir.

1. FKBP12 F36V - mVenus arıtma
<ol><li>Monomerized insan FKBP12F36V12 ve N-terminal His6 ve mVenus Etiketler (vektör istek üzerine temin edilebilir) içeren pET22b vektör ile (DE3) pLysS hücreleri dönüşümü. Plaka hücreleri üzerine LB agar 50 µg/mL ampisilin ve 34 µg/mL kloramfenikol ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Dönüştürülmüş kolonileri 100 mL LB starter kültür aktarmak ve 16-20 saat 37 ° C'de sallayarak ile büyür.</li>
	<li>Yoğun starter kültür seyreltik (OD600 > 1) 1: 100 LB Orta (2 x 500 mL toplu işlemleri) ve OD600 için 2-3 saat boyunca büyümeye = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 devir/dakika).</li>
	<li>Buz üzerinde serin kültürler. 250 µM IPTG ikna etmek ve 16-20 saat 21 ° c, 200 rpm için büyür.</li>
	<li>20 dakikadır 2.000 x g de Santrifüjü tarafından hücre hasat.</li>
	<li>Pelet 40 ml EDTA ücretsiz proteaz inhibitörleri (hücre Pelet başına 1 tablet) ile (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) takıma IMAC arabelleği resuspend.</li>
	<li>Hücreleri solüsyon içeren temizleyicide (500 watt, 20 kHz, % 40 genlik, 9 s 11 tarihinde kapalı s 15dk için) aralıklarla 20.000 x g de buz ve hasat çözünür malzeme üzerinde.</li>
	<li>Transfer çözünür konik bir şişesi için lysate ve reçine 2 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). 105 rpm döndürme ile 1 saat için kuluçkaya Not: Nikel sepharose de bu IMAC adım için kullanılabilir.</li>
	<li>Reçine hasat ve IMAC arabelleği 500 mL tarafından IMAC arabelleği B (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) takip A 250 mL ile yıkayın. Not: 50 mM imidazole nikel sepharose reçine kullanıyorsanız artırın.</li>
	<li>His6 öğesini protein IMAC tampon C (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) kullanarak elute.</li>
	<li>Bir boyut dışlama enjekte sütun 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT equilibrated ( Tablo malzemelerigörmek). FKBP12F36V onun tepe elüsyon 87.71 mL biz kullanılan sütun vardır.</li>
	<li>Saflık SDS-sayfa ve havuzu ile değerlendirmek ve gerektiğinde konsantre.</li>
</ol>2. Multiwell plaka dizi hazırlanması
<ol><li>Saf FKBP12F36V çözülme (veya ilgi protein etiketli) üzerinden-80 ° C.</li>
	<li>100 çözeltisi hazırlamak nM saf FKBP12F36V (orta, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Solüsyon içeren temizleyicide ve toplamları oluşumunu önlemek için (hızlı spin 13000 RPM) santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>8 iyi gözlem odasına bir cam alt ile 100-200 µL pipette.</li>
	<li>BB dimerizer 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nM12,13son konsantrasyonları ekleyin.</li>
	<li>Bir referans olarak 100 çözeltisi hazırlamak nM yalnız potansiyel toplama ve yağış etkileri değerlendirmek ve monomer için bir parlaklık değeri ile aynı satın alma ayarları kurtarmak için mVenus.</li>
</ol>3. Kalibrasyon-Alerjik Confocal edinme
<ol><li>Confocal sistemi (Şekil 1) başlatın. Dijital dedektörleri ya iyi karakterize analog dedektörleri8mikroskop confocal sistem tarama herhangi bir ışık ile donatılmış ve tutma yeteneğine sahip bir sabit Işınma Zamanı elde her piksel için çalışacak.</li>
	<li>Uyarma ışın yolu ayarla:<ol>
<li>514 nm lazer ve set 20-100 NW güç amaç çıkış (için FKBP12F36V-mVenus) açın.</li>
		<li>63X1.4NA amaç veya FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme su daldırma hedefi seçin.</li>
		<li>Bir HyD, APD veya kalibre edilmiş Devresel_ödeme dedektörü açın. Dedektörleri yeteneğine foton sayma tercih, bu davada olduğu gibi hesaplama S, uzaklık ve σ02 gereksizdir.</li>
