Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Bu iş akışının genel amacı, ışık mikroskobu ve ardından çok yüksek çözünürlükte bir SEM'de 3D görüntüleme kullanarak bir doku içinde ultrastrüktürel görüntüleme için belirli hedefleri belirlemektir. Burada tanıtılan görüntüleme iş akışı, hücre biyolojisi, gelişim biyolojisi, sinirbilim ve hatta patoloji gibi bir dizi alanda hücresel veya doku üst yapısı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aslında dizi tomografisine dayanan tekniğin ana avantajı, dokuyu seri kesit dizilerine dilimlemenin, başlangıçta orijinal numune hacminin içine gömülmüş olsalar bile hedef yapıları tanımlamayı kolaylaştırmasıdır.

Dizi tomografisi başlangıçta bir sinirbilim bağlamında tanıtıldı, ancak aynı zamanda bakteriler, bitkiler, hayvanlar ve hatta bir patoloji ortamındaki hasta örnekleri dahil olmak üzere çok çeşitli diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler zorlanacaktır çünkü birçok seri bölümü toplamak çok zordur. Ek destek olmadan çalışmak, bölümlerin kaybolmasına veya şeritlerin düzeninin bozulmasına neden olabilir.

Bir kürdana sabitlenmiş birkaç kıldan oluşan küçük bir fırça kullanarak, önceden kesilmiş bir bloğun ön ve arka taraflarını yapışkan bir karışımla dikkatlice kaplayın. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin çünkü bu karışımın çözücüsü saniyeler içinde buharlaşır. Numuneler kururken, silikon gofret parçalarını bıçak teknesine sığacak boyutta kesin ve bunları bir elmas çizici ile işaretleyin.

Ardından, silikon gofreti izopropanol ve tüy bırakmayan doku ile manuel olarak temizleyin. Çıkarılabilir bir yapıştırıcı kullanarak alt tabakayı taşıyıcı plakanın bir ucuna sabitleyin. Ayarlandıktan sonra plazma, hidrofilik bir yüzey elde etmek için hava ile kızdırma deşarjı kullanarak alt tabakayı aktive eder.

Monte edilen alt tabaka bıçak kenarına daha yakın olacak şekilde, taşıyıcıyı alt tabaka tutucusunun kelepçesine yerleştirin. Ardından, bıçak tutucusuna bir jumbo elmas bıçak yerleştirin ve boşluk açısını sıfır dereceye ayarlayın. Ardından bıçak teknesini damıtılmış su ile doldurun.

Bıçağa, numuneden bir ila iki milimetre uzakta olacak şekilde yaklaşın. Ardından, alt tabaka tutucusunun bir ila üç arasındaki vidalarını kullanarak alt tabakayı suya indirin. Su hattının alt tabakanın üst üçte birlik kısmında yer aldığını kontrol edin.

Silikon gofret kullanırken yerden yüksekliği görmek zor olduğundan, alt tabakayı zemine değdiğini hissedene kadar indirin. Ardından, alt tabakayı küçük bir miktar yükseltin. Kesim sırasında ne alt tabakanın ne de taşıyıcının bıçak teknesine temas etmediğinden emin olun.

Ardından, teknedeki su seviyesini ayarlamak için bir şırınga veya pipet kullanın. Dürbünle izlerken, su yüzeyinin tam alanı ultramikrotomun üst ışık aydınlatmasının homojen bir yansımasını gösterene kadar su ekleyin veya çıkarın. Kurulum tamamlandıktan sonra örneği bölümlere ayırmaya başlayın.

Birkaç bölüm kesildiğinde, kesit alma işlemini durdurun ve bir kirpik veya çok yumuşak bir kedi tüyü ile bıçak kenarını hafifçe okşayarak şeridi bıçak kenarından serbest bırakın. Şeridi alt tabakaya doğru hareket ettirin ve alt tabakanın kuru kısmına yapıştırmak için şeridin ilk bölümünü yavaşça itin. Numuneyi bölümlere ayırmaya ve şeritleri alt tabakaya yapıştırmaya devam edin.

Alt tabakanın bir tarafından başlayın ve her yeni şeritle birlikte yavaş yavaş diğerine doğru hareket edin. Alt tabaka tamamen kurdelelerle kaplandığında, alt tabaka tutucunun mikro manipülatör vidalarını kullanarak alt tabakayı bıçak teknesinden nazikçe kaldırın. Şerit dizisini kurumaya bırakın ve ardından tozsuz bir ortamda saklayın.

