Name: Nötrofil İzolasyon Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Keşfedin insan kanından yoğunluk gradyanı yöntemiyle nötrofil izolasyonu. Bu protokol immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında iltihabi bağışıklık yanıtlarını incelemek için güvenilir bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nötrofil İzolasyon Protokolü <ol><li> Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirin. </li><li> 5.0 ml santrifüj tüpüne nötrofil izolasyon medya toplayın. Ayrılması medya üzerindeki kan dikkatlice katman 5.0 ml. Yavaş ve dikkatli bir şekilde ve medya yüzeyine yakın kan ve medya karışmasını önlemek için pipet ile bu adımı gerçekleştirin. </li><li> 20-25 dakika süreyle 35 500 RCF santrifüjleyin ° C Plazma, monositler, izolasyon medya, nötrofiller, daha fazla izolasyon medya ve kırmızı kan hücre pelletini (Şekil 1): kan, 6 farklı bölümlere ayırmalıdır. Bu bantları açık değilse, ayırma işlemi temiz değil ve tekrar edilmesi gerekecektir. </li><li> Bir pipet kullanarak en üst üç katman (plazma, monositler ve izolasyon ortam) dikkatlice çıkarın. Bu katmanlar atın. </li><li> Nötrofil ve nötrofil altındaki izolasyon medya katman dikkatlice pipetle. Çözüm temiz bir santrifüj tüpü içine yerleştirin. </li><li> Ca 2 + Mg / 2 + olmadan HBSS nötrofil çözeltinin 10 ml. Hücreleri askıya alma tüpü birkaç kez ters çevirin. </li><li> 10 dakika için 350 RCF nötrofil çözüm santrifüjleyin. Kırmızı bir pelet nötrofil ve kalan kırmızı kan hücreleri (eritrositler) içeren tüpün alt kısmında mevcut olmalıdır. Dikkatle pelet rahatsız olmadığını ifade eden bir pipet ile süpernatantı. </li><li> Kalan eritrositlerde lyse için tüpe 2 ml Kırmızı Hücre Lizis Tampon ekleyin. Pelet, vorteks bir ayarda 3-4 flakon tekrar süspansiyon. Nötrofil aktive neden olabilir bu yana, 4 yukarıdaki vorteks ayarını artırarak kaçının. Birkaç saniye vorteks için gerekli olabilir, ya da pelet çözmek için vorteks &quot;darbe&quot;. </li><li> 5 dakika boyunca 250 RCF tüp santrifüjleyin. Pipet ile süpernatantı. Gerekirse parçalama işlemi tekrarlayın. </li><li> Ca 2 + Mg / 2 olmadan 500 ul HBSS ekle + Her bir tüp . Yine, bir ayarda 3-4 pelletini tekrar karıştırın. Ca 2 + Mg / 2 + olmadan HBSS ile 10 ml ye tamamlanır. </li><li> 5 dakika boyunca 250 RCF tüpler santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve atın. </li><li> 250 ul HBSS / HSA Çözüm (2% HSA) pelletini tekrar. Hücreler daha sonra sayılır ve istenilen konsantrasyon için ayarlanmış olabilir. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

Yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi tam kan sodyum metrizoate ve Dextran&#39;ın 500 karışımı kullanarak insan nötrofil izole etmek için kullanılır. Bu yöntem, nötrofil ayrılması için Ferrante ve Thong (1980) tarafından güncellenmiştir Boyum (1968) tarafından mononükleer lökosit ayırma yöntemi dayanıyor. Bir bağış toplama sonra, tam kan, EDTA, sitrat veya heparin ile antikoagüle olabilir. Kısa ömürlü olduğundan, nötrofil toplama 2-4 saat içinde kullanılmalıdır. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılma...

<table><tbody><tr><td>Lymphocyte Poly(R)</td><td>Reaktif</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>Alternatif olarak PolymorphprepTM kullanılabilir</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür içermeyen Hank&amp;rsquo;s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Serum Albümini</td><td>Reaktif</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu</td><td>Reaktif</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Araç</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteksleyici</td><td>Araç</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetleri ve pompası</td><td>Araç</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Reaktif</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Lymphocyte-Poly (R) için alternatif reaktif</td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi</td><td>Diğer</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0.22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, gama sterilize edilebilir</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür içeren Hank&amp;rsquo;s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nötrofil İzolasyon protokolü

Neutrophil Isolation Protocol

Polimorfonükleer nötrofil granülositler (PMN), insanlarda ve inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasındaki en bol lökosit vardır. Inflamasyon kilit rol nedeniyle, hareketlilik, sitokin üretimi, fagositoz ve tümör hücre mücadele gibi nötrofil işlevlerini yoğun olarak çalışılmaktadır. Nötrofil kısa ömürlü ve toplama 2-4 saat içinde kullanılması gereken bu yana özellikle nötrofil özel fonksiyonlar karakterize için diğer kan hücreleri ayırarak, temiz, hızlı ve güvenilir bir yöntem, in vitro çalışmalar için arzu edilir. Burada, piyasada bulunan sodyum metrizoate ve Dextran&#39;ın 500 karışımı ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılması ve kalıntı eritrositlerin parçalanması üzerine katman tam kan oluşur. Hücreler daha sonra, yıkanmış, sayılır ve istenilen konsantrasyon için tampon yeniden süspanse. Doğru yapıldığında, bu yöntem&gt;&gt;% 95 canlılığı% 95 nötrofil örnekleri verim görülmüştür.

