Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Bu yöntem, protein-protein etkileşimleri için küçük moleküllü inhibitörlerin çok düşük konsantrasyonlar üzerindeki etkisini aydınlatmak gibi ilaç tarama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kalibrasyon gerektirmemesi, herhangi bir konfokal mikroskopta uygulanabilmesi ve çok az miktarda etiketli protein kullanmasıdır. Bu tekniğin etkileri, protein-protein etkileşimleri hakkında nicel bilgi sağladığı için kanser ilaçlarının, küçük moleküllü inhibitörlerin ve çeşitli füzyon inhibitörlerinin geliştirilmesine kadar uzanır.

Bu yöntem, in vitro protein etkileşimleri ve agregasyonları hakkında bilgi sağlayabilse de, canlı hücre protein dinamikleri ve hücre-hücre etkileşimleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Başlamak için, pLysS hücrelerini monomerize insan FKBP12 ve N-terminal His6 ve mVenus etiketlerini içeren bir pET-22b vektörü ile dönüştürün. Hücreler inkübe edilmekten ve ısı şokundan sonra iyileştikten sonra, bunları antibiyotiklerle takviye edilmiş LB agar üzerine koyun.

Dönüştürülmüş kolonileri 100 mililitrelik bir LB başlangıç kültürüne aktarın ve çalkalama ile 37 santigrat derecede 16 ila 20 saat büyütün. İnkübasyonun ardından, yoğun başlangıç kültürünü iki 500 mililitrelik parti halinde LB ortamında bir ila 100 oranında seyreltin. Ardından, iki ila üç saat boyunca 600 nanometrede 0,6 ila 0,8 arasında bir optik yoğunluğa kadar büyütün.

Kültürleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, 250 mikromolar IPTG ile protein üretimini indükleyin. Kültürleri 21 santigrat derece ve 200 rpm'de 16 ila 20 saat büyütün. Daha sonra, hücreleri 20 dakika boyunca 2.000 g'da santrifüjleme ile hasat edin.

Süpernatanı çıkarın ve peleti EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 40 mililitre IMAC tamponu A içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, hücreleri 500 watt, 20 kilohertz ve% 40 genlikte, dokuz saniye açık, 11 saniye kapalı buz üzerinde 15 dakika sonikleştirin. Sonikasyonun ardından, çözünür materyali dört santigrat derecede bir saat boyunca 20.000 g'da santrifüjleme ile hasat edin.

Çözünür lizatı konik bir şişeye aktarın ve iki mililitre TALON reçinesi ekleyin. Süspansiyonun 105 rpm dönüş ile bir saat inkübe etmesine izin verin. Şimdi, reçineyi hasat edin ve 250 mililitre IMAC tamponu A ile yıkayın ve ardından 500 mililitre IMAC tamponu B ile yıkayın. IMAC tamponu C kullanarak His6 etiketli proteini elüatı önceden dengelenmiş bir boyut dışlama kolonuna enjekte edin ve yaklaşık 87.7 mililitrede ortaya çıkan FKBP12 zirvesini toplayın.

SDS-PAGE ile proteinin saflığını değerlendirin ve gerektiği gibi bir araya getirin ve konsantre edin. Çok kuyulu plaka dizisini kurmak için, önce boyut dışlama kromatografisi için kullanılan aynı tamponda 100 nanomolar saflaştırılmış FKBP12 çözeltisi hazırlayın. Agrega oluşumunu önlemek için 13.000 rpm'lik hızlı bir sıkma ile sonikat ve santrifüj

Şimdi, seyreltilmiş proteinin 100 ila 200 mikrolitresini cam tabanlı sekiz oyuklu bir gözlem odasına pipetleyin. BB dimerizeratörü 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nanomolar nihai konsantrasyonlara ekleyin. Referans olarak, potansiyel toplama ve çökelme etkilerini değerlendirmek ve aynı edinme ayarlarıyla monomer için bir parlaklık değeri elde etmek için tek başına 100 nanomolar mVenüs'ten oluşan bir çözelti hazırlayın.