		<li>520-560 nm Emisyon pencereyi seçin</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj 1 havadar ünitesinde karşılık gelen emisyon ~ 545 nm için ayarlayın.</li>
		<li>16 x 16 piksel satın alma modunu ayarlamak</li>
		<li>Bu tçerçeve karşılayan gibi piksel Işınma Zamanı tdurmak ayarlamak >> TD >> D nerede ikamet süresi akışkanın protein ve t tdurmak, kare hızı çerçevedir . Bu bekleme süresi ~ 13 µs için ayarlama denk. Not: Ticari bazı üreticiler Işınma Zamanı piksel başına sabit tutan değil tarayıcılar vardı. Bu süreklilik yöntemin işe yaraması için çok önemlidir.</li>
		<li>~ 120 piksel boyutunu belirlemek nm.</li>
		<li>Xyt satın alma modunu seçin ve satın alma ve iyi (örneğin 5000) elde edilebilir için kare sayısını seçin.</li>
		<li>Sistem yüksek üretilen iş moduyla varsa, her şey ve iyi ücret satın alma sayısını otomatikleştirmek belgili tanımlık oluşum koordinatlarını tanıtmak. Not: Eğer bir daldırma amacı istimal için su dağıtıcısı varlığını sağlamak dikkat et.</li>
		<li>Eğer sistem ile donatılmış bir perfüzyon sistemi BB çözüm yükleyin ve perfüzyon sağ sonra başlatmak için Örneğin, 10.000 görüntüleri alma sırasında dimerization kinetik değerlendirmek için 5000inci çerçeve programı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir damla yağı yağı daldırma amaç eklemek / FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme su daldırma objektif kullanmak Eğer su.</li>
	<li>8 iyi gözlem odası sahne içine monte.</li>
	<li>Doğru şey seçin ve çözüm üzerinde odaklanmak. Not: Önemli: yansıma ve saçılma önlemek için yakın alt cam odaklanarak kaçının. Çözüm içine daha derin netleme yaparken otomatik odaklama seçeneği bağlantısını kesin.</li>
	<li>Satın başlatmak ve görüntüleri elde edilen yığını TIFF formatında kaydedin.</li>
</ol>4. detrend ve parlaklık R paket nandb kullanarak çözümleme
<ol><li>Önişleme kalite kontrolü, ImageJ14 resimler bir göz atın ve yoğunluk profili yeniden elde etmek için Şekil 2biriçinde gösterildiği gibi kullanın. Bu çok fazla photobleaching oluştu olup olmadığını belirlemek yararlıdır. Çok fazla ağartma varsa, verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için uygun değildir. Not: ImageJ da ticari oluşum--dan için TIFF görüntüleri dönüştürmek yararlı olabilir. Aşağıda açıklanan nandb yazılım yalnızca TIFF dosyalarıyla çalışabilirsiniz.</li>
	<li>Karşıdan yükleyip R ve RStudio15,16. R yükleyip kurmanız en iyisi ilk, o zaman RStudio. Not: Aşağıda nandb R paketini kullanmak nasıl bir açıklama olduğunu. Hayatı daha kolay hale getirecek ancak R dil bilgisi nandb, kullanmak için gerekli değildir.</li>
	<li>Nandb paketini yükleyin.<ol>
<li>RStudio açın ve install.packages("nandb") yazın konsol ve yükleme işleminin tamamlanmasını bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nandb tanıyın<ol>
<li>El ile17gözden geçirin.</li>
		<li>Yerleşik RStudio yardım çeşitli işlevler için gözden geçirin. Kullanılacak en olası işlevini-ecek var olmak kullanma-ecek var olmak brightness(). Bu işlev için yardım dosyasına yazarak bakın? Brightness() konsol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parlaklık hesaplamak<ol>
<li>Bir img001.tif ('nandb' sadece TIFF dosyaları ile çalışır Not) olarak adlandırılan Masaüstü üzerinde bir görüntü dosyası varmış. Bir o görüntü parlaklığını hesaplayabilirsiniz: b <-parlaklık ("~/Desktop/img001.tif", tau "auto" =)<ol>
