Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar

Bu protokolün genel amacı, fonksiyonel çalışmalar için nötrofil türevi mikropartikülleri izole etmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, kanser, iltihaplanma ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere farklı fizyolojik süreçlerde hücre-hücre iletişiminde ekzo-hücre veziküllerinin veya mikropartiküllerin rolü hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, nispeten hızlı, uygun maliyetli olması ve fonksiyonel varlıklardaki mikropartiküllerin veya mikro veziküllerin p'henotipik bileşiminin değerlemesine izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Ariel Finkielsztein ve laboratuvarımda bir lisans öğrencisi olan Joseph Lee olacak. Murin kemik iliği polimorfonüberkül veya PMN hücrelerinin yoğunluk gradyanlı ayrılması için, önce üç mililitre taze hazırlanmış, oda sıcaklığında, mililitre başına 1.077 gram, üç mililitre taze hazırlanmış, oda sıcaklığında, mililitre başına 1.119 gram yoğunluk çözeltisi üzerinde yavaşça katmanlayın kemik iliği hücresi numuneleri başına 15 mililitrelik konik tüpte. Daha sonra, buz gibi soğuk PBS'de bir mililitre taze izole edilmiş kemik iliği hücresini her tüpün en üst yoğunluk gradyan katmanına yerleştirin ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile ayırın.

Ayırmanın sonunda, PMN bantlarını bozmadan, PBS ile her tüpteki üst yoğunluklu gradyan katmanları arasındaki arayüzlerdeki mononükleer hücre katmanlarını dikkatlice çıkarın. Bir transfer pipeti kullanarak, PMN katmanlarını numune başına 15 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın ve 0,1 mikron dökme boyutunda filtrelenmiş PBS ile her tüpteki son hacmi 15 mililitreye getirin. PMN'leri santrifüjleme ile peletleyin, ardından tüp başına iki mililitre taze filtrelenmiş PBS'de ikinci bir santrifüjleme yapın.

Ardından, saymak için peletleri bir mililitre taze filtrelenmiş PBS'de yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti, 10 milyon hücre başına ilgi uyarıcısı ile desteklenmiş 100 mikrolitre 0.1 mikron dökme boyutunda filtrelenmiş HBSS'de yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin.

Stimülasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücresiz süpernatanları numune başına 1.5 militer yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir hücre kalıntısını gidermek için süpernatanları santrifüjleyin ve temizlenen süpernatanları yeni ultra santrifüj tüplerine aktarın, ardından süpernatanları ultra santrifüjleyin ve peletlenmiş mikropartikülleri daha fazla deneysel analize kadar 80 santigrat derecede parafin sızdırmaz ultra santrifüj tüplerinde saklayın. Mikropartikülleri fare kolonuna uygulamak için, önce tamamen anestezi uygulanmış bir fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve kolonun dorsal tarafı boyunca üç ila beş yüzeysel yara oluşturmak için biyopsi forsepsleri ve yüksek çözünürlüklü bir kamera ile donatılmış bir endoskop kullanın.

Tam iyileşme sağlanana kadar izleme ile fareyi kafesine geri koyun. 24 saat sonra, anestezi altında açılan yaraların görüntülerini elde etmek için endoskopu kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitre HBSS içinde yeniden süspanse edilmiş deneysel bir PMN mikropartikül hacmini doğrudan her bir yara bölgesine uygulamak için kolonoskopi tabanlı bir mikro enjeksiyon sistemi kullanın.

PMN mikropartiküllerinin boyut heterojenliği, mikropartiküllerin bilinen boyutlu akış sitometri boncuklarıyla karşılaştırılmasıyla değerlendirilebilir. Gösterildiği gibi, ilgilenilen proteinlerin mikropartiküller tarafından ekspresyonu da akış sitometrisi ile incelenebilir. Bu deneyde, aktivatör ile uyarılan PMN türevi mikropartiküller tarafından anahtar enflamatuar ve anti-enflamatuar moleküllerin ekspresyonu immünoblot ile değerlendirildi.

PMN mikropartiküllerinin epitel hücre iyileşmesi üzerindeki etkileri, önceden belirlenmiş zaman noktalarında in vitro olarak çizik yaralı epitel tek tabakalarının görüntü elde edilmesiyle ve ayrıca in vivio olarak biyopsi forseps yaralanmasından sonra izlenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse, PMN'den türetilmiş mikropartiküller dört saat içinde izole edilebilir. Bu prosedürü denerken, stimülasyondan önce, erken aktivasyonu ve mikropartiküllerin kaybını önlemek için PMN'nin buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, çeşitli uyarıcı koşullar altında veya farklı orijin hücrelerinden mikropartikül içeriğini tanımlamak için akış sitometrisi, immünoblotlama ve gerçek zamanlı proliferasyon reaksiyonu teknikleri kullanılabilir. Bu teknik, bağışıklık tepkilerinin, bariyer fonksiyonunun, doku hasarının ve onarımının yanı sıra kanserin ilerlemesinde mikropartikül katkısının rolünü incelemek için yararlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, murin mikropartiküllerinin nasıl izole edileceğini ve etiketleneceğini ve mikropartiküllerin in vivo olarak işlevsel bir yara iyileştirici varlıkta nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Canlı hayvanlarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirmeden önce her zaman kişisel koruyucu ekipmanın giyilmesini ve uygun güvenlik eğitimlerinin tamamlanmasını öneren önlemlerin alındığını unutmayın.