Kuruduktan sonra, yapışkanla monte edilmiş alt tabakayı mümkün olan en kısa sürede taşıyıcıdan çıkarın. Ardından, numunenizi ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ışık mikroskobu için boyayın ve görüntüleme yapın. Ardından, numuneyi elektron mikroskobu için boyayın ve yapışkan bir karbon ped ile alüminyum saplamalara monte edin.

Şimdi bu dizileri alan emisyon taramalı elektron mikroskobunda görüntüleyin. Şarjı önlemek için, üç kV veya daha düşük birincil elektron enerjileri ve 50 ila 800 pikoamper arasında bir ışın akımı kullanın. ITO kaplı cam kapak kızaklarını kullanırken, iletken yüzeyi bakır bant ve gümüş boya ile mikroskop taşıyıcısına bağlayın.

Hiyerarşik olarak görüntüleme kademesindeki ilk adım, tek tek bölümlerin tanınabileceği şekilde diziye genel bir bakış oluşturmaktır. Öncelikle, her köşenin düşük büyütme oranında, yaklaşık 100x boyutunda bir görüntüsünü grafiklendirerek dizinizin dört köşesini tanımlayın, ardından tüm diziyi kapsayan bir yatırım getirisi oluşturun. Aşağıdaki parametrelerle bu ROI'ye bir görüntüleme protokolü atayın.

Yaklaşık 0,2 mikrosaniyelik kısa bir bekleme süresi kullanarak yüksek hızlı görüntüleme için ikincil elektron dedektörünü kullanın. Büyük bir görüntü piksel boyutu ve 2000 x 2000 piksellik bir döşeme boyutu seçin. Sonuç çok gürültülü bir görüntüdür, ancak burada bile kesit içindeki doku görülebilir.

Ardından, yalnızca ilk bölümdeki dokunun ana hatlarını çizen bir ilgi alanı oluşturarak bir bölüm kümesi oluşturun. Damga aracını kullanarak sonraki tüm bölümlere klonlayın. Bükülmüş şeritlere uyum sağlamak için gerektiğinde ilgilenilen bölgeleri döndürün.

Dokunun alt yapısını en iyi gösteren bölüme bir protokol atayın. Burada, 60 nanometrelik bir ara piksel boyutu, 12000 x 12000 piksellik bir döşeme boyutu ve 3.2 mikrosaniyelik bir bekleme süresi kullanıldı. Düşük kalite nedeniyle, daha küçük bir piksel boyutu ve daha hassas bir dedektör kullanılarak seçilen birkaç hücreyi özetleyen ikinci bir bölüm seti oluşturuldu.

Artık iki hedef hücreyi çok iyi tanımak mümkün. Daha yüksek çözünürlüklü SEM görüntüleme için hedef yapıyı içeren bölüm kümesi içinde bir site kümesi oluşturun. İlgi alanını, aşamalı hassasiyeti hesaba katacak kadar büyük yapın.

Sitelerin konumlarını kontrol edin ve ayarlayın. Birçok bölüm görüntülendiğinde otomatik ayarlama gereklidir. İlgilenilen bölgeleri, merkezin yapısal detay olmadan boş malzemeye, örneğin vakuollere oturmayacak şekilde yerleştirilmesi önemlidir.

Ardından, otomatik odaklama ayarlarını tanımlayın ve görüntülenecek alana yakın olan küçük bir ilgi alanındaki bir şeridin uzunluğu boyunca görüntüleme performansını kontrol edin. Ardından, yüksek çözünürlüklü SEM alımı için bir görüntüleme protokolü tanımlayın. Membran bölmelerini görmek için, üç ile beş nanometre arasında bir görüntü piksel boyutu seçin.

Görüntünün çok gürültülü olmaması için dedektöre bağlı olarak bir bekleme süresi seçin. Sahne alanının bu ve bu bölümün kaydedilmesi arasında büyük bir mesafe kat etmesi gerektiğinden, protokolü denetle seçeneğini kullanarak odak değerlerini her şeridin en azından ilk bölümünde tanımlayın. Ardından, tüm hedef ilgi alanları dizisi üzerinde otomatik SEM görüntülemeyi başlatın.