<li>Bu değişken b R., görüntünün parlaklığını atar Tau = "otomatik" sağlar görüntü düzgün parlaklık hesaplama önce değişimleri ki. En yaygın olanı buradan ortalama veya ortalama parlaklığının hesaplamak etmektir. Bir mean(b) veya median(b) yazarak yapabilirsiniz. Bir de okul sırası kullanma için parlaklık görüntünün yazabilirsiniz ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir klasör masaüstü görüntüleri images_folder dolu ve bu görüntülerin brightnesses hesaplamak ve parlaklık görüntüleri TIFF dosyaları olarak yazmak ihtiyacı demek. O zaman? brightness_folder(). Bu işlev tüm bir klasör birden işler: brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau "auto" =) Bu özellikle iyi olanlar R için tercih ettikleri bir yazılım var, tüm dosyaları tek bir komutta işlenir ve o zaman bir çıkış parlaklık TIFF görüntüleri onların seçilen yazılımı ile çalışmaya gitmek, ImageJ14 olması , Python veya başka bir şey.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+fluorescence+lifetime+correlation+spectroscopy+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell.</a> Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Tramier, M., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+imaging+microscopy+for+homo-FRET+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).</li>
<li>Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein+aggregation+and+interaction+in+live+cells%3A+A+guide+to+number+and+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. , (2017).</li>
<li>Hur, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Brightness+from+Living+Cells+in+the+Presence+of+Photodepletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).</li>
<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
<li>RStudio: Integrated Development Environment for R. <a target="_blank" href="http://web.warwick.ac.uk/statsdept/useR-2011/abstracts/180111-allairejj.pdf">R Team</a>. , (2016).</li>
<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

N & B ticari ışık confocal mikroskoplar dijital yangın dedektörleri ile donatılmış tarama kullanarak multimerization algılamak için tekniktir. Bu yaklaşım tek noktadan FCS, FCCS ve smFRET çünkü kalibrasyon ücretsiz ve parlaklık hesaplama basit ve konsantrasyon bağımsız6ile karşılaştırıldığında oldukça çekici olduğunu. Bu büyük, ancak, ağartma ve uzun süreli şiddeti dalgalanmalar için parlaklık hesaplamalar9gerçekleştirmeden önce düzeltmek için önemlidir; detrending ihmal ve...

Protein-protein etkileşimleri ben n in Vitro
Geleneksel olarak, kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu (cryoEM) ile birlikte nükleer manyetik rezonans deneyler doğru proteinlerin üç boyutlu mimari tanımlamak için ve işlevlerine göre anlaması için seçilmiş teknolojiler vardır onların yüksek çözünürlüklü yapısal detayları scrutinizing. Proteinler, ancak, statik yapılar değildir ve konformasyon değişiklikleri ve titreşim çeşitli zaman ve mekan içinde tabi olabilir. Bu yapısal yüzden bilgi crystallographic veya CryoEM veri (Örneğin, moleküler dinamiği simülasyonları ve tek molekül teknikleri) diğer teknikleri ile tamamlanabilir: işlev bir proteinin konformasyon için ilişkilidir değişiklikleri ve etkileşimleri ve bu bilgileri bir statik yapısı içinde mevcut değil. İntra moleküler dynamics için yoklama için çok etkili1Forster rezonans enerji transferi (smFRET) tek molekül dayalı teknikler vardır. Bu yaklaşımlardan farklı altgrupları karmaşık medya olarak değerlendirmek edebiliyoruz. Bu değişikliklerin hızlı ve veri (Örneğin, ikinci aralığı için nanosecond) edinimi sırasında oluşan çok önemlidir.
