Name: Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, hücresel hedefleri belirlemek için dizi tomografi kullanarak ışık mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu ile hiyerarşik görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilimde yüksek çözünürlüklü 3D yapı analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser grant FKZ 13GW0044 Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma, proje MorphiQuant-3D için desteklenen bir durumdu. Carolin Bartels teknik destek için teşekkür ederiz.

<ol><li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+third+dimension%3A+Volume+electron+microscopy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jmi.12087/full">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li>
<li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Microscopes%3A+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li>
<li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+ultrasructure+lights+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li>
<li>Verkade, P., Müller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerkade%2C+P+%22Methods+in+Cell+Biology+Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+III%22">Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III</a>. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).</li>
<li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescing+the+Electron%3A+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+goes+3D%3A+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li>
<li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+imaging%3A+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38(2016).</li>
<li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper%3A+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).</li>
<li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+Production+of+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li>
<li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060010407/abstract">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li>
<li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
</ol>

KIT substrat sahibinin işlevsel bir model temini için Boeckeler aygıtlar tarafından geri ödeme aldı. Marlene Thaler ZEISS mikroskobu GmbH, bu makalede belirtilen mikroskop sistemleri üretici çalışandır. Ayrıca, ZEISS SEM ve FIB-SEM Araçları için geniş bir alan, 3D görüntüleme uygulamalarında geniş bir yelpazesi için ZEISS Atlas çözüm paketleri gibi belirli çözümler sunmaktadır. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Bir doku Multi-Modal hiyerarşik AT tarafından içindeki belirli hücreleri hedefleme için bir iş akışı gösterilmiştir: reçine gömülü bir örnek, bir özel tasarlanmış substrat tutucu kullanarak iletken bir substrat yerleştirilen seri kesitler, bir dizi içine doğradı. Bir fluorophore ile etiketleme ve FLM görüntüleme sonra yeniden oluşturulan birim hedef hücreleri seçmek için kullanılır. Ek boyama ağır metaller ile kontrast tanıtmak için tur sonra bu hedefleri bir SEM bir otomatik yazılım platformu kullanarak Nano çözünürlükte birkaç yüz bölüm üzerinde görüntüsü.
Birkaç uzun şeritler yoğun dolu diziler üretmek için burada açıklanan benzer bir substrat tutucu gereklidir. Yetenekli ve sabırlı kişi birkaç şeritler bıçak tekne yarı dalmış bir silikon yüzey ekleyin ve kurdeleler yüzey üzerinde oturuyorsun kadar yavaş yavaş su seviyesini düşürerek dizi almak mümkün olabilir. Ancak, bizim deneyim ne zaman belgili tanımlık substrate bıçak tekne (1.3.2 protokolündeki cf. Not) herhangi bir bölümünü dokunuyor oluşumu paramparça için bir eğilim vardır. Buna ek olarak, bu yordam ITO kaplı yüzeyler ile çok daha zor olacaktır: (1) ITO-cam şeffaflık nedeniyle su kenarı kurdele uçlarını iliştirilecek; olduğu görmek zordur ve (2) ITO kaplı yüzey çok parlak silikon gofret kadar kaba olduğu için kurdeleler bölümlerin sırasını böylece yok edip Asansör-out ve birkaç bölümden oluşan daha küçük parçaları savrulabilirsırasında kırmak eğilimindedir.
Tüm iş akışı da korelasyon FLM veri olmadan mümkün olabilir. Bu durumda, veri toplama SEM içinde çeşitli oturumlarda yapılması gerekebilir. İlk 3D yeniden yapılandırma ya da en azından düşük veya orta çözünürlükte veri değerlendirme hedefleri tanımlamak gerekli olabilir. Buna ek olarak, aydınlık alan LM için geleneksel histolojik lekeleri (değil gerektiren FLM) uygulanabilir. Zaten18, ilk kağıt üzerinde gösterdiği gibi diziler üzerinde etiketleme veya genetik olarak flüoresan proteinleri (XFPs) kodlanmış veya etiketleme önceden katıştırma antikor are-in yön, diğer seçenekleri6,7,8 Floresans numune hazırlama sırasında korunması ile.
Belirli bir kalınlık bölümlerini ve 3B cilt elde edilen ayrık örnekleme kullanımı genel kısıtlamasıdır tartışılan yöntem: Z de çözüm sadece olabilir bölümleri kalınlık olarak iyi SEM tek veri bölümü yüzeyden (d toplar bu yana epending Seçili birincil enerji/açılış enerji). Bu elde edilen 3B cilt Anizotropik voxels, e.golduğu anlamına gelir., 5 x 5 x 100 nm3 Eğer 100 nm bölümleri ve bir görüntü piksel boyutu 5 nm kullanılır. Bir boyut aralığı 1 µm aşağıda çok küçük varlıklar için bu gerçek bir ultrastructural açıklama için yeterli olmayabilir. SEM Imaging otomatik için kullanılan sahne doğruluğunu daha teknik bir kısıtlamadır. Bu nedenle, tam hedef alan görüntüsü güvence altına almak için bir yatırım Getirisi daha büyük sahne doğruluk özellikleri seçmek gereklidir.
SBF-SEM ve FIB-SEM blok suratlı görüntüleme yöntemleri olarak göre Bağdaşık Anizotropik voxels, yukarıda açıklandığı gibi kesin bir dezavantajı vardır. Ne zaman uygun drift düzeltme yer FIB-SEM ile 5 x 5 x 5 nm3 izotropik voxels elde edilebilir.
Yeniden oluşturulan birimin bölümler diziler hazırlanması sırasında kaybı nedeniyle boşluklar da SBF-SEM veya FIB-SEM ile karşılaştı değil bir endişe olabilir Tutkal tarafından iyi şerit stabilization ile bu genellikle sadece bir Şerit'in son bölümü için bir sorun: ne zaman serbest bırakmak o kirpik kullanarak knife-edge hasar görmüş. Ancak, deneyim, her 20 – 50 bölümlerde bir bölümünün kaybı görüntü kayıt etkilemez.
Öte yandan, diziler sonrası leke imkanı iyi sinyal ve kontrast için kök ipuçları burada gösterilen donmuş yüksek basınç gibi zayıf metalize örnekleri üzerinde bile SEM düşsel confers. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal fiksasyonu ve metallization adımları tarafından en iyi ultrastructural korunması tehlikeye gerek yoktur. Ayrıca, orta derece metallization olan patoloji laboratuarından rutin örnekleri mükemmel veri10teslim. Sonrası gömme kontrast geliştirme genel olarak SBF-SEM ve FIB-SEM için mümkün değildir. Bu yöntemler yıkıcı olduğundan, Ayrıca, Yani, örnek görüntü, farklı çözünürlüklerde ve siteleri görüntüleme hiyerarşik veya zaman içinde daha sonra noktalarda tekrarlanan görüntüleme sırasında tüketmek mümkün değildir. Prensip olarak, sınırsız birim, büyük FOVs (örneğin, connectomics tüm fare beyinlerinde için birkaç milimetre kadar) oluşan mozaikler dikiş tarafından oluşturulan ve bölümler çok büyük sayılara AT, FIB-SEM iken, FOVs 100 µm x 100 µm ötesinde tarafından elde edilebilir rutin araçlarıyla ulaşmak zordur.
Yukarıda belirtilen yöntem SBF-SEM ve FIB-SEM hem kesit ve tam otomatik bir şekilde aynı araç içinde görüntüleme gerçekleştirmek daha fazla otomasyon iş akışının açıklandığı AT-bir avantaj olacaktır. Otomasyon kesit, bir tür var: ATUMtome12 oluşturmak ve bölümler binlerce toplamak, ama böyle bir substrat yapar gibi Kapton Teyp kullanımını zor bir FLM görüntüde diziler. ITO kaplı coverslips burada kullanılan üzerinde bile süper kararlılık düşsel mümkün. Otomasyon için daha fazla, çok istenen hedef FLM veri yığınları kayıt olurdu. Öte yandan, otomasyon pahalı olabilir ve substrat sahibi dışında burada sunulan iş akışı (donanım açısından) sadece araçları düşük yapma bir rutin EM laboratuvar veya çekirdek tesis, genellikle mevcut dayanan düzey erişim.