Bittiğinde, elde edilen verileri tercihen TIF formatında bir görüntü serisi olarak dışa aktarın. Görüntü serilerini sanal bir yığın olarak Fiji'ye aktarın. Ardından, alanı ilgilenilen yapıya mümkün olduğunca yakın bir şekilde kırparak daha sonraki işlemler için yığını kırpın.

Ayrıca, parlaklığı ve kontrastı ayarlayın ve yığını kaydedin. Kırpıldıktan ve optimize edildikten sonra, Dosya menüsünden yeni bir TrakEM açın. Görüntü alanına sağ tıklayın ve yığını katman başına bir dilim olacak şekilde TrakEM'e aktarın.

Sağ tıklatarak Katmanları hizala'yı seçin. Mod olarak en küçük kareler'i seçin, aralığı ilkinden sonuncusuna ayarlayın ve referans olarak hiçbiri'ni seçin. Ardından, varsayılan ayar değerlerini seçin ve istenen dönüştürme olarak Rijit'i seçin.

Kayıt tamamlandığında ve tatmin edici olduğunda, sağ tıklayıp Dışa Aktar'ı seçerek hizalanmış veri kümesini kaydedin. Düz bir görüntü oluşturun, ilk görüntüden son görüntüye kadar olan aralığı ayarlayın ve yazılımın ortaya çıkan yığını göstermesine izin verin. İşiniz bittiğinde, yığını TIF biçiminde kaydedin.

Hazırlıktan sonra, kesit dizisi, birkaç seri bölüm şeridinden oluşan bir dizi olarak görünür. Bu bölüm, propidyum iyodür ile boyanmış bir arabidopsis kök ucuna genel bir bakış göstermektedir. Bu örneğin sıralı bölümleri, protokolde açıklandığı gibi hizalandı ve örneği 3B olarak tek bir film dosyası olarak göstermek için birleştirildi.

Burada, daha sonra SEM'de nanometre çözünürlükte görüntülenecek olan iki hedef hücre görülebilir. Uranil asetat ve kan sitrat ile ek boyamanın ardından, diziler elektron mikroskobunda görüntülendi. Bu statik görüntü, ilk olarak 20 nanometre çözünürlükte ve ikinci görüntüleme turunda beş nanometre çözünürlükte görüntülenen örnek kesiti göstermektedir.

Burada, elektron mikroskobundan alınan 210 ardışık görüntü, protokolde açıklandığı gibi hizalandı ve kırpıldı. Video sadece iki hücreyi hedef alıyor ve hücrelerin içindeki vakuollerin nasıl düzenlendiğini ve bazen 3D olarak nasıl bağlandığını gösteriyor. Burada gösterilen SEM'deki dizilerin otomatik hiyerarşik görüntülemesi, tüm diziye genel bakıştan hücre altı ayrıntılara kadar farklı çözünürlük seviyelerinde sorunsuz eşleme sağlayabilir.

En yüksek büyütmede, vakuoller, mitokondri, çekirdek ve endoplazmik retikulum tanınabilir. Ustalaştıktan sonra, kesit şeritlerini tipik bir alt tabaka üzerine yan yana yerleştirmek, düzgün bir şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir. Bu, görüntüleme için bir alt tabaka üzerinde yüzlerce bölüm sağlayabilir.

Bu kadar çok sayıda bölüm için görüntüleme süresi bir mikroskoptan diğerine değişebilir, hatta en sevdiğiniz görüntüleme cihazlarınızın farklı otomasyon seviyeleri varsa daha da fazla değişebilir. Genel iş akışının, standart histo boyama ve hatta kandolüminesans gibi diğer görüntüleme teknikleriyle kolayca birleştirilebileceğini veya büyük hacimlerin artoyapısal görüntülemesi için bağımsız bir araç olarak kullanılabileceğini belirtmek ilginçtir. Bu iş akışının bir başka yönü de kolay erişilebilirliktir.

İlk çalışmalar, ek araçlar veya otomasyon olmadan, yani büyük yatırımlar olmadan yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iş akışı ve ilginç yapıları farklı çözünürlük seviyelerinde büyük bir 3D hacimde hedeflemek ve görüntülemek için çok modlu ve hiyerarşik görüntülemenin nasıl kullanılabileceği hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.