İki ana yaklaşım yaygın olarak algılamak ve bu değişiklikleri ölçmek için istihdam edilmektedir: proteinler çözüm ve yüzey-immobilizasyon. Arası moleküler etkileşimleri ve özellikle, ligandlar tarafından indüklenen dimerization süreci algılama için smFRET her zaman en iyi araç değildir. Gerçekten de, sadece mesafe (≈10 nm) ama aynı zamanda iki dipoller (donör ve alıcısı, χ2) yönünü FRET bağlıdır ve donör emisyon alıcısı'nın emilimi spectra2, ama belki de bu son durum ile çakışma azdır koşuluyla deneyci olabilir önemli değil FRET çift açmadı. SmFRET homo-dimerization problama için belirli bir dezavantaj faiz protein etiketleme üzerinden gelir: hetero smFRET için dimerization sadece olabilir % 50 tespit (Yani, hetero-perde sadece donör-alıcısı algılamak mümkün olacak ve alıcısı-donör homo-dimer ama değil donör verici veya alıcısı-alıcısı, dimer diğer % 50). Floresans korelasyon spektroskopisi (FCS) ve türevleri (protein difüzyon sabitler ve bağlama sabitler vitro tespit etmek için FCCS, vb3) başka bir alternatif kullanmaktır. Bu yaklaşımların tamamen homo-dimerization de ölçmek mümkün değildir, FCS bir önlemler konsantrasyon ve difüzyon ve RADIUS ve difüzyon katsayısı bir akışkanın parçacık olduğu gibi çok kötü moleküler ağırlık bağlıdır; Örneğin molekül ağırlığı 10 kat artış sadece 2,15 kat değişim difüzyon katsayısı4ima. İki renkli FCS veya FCCS, homo-dimer sadece % 50'si aynı sebepten dolayı yukarıdaki gibi görülecektir. Homo-dimerization vitro ve in vivo algılamak için en pratik ve kantitatif yaklaşımlar homo-perde5 ve numarası ve parlaklık (Y &amp; B)6vardır. Aslında verildi ki homo-perde gerektirir belirli araçları kurtarma anizotropi değeri (Yani, optik elemanları/paralel ve dikey polarizasyon kurtarmak için analiz sistemleri), N &amp; B sunulan burada olumlu bir teknik olarak protein homo-dimerization ve toplama algılar. O-ebilmek var olmak vitro ve in vivo ticari bir kurulum ile istihdam.
Numarası ve parlaklık
N &amp; B son zamanlarda gözden geçirilmiş7oldu. O eleştiriyi canlı hücreleri tekniğinde uygulanması üzerinde duruldu. İçin faydalıdır bu denklemler olarak matematiksel biçimcilik verilere uygulanacak yeniden toplanan içinde vitro. İlk olarak, bazı terimleri ve matematiksel miktarları tanımlamak gereklidir:
<ul><li>Birbirimize bağlıyız molekülleri bir dizi bir varlıktır.</li>
	<li>Bir varlığın parlaklık ε birim birim zamanda (kare) başına yayar fotonlar sayısıdır.</li>
	<li>
n varlıklar mevcut sayısıdır.</li>
	<li>Bir görüntü serisi boyunca belirli bir piksel için &lt; ı &gt; onun ortalama yoğunluğu ve σ2 şiddeti varyans olmasıdır.</li>
</ul>O zaman, foton sayma dedektörleri ve varsayarak hareket eden varlıklar ve hiçbir arka plan ile
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
N B ve belirgin numarası olan belirgin parlaklıkolduğunu. Bu sonuçlar
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Gamze vd. 8 gösterdi analog ekipman ile bir üç düzeltme dönem gerekir: S faktörü, arka plan ofsetve okuma gürültü σ02. O zaman, tekrar hareket eden varlıklar varsayarsak,
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
veren
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
Yukarıdaki Denklem için farklı olduğuna dikkat edin gamze ve ark. içinde verilen 8 ve sonraki bir daha gözden geçirme. 7 içinde gamze vd. S payda içinde bir yazım hatası nedeniyle ihmal ve bu hata İnceleme çoğaltılamaz. Yukarıdaki denklem doğru olandır. Talimatları Sölçmek için uzaklık ve σ02 - anlamlarını - açıklaması ile birlikte verilen tarafından gamze vd. 8
Parlaklık ε akışkanın varlıkların oligomeric durumuna orantılıdır: ε iki kez ve benzeri trimers için olduğu gibi monomerleri, iki kez hexamers için büyük için olduğu gibi monomerleri, trimers için üç kez büyük için olduğu gibi dimer için büyük olacak. Böylece parlaklık ε, ölçme, bir multimerization her türlü ölçmek.
Varsa mevcut, sayı oligomeric Birleşik bir karışımı ve parlaklığı bireysel oligomeric Birleşik mevcut kurtarma yeteneğine sahip değildir. Bu tekniğin bir kısıtlamadır.
