Nötrofil İzolasyon Protokolü

Nötrofil izolasyon protokolü. Bu prosedür, bir tam kan numunesi, ekipman, santrifüj ve şişelerden beyaz kan hücrelerini çıkaracaktır. Vorteks efendim iğne ve şırınga şırınga filtresi.

Milli dökme marka MX gv 0.22 Mikrometre malzemeleri. Hank büyüsü ve tuz çözeltisi nötrofil ayrımı iki tür HBSS çözeltisi gerektirir. İnsan serum albümini ile bir çözelti yapmak için kalsiyum klorürlü HBSS kullanılacaktır.

Nötrofilleri askıya almak ve yıkamak için kalsiyum klorür içermeyen HBSS kullanılacaktır. Lütfen bu prosedürde uygun HBSS solüsyonunu kullanmaya özellikle dikkat edin. İnsan serum albümini veya HSA, kan plazmasında pH ve SMO basıncını koruyan bir proteindir.

Sığır serum amalgamat kırmızı hücre lizis tamponu kullanmayın. Bu, Roche Diagnostics, nötrofil İzolasyon Ortamı, NIM Cedar Line Labs Lenf ışığı, Poli ayırma ortamı tarafından üretilmiştir, ışıktan korunur ve en iyi sonuçlar için buzdolabında saklanır. Tüm reaktifler kullanım sırasında oda sıcaklığında olmalıdır.

Deneyden bir saat önce reaktifleri buzdolabından çıkarın. Nötrofil ayrımı için H-B-S-S-H-S-A çözeltisi hazırlayın. HBSS'yi kalsiyum klorür ile şişeye pipetleyin.

HSA'yı şırıngaya çekin. Hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçının. Şırınga iğnesini çıkarın ve filtreyle değiştirin.

Diğer malzemelerinizi hazırladığınızda ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 mililitre tam kan elde ettiğinizde, HSA'yı filtreden HBSS flakon girdabına iki karışıma enjekte edin. Bu, 10 ila 15 mililitre 10 ila sekizinci nötrofil verecektir. Bağışçı, kan örneğini bağışlamadan önceki 24 saat boyunca alkol veya reçetesiz satılan ilaçlar tüketmemiş olmalıdır.

Bunlar ayırma işlemini bozabilir. Tam kan, üreticinin talimatlarına göre bir kısım K, üç EDTA sodyum sitrat veya heparine dokuz kısım kan eklenerek EDTA sitrat veya heparin ile antikoagüle edilebilir. Bu yordamda aşağıdaki adımlar açıklanacaktır.

Plazma ve monositleri ayırın ve çıkarın. Kırmızı kan hücrelerini parçalayan bir nötrofil tabakasını ayırın ve elde edin, nötrofillerin ilk ayrılmasını serbest bırakın. NIM tabakasında nötrofiller elde edin.

Santrifüj tüpünde beş mililitre izolasyon ortamı toplayın. İzolasyon ortamının tüpün daha altına yerleştirilmesi, santrifüj kanı dikkatlice içinden aşağı doğru zorlayacağından, bir filtre görevi görmesine izin verir. Temiz ayırma için NIM üzerine beş mililitre kan koyun.

Çözeltileri karıştırmaktan kaçınmak için çok dikkatli olun. Karıştırma santrifüjünü önlemek için bu adımı yavaş ve dikkatli bir şekilde ve pipet ucunuzu çözünen ortamın yüzeyine yakın olacak şekilde gerçekleştirin. 35 dakika boyunca 500 RCF'de çözüm.

20 ila 25 santigrat derecede, kan altı farklı banda ayrılmalıdır. Altı bant, plazma monositleri, izolasyon ortamı, nötrofiller, daha fazla izolasyon ortamı ve alttaki kırmızı kan hücresi peletidir. Bu altı bant net ve belirgin değilse, ayırma işlemi temiz değildi ve tekrarlanması gerekecekti.

Kötü ayrılmanın yaygın nedenleri arasında eski izolasyon ortamı, son 72 saat içinde alkol tüketmiş olan donör veya Tylenol veya aspirin gibi başka ilaçlar tüketmiş olan donör yer alır. Plazma monositlerini ve izolasyon ortamını dikkatlice çıkarın ve atın. Bu katmanları sızdırmaz bir tüpe yerleştirin ve mümkün olduğunca çok sayıda nötrofili geri kazanmak için nötrofil tabakasını ve nötrofillerin altındaki tüm izolasyon ortamlarını temiz bir santrifüj dosyasına dikkatlice pipetleyin.

Aşağıdaki katmandan da bazı yalıtım ortamlarını dahil etmek genellikle en kolayıdır. Alt kısımdaki paleti rahatsız etmeyin. İkinci bildirim, nötrofil tabakasını rafine edin.

Nötrofil çözeltisini kalsiyum içermeyen HBSS ile 10 mililitreye seyreltin. Hücre santrifüjünü askıya almak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Nötrofil çözeltisi.

10 dakika boyunca 350 RCF. 20 ila 25 santigrat derecede, tüpün altında nötrofiller ve artık kırmızı kan hücreleri içeren kırmızı bir pelet bulunmalıdır. Supra natini pipetle çıkarın.

Dikkatli ol. alttaki peleti rahatsız etmek için. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak.

Numunedeki kırmızı kan hücreleri şimdi lizis ile yok edilmelidir. Kalan kırmızı kan hücrelerini parçalamak için, yeniden canlandırmak için tüpe iki mililitre kırmızı hücre lizis tamponu ekleyin. Pelet girdabını şişeyi üç ila dört arasında bir ayarda askıya alın.

Nötrofillerin aktive olmasına neden olabileceğinden girdap ayarını dördün üzerine çıkarmaktan kaçının. Damağı çözmek için birkaç saniye girdap yapmak veya girdabı nabız atmak gerekebilir. Lizis çözeltisini 250 RCF'de beş dakika santrifüjleyin.

Numuneye verilen zararı en aza indirmek için yumuşak başlatma seçeneğini kullanın. Supra natini pipetle çıkarın. Parçalama işlemini tekrarlayın.

Gerekirse, nötrofillerin süspansiyonunu serbest bırakın, her tüpe kalsiyum içermeyen 500 mikrolitre HBSS ekleyin. Peleti üç ila dört arasında bir ayarda girdaplayın, kalsiyum santrifüjü olmadan HPSS ile 10 mililitreye seyreltin. Beş dakika boyunca 250 RCF'deki nötrofiller snat'ı aspire eder ve atar.

Peletleri 250 mikrolitre HBSS'de HSA çözeltisi ile, iki kez 10'a altıya kadar tekrar süspanse edin. Mililitre başına nötrofiller tipik olarak toplanır.