İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI'nin Gelişimi ve Kimlik İn Vitro

Bu yöntemin genel amacı, enflamatuar ve antiinflamatuar immün yanıtlardaki rollerinin araştırılması için dolaşımdaki insan nötrofillerinden türetilen in vitro kültürlenmiş dev fagositlerin üretilmesi ve tanımlanmasıdır. Bu yöntem, uzun vadeli kültür koşullarını sürdürmek için insan nötrofillerinden gelişen dev fagositlerin yeni bir alt popülasyonunu elde etmek ve tanımlamak için kullanılabilir. Bu teknik, dev fagositlerin önemini ve işlevlerini daha fazla araştırmak ve aktivasyonları ve plastisiteleri ile ilgili temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Prosedürü göstermek, her ikisi de laboratuvarımdan araştırma asistanımız Eva Leder ve doktora sonrası Oksana Rogovoy olacak. Sağlıklı bir genç gönüllüden en az 40 mililitre venöz kan elde etmek için steril bir kafa derisi damarı seti kullanın. Ardından kanı biyogüvenli laminal akış başlığında nazikçe karıştırın.

Tam kan örneğinin 10 ila 12 mililitrelik alikotlarını,% 2 ısıyla etkisiz FCS içeren önceden ısıtılmış ION içermeyen PBS ile 24 mililitrelik bir nihai hacme seyreltin. Daha sonra, kan örneği alikotu başına bir 50 mililitre steril polipropilen konik santrifüj tüpünün dibine %12 mililitre polisokroz 1119 ekleyin, ardından polisokroz 1119 gradyan çözeltisinin üzerine 12 mililitre polisokroz 1077'nin dikkatli bir şekilde katmanlanması. Seyreltilmiş kandan 24 mililitreyi yoğunluk gradyan çözeltilerinin ayrı tüplerine dikkatlice pipetleyin ve hücreleri santrifüjleme ile ayırın.

Ortaya çıkan iki opak tabaka gözlenmelidir. Her tüpteki sıvıyı mononükleer hücre tabakasının 0,5 santimetre yukarısına kadar atın. Daha sonra mononükleer hücreleri her numuneden tek bir yeni tüpe aktarın.

Daha sonra, kalan sıvıyı polimorfonükleer hücrenin veya PMN tabakasının 0,5 santimetre yukarısına kadar atın ve PMN'leri her numuneden farklı bir yeni tüpe aktarın. PMN'leri,% 2 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS içeren 30 mililitre PBS'lik bir son hacimde yıkayın, ardından kırmızı kan hücrelerinin üç mililitre steril buz gibi hipotonik% 0.2 sodyum klorür ile parçalanmasını izleyin. Buz üzerinde 30 saniye sonra, üç mililitre steril buz soğuk% 1.6 sodyum klorür ile izotonisiteyi geri yükleyin.

Daha sonra, ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS ile desteklenmiş altı mililitre 37 santigrat derece RPMI 1640 Ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri, %10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS ile desteklenmiş dört mililitre RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, konsantrasyonu mililitre kültür ortamı başına 1.25 ila 1.5 kez 10 ila altıncı PMN'ye ayarlayın ve 24 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına oyuk başına bir mililitre hücre kaplayın.

Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve kültürleri, ortamın yarısının her üç günde bir% 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS ile desteklenmiş taze RPMI 1640 Ortamı ile nazikçe değiştirerek besleyin. Nötrofiller, kültürden sonraki yedi gün içinde dev fagositlere farklılaşacaktır. Kültürün yedinci gününde, ortamın yarısını her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın.

Ardından, hafifçe yapışmış dev fagositleri çıkarmak için kalan ortamı sağlam bir şekilde pipetleyin. Ayrılan hücreleri her bir tedavi grubunun iki ila dört oyuğundan ayrı ayrı 15 milimetre konik tüplere aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın, peletleri tüp başına 100 ila 120 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra tedavi grubu başına iki ila üç tutucuyu mikroskop slaytları, filtre kartları ve hunilerle donatın.

Daha sonra, her tüpten gelen tüm hücre hacmini uygun Cytospin hunisine ekleyin. Daha sonra tutucuları bir Cytospin'e yükleyin ve hücreleri slaytların üzerine döndürün. Bükülmüş slaytları 10 dakika kurutun.