Algoritma ve nandb yazılım detrend
Have be photobleaching düzeltme önemini daha önce9vurguladı. Photobleaching kaçınılmaz olarak hızlandırılmış modunda ışık mikroskobu deneyler sırasında oluşur; hem canlı hücreleri ve içinde vitro. Pek çok yaklaşım7beyazlatma için düzeltmek için literatürde tarif edilmistir. Üstel filtreleme detrending parametre T otomatik seçeneği ile mevcut en iyi tekniktir. Ücretsiz, açık kaynak yazılım nandb9içine entegre edilmiştir. Gerçekten de, bu parametre seçim büyük olasılıkla keyfi ve yanlış olacaktır çünkü onların detrending parametre el ile seçmek Kullanıcı yazılımlar hatalı sonuçlara yol açabilir. Otomatik algoritması verileri inceler ve uygun parametresi, Kullanıcı müdahalesi9için gerek kalmadan belirler. Hatta en iyi seçim düzeltme parametresi ile detrending kendi sınırlamaları vardır ve iyi sadece photobleaching yüzde % düşük simülasyonlar9ile gösterildiği gibi çalışır. Öyle ki bir parlaklığı düşük değerlerle çalışabilirsiniz ilginçtir, otomatik detrending rutin, onun doğruluğunu kullanıldığında (hatta B &lt; 1,01) ve bu nedenle düşük yoğunluklarda ve hala homo-dimerization ölçmek için kesin olarak.
Photobleaching da başka bir sorun neden olur: photobleached fluorophores içinde karmaşık bir multimer varlığı. Bu bir trimer görünür bir dimer gibi trimer olarak üç birimi olmayan flüoresan olduğunda Örneğin, yapar. Hur ve Mueller10 için bu sorunu gidermek nasıl gösterdi ve bu düzeltme da bir sonraki İnceleme7' vurguladı. Bu düzeltme9nandb yazılımlardır.
FKBP12 F36V sistem
FKBP12F36V hangi değil doğal olarak oligomerize ama AP20187 ilaç (halk dilinde ligand dimerizing BB da bilinir)11,12eklenmesi dimerize için bilinen bir proteindir. Bu sayı ve parlaklık için ideal bir test çalışması yapar: etiketli FKBP12F36V ile oligomeric durumunu iki katına BB eklenmesi dikkat edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) pLysS hücreleri</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Madde Kimliği 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Madde Kimliği: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB başlangıç kültürü</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB ortamı</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Madde Kimliği 329815691</td><td></td></tr><tr><td>IMAC tamponu</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON reçinesi</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikel sefaroz</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 sütun</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı 8 kuyulu gözlem çanağı</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

kalibrasyon-alerjik vitro miktar protein homo-oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Numarası ve parlaklık protein homo-Oligomerizasyonda algılamak için bir kalibrasyon-Alerjik floresans dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğidir. Bu geleneksel bir confocal mikroskop dijital yangın dedektörleri ile donatılmış kullanarak istihdam edilebilir. Vitro tekniği kullanımı için bir iletişim kuralı aracılığıyla nerede numarası ve parlaklık doğru önce ve sonra dimerizing uyuşturucu AP20187 ilavesi mVenus etiketli FKBP12F36V oligomeric durumunu ölçmek için görülebilir bir kullanım örneği gösterilir. Doğru mikroskop edinme parametreleri ve doğru veri ön işleme ve analiz yöntemleri kullanmanın önemini ele alınmıştır. Özellikle, photobleaching düzeltme tercih önemi vurgulanmıştır. Bu ucuz Yöntem protein-protein etkileşimler birçok biyolojik bağlamlarda eğitim için istihdam edilebilir.

Detrending ve monomeric parlaklık
Veriyi kazanılmış sonra bir çözüm ilgi protein oligomeric durumunu belirlemek için parlaklık hesaplamalar başlayabilirsiniz. Çözümde ağartma etkisi kadar sert olmayabilir olsa bile olarak vivo içindeolabilir, yoğunluğu izleme hala muhtemelen fluorophore,18 ama bu arkasındaki nedenleri ile ilgili photophysical etkileri nedeniyle sabit demek olmaya...

Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Bu yöntem, protein-protein etkileşimleri için küçük moleküllü inhibitörlerin çok düşük konsantrasyonlar üzerindeki etkisini aydınlatmak gibi ilaç tarama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kalibrasyon gerektirmemesi, herhangi bir konfokal mikroskopta uygulanabilmesi ve çok az miktarda etiketli protein kullanmasıdır. Bu tekniğin etkileri, protein-protein etkileşimleri hakkında nicel bilgi sağladığı için kanser ilaçlarının, küçük moleküllü inhibitörlerin ve çeşitli füzyon inhibitörlerinin geliştirilmesine kadar uzanır.Bu yöntem, in vitro protein etkileşimleri ve agregasyonları hakkında bilgi sağlayabilse de, canlı hücre protein dinamikleri ve hücre-hücre etkileşimleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Başlamak için, pLysS hücrelerini monomerize insan FKBP12 ve N-terminal His6 ve mVenus etiketlerini içeren bir pET-22b vektörü ile dönüştürün. Hücreler inkübe edilmekten ve ısı şokundan sonra iyileştikten sonra, bunları antibiyotiklerle takviye edilmiş LB agar üzerine koyun.Dönüştürülmüş kolonileri 100 mililitrelik bir LB başlangıç kültürüne aktarın ve çalkalama ile 37 santigrat derecede 16 ila 20 saat büyütün. İnkübasyonun ardından, yoğun başlangıç kültürünü iki 500 mililitrelik parti halinde LB ortamında bir ila 100 oranında seyreltin. Ardından, iki ila üç saat boyunca 600 nanometrede 0,6 ila 0,8 arasında bir optik yoğunluğa kadar büyütün.Kültürleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, 250 mikromolar IPTG ile protein üretimini indükleyin. Kültürleri 21 santigrat derece ve 200 rpm'de 16 ila 20 saat büyütün. Daha sonra, hücreleri 20 dakika boyunca 2.000 g'da santrifüjleme ile hasat edin.Süpernatanı çıkarın ve peleti EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 40 mililitre IMAC tamponu A içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, hücreleri 500 watt, 20 kilohertz ve% 40 genlikte, dokuz saniye açık, 11 saniye kapalı buz üzerinde 15 dakika sonikleştirin. Sonikasyonun ardından, çözünür materyali dört santigrat derecede bir saat boyunca 20.000 g'da santrifüjleme ile hasat edin.Çözünür lizatı konik bir şişeye aktarın ve iki mililitre TALON reçinesi ekleyin. Süspansiyonun 105 rpm dönüş ile bir saat inkübe etmesine izin verin. Şimdi, reçineyi hasat edin ve 250 mililitre IMAC tamponu A ile yıkayın ve ardından 500 mililitre IMAC tamponu B ile yıkayın. IMAC tamponu C kullanarak His6 etiketli proteini elüatı önceden dengelenmiş bir boyut dışlama kolonuna enjekte edin ve yaklaşık 87.7 mililitrede ortaya çıkan FKBP12 zirvesini toplayın.SDS-PAGE ile proteinin saflığını değerlendirin ve gerektiği gibi bir araya getirin ve konsantre edin. Çok kuyulu plaka dizisini kurmak için, önce boyut dışlama kromatografisi için kullanılan aynı tamponda 100 nanomolar saflaştırılmış FKBP12 çözeltisi hazırlayın. Agrega oluşumunu önlemek için 13.000 rpm'lik hızlı bir sıkma ile sonikat ve santrifüj.Şimdi, seyreltilmiş proteinin 100 ila 200 mikrolitresini cam tabanlı sekiz oyuklu bir gözlem odasına pipetleyin. BB dimerizeratörü 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nanomolar nihai konsantrasyonlara ekleyin. Referans olarak, potansiyel toplama ve çökelme etkilerini değerlendirmek ve aynı edinme ayarlarıyla monomer için bir parlaklık değeri elde etmek için tek başına 100 nanomolar mVenüs'ten oluşan bir çözelti hazırlayın.Dijital dedektörler veya iyi karakterize edilmiş analog dedektörlerle donatılmış ve elde edilen her piksel için sabit bir bekleme süresi tutabilen herhangi bir ışık taramalı mikroskop konfokal sistemi kullanılabilir. Floresan korelasyon spektroskopisi için tasarlanmış yaka düzeltme suya daldırma objektifini seçin. Şimdi, yaka düzeltme suya daldırma hedefine bir damla su ekleyin.Sekiz kuyulu gözlem odasını sahneye monte edin. 514 nanometre lazeri açarak ve objektifin çıkışında 20 ila 100 nanowatt güce ayarlayarak uyarma ışını yolunu ayarlayın. Bir HyD dedektörünü açın.Foton sayma yapabilen dedektörler tercih edilir. 