Nötrofiller inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasında olup, görevlerini ve mekanizmalar in vitro yoğun çalışmalar yapılmıştır. Biz piyasada bulunan ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Nötrofil polimorfonükleer granülositler (PMN), insanlardaki en bol lökositlerdir ve enflamasyon bölgesine ulaşan ilk hücreler arasındadır...

Nötrofil izolasyon protokolü. Bu prosedür, tam kan örneğinden beyaz kan hücrelerini ekstrakte etmek için santrifüj ve tüpler kullanır. Vortex karıştırıcı, iğne ve şırınga, şırınga filtresi.Millipore marka MX gv 0,22 Mikrometre materyalleri. Hank dengeli tuz çözeltisi ile nötrofil ayrıştırma işlemi iki çeşit HBSS çözeltisi gerektirir. Kalsiyum klorür içeren HBSS, insan serum albüminli bir çözelti hazırlamak için kullanılacaktır.Nötrofilleri süspanse etmek ve yıkamak için kalsiyum klorür içermeyen HBSS kullanılacaktır. Lütfen bu prosedürde uygun HBSS solüsyonunu kullandığınızdan emin olun. İnsan serum albümini veya HSA, kan plazmasında pH'ı ve SMO basıncını koruyan bir proteindir.Sığır serumu amalgamat kırmızı hücre lizis tamponu kullanmayın. Bu ürün Roche Diagnostics tarafından üretilmiştir; nötrofil izolasyon medyumu NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly ayırma medyumu ışığa karşı korunmalı ve en iyi sonuçlar için buzdolabında saklanmalıdır. Tüm reaktifler kullanım sırasında oda sıcaklığında olmalıdır.Reaktifleri deneyden bir saat önce buzdolabından çıkarın. Nötrofil ayrıştırma işlemi için HBSS-HSA çözeltisini hazırlayın. Kalsiyum klorür içeren HBSS'yi viyale pipetleyin.HSA'yı şırıngaya çekin. Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Şırınga iğnesini çıkarın ve yerine filtreyi takın.HSA'yı filtre aracılığıyla HBSS şişesine enjekte edin ve vorteksle iki kez karıştırın; diğer malzemeleriniz hazır olduğunda ve oda sıcaklığındayken, yaklaşık 15 mililitre tam kan temin edin. Bu işlem, 10⁸ nötrofil içeren 10 ila 15 mililitre ürün sağlayacaktır. Donör, kan örneğini vermeden önceki 24 saat boyunca alkol veya reçetesiz ilaç kullanmamış olmalıdır.Bunlar ayırma işlemini bozabilir. Tam kan, bir birim K üç EDTA sodyum sitrat veya üretici talimatlarına uygun olarak heparin ekleyerek dokuz birim kan ile antikoagüle edilebilir. Bu prosedürde aşağıdaki adımlar açıklanacaktır.Plazmayı ve monositleri ayırarak uzaklaştırın. Eritrositleri lizleyerek kırmızı kan hücrelerinden arındırılmış nötrofil tabakasını ayırın ve ilk ayırmada nötrofilleri süspansiyon haline getirip elde edin. NIM tabakasındaki nötrofilleri toplayın.Santrifüj tüpüne beş mililitre izolasyon medyası toplayın. İzolasyon medyasını tüpün daha altına yerleştirmek, santrifüjün kanı dikkatlice aşağı doğru itecek olması nedeniyle medyanın bir filtre görevi görmesini sağlar. Temiz bir ayrım için NIM üzerine beş mililitre kan ekleyin.Çözeltilerin birbirine karışmamasına çok dikkat edin. Santrifüjleme sırasında karışmayı önlemek için bu adımı yavaşça, dikkatle ve pipet ucunuzu ayırıcı ortamın yüzeyine yakın tutarak gerçekleştirin. Çözeltiyi 500 RCF'de 35 dakika boyunca santrifüjleyin.20 ila 25 °C'de, kan altı belirgin banda ayrılmalıdır. Bu altı bant; plazma, monositler, izolasyon medyumu, nötrofiller, tekrar izolasyon medyumu ve en altta kırmızı kan hücresi peletidir. Eğer bu altı bant net ve belirgin değilse, ayırma işlemi temiz gerçekleşmemiş demektir ve işlemin tekrarlanması gerekir.Kötü ayrışmanın yaygın nedenleri arasında, eski izolasyon medyası, donörün son 72 saat içinde alkol tüketmiş olması veya donörün Tylenol ya da aspirin gibi diğer ilaçlar kullanmış olması yer alır. Plazma monositlerini ve izolasyon medyasını dikkatlice uzaklaştırın ve atın. Bu tabakaları sızdırmaz bir tüpe yerleştirip dikkatlice atın; mümkün olduğunca fazla nötrofil geri kazanmak için nötrofil tabakasını ve nötrofillerin altındaki tüm izolasyon medyasını temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin.Alt katmandaki izolasyon ortamlarından bir miktar eklemek genellikle en kolay yöntemdir. Alttaki pellet'i rahatsız etmeyin. İkinci deklarasyon, nötrofil katmanını rafine edin.Nötrofil solüsyonunu kalsiyum içermeyen HBSS ile 10 mililitreye tamamlayın. Hücreleri süspand etmek için tüpü birkaç kez altüst edin ve nötrofil solüsyonunu santrifüjleyin.10 dakika boyunca 350 RCF. 20 ila 25 derece santigrat sıcaklıkta, tüpün dibinde nötrofilleri ve kalıntı eritrositleri içeren kırmızı bir pelet oluşmuş olmalıdır. Süpernatantı pipetle uzaklaştırın.Dikkatli olun; eritrositleri liz ederken dipteki peleti dağıtmamaya özen gösterin.Numunedeki kırmızı kan hücreleri artık lizis yoluyla parçalanmalıdır. Kalan kırmızı kan hücrelerini liz etmek için, tüpe iki mililitre kırmızı hücre lizis tamponu ekleyerek yeniden süspandirin. Peleti süspande etmek için tüpü üç ila dört ayarında vortekslleyin.Nötrofillerin aktive olmasına neden olabileceği için vorteks ayarını dörtten yukarı çıkarmaktan kaçının. Peleti çözmek için birkaç saniye vortekslenmek veya vorteksin kısa aralıklarla (puls) çalıştırılması gerekebilir. Lizis solüsyonunu 250 RCF'de beş dakika santrifüjleyin.Numuneye verilen zararı minimize etmek için yumuşak başlatma (soft start) seçeneğini kullanın. Üst fazı (süpernatantı) pipetle alın. Lizis işlemini tekrarlayın.Gerekirse, nötrofil süspansiyonunu serbest bırakmak için her tüpe 500 microliters kalsiyumsuz HBSS ekleyin. Peleti üç ila dört ayarında vorteksleyin, kalsiyumsuz HPSS ile 10 milliliters hacme seyreltin ve santrifüjleyin. Nötrofilleri 250 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, ardından üst fazı aspire ederek atın.Pelleti, 250 µL HSA içeren HBSS çözeltisi ile yeniden süspanse edin; genellikle mililitre başına 2 × 10⁶ nötrofil toplanır.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, nötrofil-biyofilm etkileşimini incelemek için bir in vitro testi göstermektedir. Biyofilm ve izole nötrofillere gömülü patojenik bakteriler, floresan etiketler kullanılarak etiketlendi ve nötrofillerin immün yanıtı ve bakterilerin immün yanıtından kaçışı bir floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.