Dijital dedektörler veya iyi karakterize edilmiş analog dedektörlerle donatılmış ve elde edilen her piksel için sabit bir bekleme süresi tutabilen herhangi bir ışık taramalı mikroskop konfokal sistemi kullanılabilir. Floresan korelasyon spektroskopisi için tasarlanmış yaka düzeltme suya daldırma objektifini seçin. Şimdi, yaka düzeltme suya daldırma hedefine bir damla su ekleyin.

Sekiz kuyulu gözlem odasını sahneye monte edin. 514 nanometre lazeri açarak ve objektifin çıkışında 20 ila 100 nanowatt güce ayarlayarak uyarma ışını yolunu ayarlayın. Bir HyD dedektörünü açın.

Foton sayma yapabilen dedektörler tercih edilir. 520 ila 560 nanometre arasında emisyon penceresini seçin. Çekim modu için 16 x 16 piksel kullanın.

Piksel bekleme süresini, kare süresi protein difüzyonundan daha uzun ve piksel bekleme süresi çok daha kısa olacak şekilde ayarlayın. Bu, bu gösteride kullanılan sistem için bekleme süresinin yaklaşık 13 mikrosaniyeye ayarlanmasına karşılık geldi. İğne deliğini, yaklaşık 545 nanometrelik karşılık gelen emisyon için bir Airy ünitesine ayarlayın.

xy zaman edinme modunu seçin ve edinme ve kuyu başına alınacak kare sayısını seçin. Şimdi, piksel boyutunu yaklaşık 120 nanometre olarak ayarlayın. Sistem yüksek verim modu ile donatılmışsa, süreci otomatikleştirmek için her bir kuyunun koordinatlarını ve kuyu başına satın alma sayısını tanıtın.

Sistem bir perfüzyon sistemi ile donatılmışsa, BB solüsyonunu yükleyin ve 10.000 görüntü elde ederken dimerizasyon kinetiğini değerlendirmek için perfüzyonu 5.000. kareden hemen sonra başlayacak şekilde programlayın. Doğru kuyuyu seçin ve çözüme odaklanın. Ardından, alımı başlatın ve elde edilen görüntü yığınını TIFF biçiminde kaydedin.

100 nanometre çözeltisinde saflaştırılmış FKBP12 mVenüs'ün 20.000 görüntüsünün dizileri, protokol bölümünde belirtildiği gibi elde edildi. İlk karenin yoğunluğu, trendi kaldırılmış görüntünün ortalama yoğunluk profili ile birlikte gösterilir. Düzgün filtreleme olmadan ve düzgün filtreleme ile parlaklık da gösterilir.

10.000 çerçeve elde edildikten sonra, homojenleştirici ilaç BB, elde edilirken çözeltiye ilave edildi. Her ardışık 5.000 kare serisi analiz edildi. BB ilavesinden beş dakika sonra ortalama parlaklık 1.010 idi, bu da iki kat artış, bu da bir FKBP12 dimerini gösteriyor.

İşlemin kinetiği, BB ilavesi ile tam FKBP12 dimerizasyonu arasında yaklaşık iki dakikalık bir gecikme olduğunu gösterir. Protein-protein etkileşimlerini in vitro olarak değerlendirmenin önemli bir yönü, etiketli proteininizin üretilmesi ve saflaştırılmasıdır. İlgilendiğiniz etiketli proteinden küçük miktarlarda sahip olduğunuzdan ve proteininizin analizinize göre toplanmadığından emin olun.

Bu prosedürü takiben, ayrışma sabitleri veya difüzyon katsayıları gibi ek soruları yanıtlamak için yüzey plazmon rezonansı veya floresan korelasyon spektroskopisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra biyofizik alanındaki araştırmacıların canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini ayrıntılı olarak keşfetmelerinin önünü açtı. Protein saflaştırması için reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük, eldiven gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.