520 ila 560 nanometre arasında emisyon penceresini seçin. Çekim modu için 16 x 16 piksel kullanın.Piksel bekleme süresini, kare süresi protein difüzyonundan daha uzun ve piksel bekleme süresi çok daha kısa olacak şekilde ayarlayın. Bu, bu gösteride kullanılan sistem için bekleme süresinin yaklaşık 13 mikrosaniyeye ayarlanmasına karşılık geldi. İğne deliğini, yaklaşık 545 nanometrelik karşılık gelen emisyon için bir Airy ünitesine ayarlayın.xy zaman edinme modunu seçin ve edinme ve kuyu başına alınacak kare sayısını seçin. Şimdi, piksel boyutunu yaklaşık 120 nanometre olarak ayarlayın. Sistem yüksek verim modu ile donatılmışsa, süreci otomatikleştirmek için her bir kuyunun koordinatlarını ve kuyu başına satın alma sayısını tanıtın.Sistem bir perfüzyon sistemi ile donatılmışsa, BB solüsyonunu yükleyin ve 10.000 görüntü elde ederken dimerizasyon kinetiğini değerlendirmek için perfüzyonu 5.000. kareden hemen sonra başlayacak şekilde programlayın. Doğru kuyuyu seçin ve çözüme odaklanın. Ardından, alımı başlatın ve elde edilen görüntü yığınını TIFF biçiminde kaydedin.100 nanometre çözeltisinde saflaştırılmış FKBP12 mVenüs'ün 20.000 görüntüsünün dizileri, protokol bölümünde belirtildiği gibi elde edildi. İlk karenin yoğunluğu, trendi kaldırılmış görüntünün ortalama yoğunluk profili ile birlikte gösterilir. Düzgün filtreleme olmadan ve düzgün filtreleme ile parlaklık da gösterilir.10.000 çerçeve elde edildikten sonra, homojenleştirici ilaç BB, elde edilirken çözeltiye ilave edildi. Her ardışık 5.000 kare serisi analiz edildi. BB ilavesinden beş dakika sonra ortalama parlaklık 1.010 idi, bu da iki kat artış, bu da bir FKBP12 dimerini gösteriyor.İşlemin kinetiği, BB ilavesi ile tam FKBP12 dimerizasyonu arasında yaklaşık iki dakikalık bir gecikme olduğunu gösterir. Protein-protein etkileşimlerini in vitro olarak değerlendirmenin önemli bir yönü, etiketli proteininizin üretilmesi ve saflaştırılmasıdır. İlgilendiğiniz etiketli proteinden küçük miktarlarda sahip olduğunuzdan ve proteininizin analizinize göre toplanmadığından emin olun.Bu prosedürü takiben, ayrışma sabitleri veya difüzyon katsayıları gibi ek soruları yanıtlamak için yüzey plazmon rezonansı veya floresan korelasyon spektroskopisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra biyofizik alanındaki araştırmacıların canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini ayrıntılı olarak keşfetmelerinin önünü açtı. Protein saflaştırması için reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük, eldiven gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

calibration-free-vitro-quantification-protein-homo-oligomerization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&amp;B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Bu protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini araştırmak için kütle fotometrisini yeni bir mikroakışkan sistemle birleştirir. Bu yaklaşım, düşük afiniteli ölçümleri mümkün kılan ve kütle fotometrisinin uygulanabilirliğini genişleten çözelti içindeki yüksek konsantrasyonlu komplekslerin hızlı bir şekilde seyreltilmesine dayanmaktadır.

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Öğrenin, kalibrasyonsuz floresans dalgalanma spektroskopisi ile protein homo-oligomerizasyonunu in vitro nicel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, ilaç taraması ve kanser ilaç geliştirmede protein etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak (Video) | JoVE Journal

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Daha fazla video keşfet