Nötrofiller ve Biyofilm Arasındaki Etkileşimi İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET'ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Nötrofiller sadece istilacı mikroorganizmalara karşı konak savunmasında değil, aynı zamanda tümör hücrelerinin immün sürveyansında da önemli bir rol oynarlar. Burada, anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ile ilgili teknikleri ve in vitro ve in vivo olarak anti-tümör nötrofil fonksiyonunu izleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Biz burada elde edilmesi ve nötrofil kaynaklı dev fagositler bir yeni özelliği alt popülasyonunu belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler taze insan kan nötrofillerinin kültüre geliştirmek ve fagositoz, Otofaji, gayet büyük bir boyut ve uzun ömrü ile karakterize edilir. Bu yöntem ayrıca, bu benzersiz nötrofil türevi alt popülasyonu araştırılması gereklidir.

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI'nin Gelişimi ve Kimlik İn Vitro

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu protokol, nötrofillerin tam kan, buffy coats veya lökferez zarlarından izole edilmesinin, iyi verim, yüksek saflık ve minimum hücre aktivasyonu elde edilmesinin bir yöntemini detaylandırmaz. Yüksek kaliteli/saflıkta nötrofil preparatı elde etmek için gradyan saflaştırma, kırmızı kan hücresi (RBC) sedimilasyonu ve RBC lizizini kullanıyoruz.

İnsan Nötrofillerinin Tam Kan ve Buffy Coats'tan İzolasyonu

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Burada, manyetik izolasyon (negatif seçim) ve süreksiz yoğunluk gradyan ortamı kullanarak düşük ve normal yoğunluklu nötrofillerin tam kandan izole edilmesi için güvenilir bir yaklaşım sunuyoruz. Yüksek saflıkta hücrelerin (%≥93) el değmeden izolasyonunu sağlayarak, sağlık ve hastalıktaki rollerini anlamak için çok önemli olan nötrofil alt popülasyonlarının doğru aşağı akış analizini kolaylaştırır.

Tam Kandan Düşük ve Normal Yoğunluklu Nötrofillerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Keşfedin insan kanından yoğunluk gradyanı yöntemiyle nötrofil izolasyonu. Bu protokol immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında iltihabi bağışıklık yanıtlarını incelemek için güvenilir bir temel sunar.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Daha fazla video keşfet