Ardından, hücrelerin etrafına hidrofobik bir bariyer çizmek için suya dayanıklı bir işaretleyici kullanın ve numuneleri oda sıcaklığında kimyasal bir başlık altında %4 paraformaldehit ile sabitleyin. 10 dakika sonra, slaytları yıkama başına yaklaşık 100 mikrolitre PBS ile üç kez kısaca durulayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 0.5 Triton X-100 ile hücrelere geçirgen hale getirin ve ardından gösterildiği gibi beş PBS yıkaması yapın.

Spesifik olmayan bağlanmayı uygun bir süre boyunca RPMI 1640 Medium'da% 10 normal keçi serumu ile bloke edin ve ardından tek bir PBS yıkaması yapın. Şimdi, nemi korumak için kutuya az miktarda su ekleyin ve ardından hücreleri, nemlendirilmiş karanlık bir odada gece boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 100 mikrolitre uygun birincil antikor ile etiketleyin. Ardından, tek bir PBS yıkaması yapın ve ardından uygun floresan konjuge ikincil antikoru ekleyin.

Işıktan korunan oda sıcaklığında 40 dakika sonra, fazla antikoru çıkarmak için numuneleri yıkayın ve slaytları numune başına bir damla montaj ortamı ve bir lamel ile monte edin. Slaytları, 30X emersiyon yağı hedefi altında 120 ila 40 dakika içinde konfokal lazer taramalı floresan mikroskobu ile analiz edin. Ardından uygun yazılımı kullanarak hücre alanını, floresan yoğunluğunu ve ortak lokalizasyonu hesaplayın.

Bu görüntülerde, kültürden sonraki yedi gün içinde dev fagositlere nötrofil gelişimi gözlemlenebilir. Otofagositoz, nötrofil kültüründen 90 dakika sonra, floresan membran boyaları ile dört ila yedi gün arasında büyük ölçüde genişlemiş hücre çapı ile belirgindir. Bununla birlikte, nötrofil kültürleri GM-CSF ve IL-4 ile desteklenirse, hücreler genel olarak daha küçük bir çap ve dendritik hücre benzeri hücrelere benzeyen sitoplazmik çıkıntılar gösterir.

Dev fagositlerin kültür günlerinin üç ila dört ve beşinci günlerindeki hızlandırılmış mikroskobu, çevredeki nötrofil kalıntılarını ve kalıntılarını aktif olarak yutan sınırlı bir hareket kapasitesine sahip hiç veya hafifçe yapışık hücreler ortaya çıkarmaz. Bu karışık monosit nötrofil kültüründe, aktif olarak sürünen bir makrofajın göçü, aynı kültür kuyusunda floresan olarak işaretlenmiş dev bir fagojinin neredeyse durağan hareketiyle karşılaştırılabilir. Dev fagositlerin nötrofilik kökeni, nötrofil belirteçlerinin pozitif ekspresyonu ve monositik ve dendritik hücre belirteçlerinin ekspresyonu olmaması ile doğrulanabilir.

Dev fagositler ayrıca bazal reaktif oksijen türleri üretir ve oksidatif patlama ile zimozan ve PMA stimülasyonuna yanıt verir. Bununla birlikte, monositlerin veya nötrofillerin aksine, okside düşük yoğunluklu lipoprotein stimülasyonuna oksidatif patlamalarla da yanıt verirler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik altı ila yedi gün içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, nötrofil kültürlerini beslerken ortamın yarısını nazikçe değiştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bu ilgi çekici hücrelerin ek işlevleri hakkındaki soruları in vitro ve in vivo olarak yanıtlamak için başka boyama teknikleri de uygulanabilir. Bu teknik, nötrofil biyolojisi alanındaki araştırmacıların nötrofil aktivasyonunu ve plastisitesini keşfetmeleri ve bu hücreleri insanlarda fizyolojik ve patofizyolojik durumlarda in vivo olarak tanımlamaları için yol açabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kültürdeki dev fagositleri nasıl elde edeceğinizi ve tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Lütfen insan kanıyla çalışmanın potansiyel olarak bulaşıcı olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve tüm sıvıları atmak ve tek kullanımlık ekipmanı uygun biyolojik tehlike kaplarına atmak gibi önlemlerin bir zorunluluk olduğunu unutmayın.