Doku ultrastructural çözünürlükte geniş hacimli yeniden inşa için SEM dayalı farklı görüntüleme yaklaşımlar bir dizi olmuştur kullanılan1: kapsamlı değerlendirmeleri vardır kullanılabilir örn., SBF-SEM2, FIB-SEM3ve dizi Tomografi (AT)4. İkinci yöntem için örnek malzeme seri bir substrat bölümlerde dizisi olarak korunur, SBF-SEM ve FIB-SEM yıkıcı yöntemleri, örnek blokta çalışma ve görüntüleme sırasında alıcı iken. SEM reçine şarj nedeniyle, onlar da şiddetle metalize örnek blok5üzerinde bağlıdır.
Öte yandan, belirli hücreleri veya doku örneği içinde faiz yapılarının belirlenmesi özellikle Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)6,7,8yararlanabilirsiniz. Bu floresan sinyal9gidermek beri FLM için hedefleme kullanarak uygulama heavy metal büyük miktarda engellemektedir. Diziler LM görüntüleme sonra kolayca sonrası heavy metal ile lekeli olabilir beri böyle sadece biraz metalize örnekleri için AT yönteminin seçimi var. Ayrıca, hemen hemen her örnek türü için kullanılabilir, patolog'ın bile rutin örnekleri göğüs10hazine.
AT bir diğer büyük avantajı hiyerarşik11 veya çoklu çözünürlük görüntüleme12için potansiyel mevcuttur: her şeyde yüksek çözünürlüklü görüntü gerek yoktur, hedefleri farklı bir yöntem (örneğin, FLM) ya da seçilebilir düşük çözünürlüklü SEM görüntüleri. Sadece ilginç bölgeleri, yüksek çözünürlüklü bir doku veya hücre nüfusunun görüntüleme dijital veri depolama alanı kaydeder ve kolay olan daha küçük görüntü veri kümeleri üretir. Burada, oldukça zayıf metalize bir örnek kullanarak AT iş akışı gösterilmiştir: yüksek basınç bitki kökleri (Arabidopsis thaliana) dondurulmuş gömülü hidrofilik reçine.
Diziler hazırlanan, lekeli ve FLM ve SEM görüntüsü ve görüntü yığınları kayıtlı nasıl açıklanmıştır. Ayrıca, FLM birim 3D yeniden inşası SEM Nano çözünürlükte görüntüleme için belirli hücreleri seçmek için nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Enstrümantasyon< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternatif: Leica UC7</td></tr><tr><td>Yüzey tutucu</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>Alternatif: ev yapımı</td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternatifler: Ted Pella Pelco veya diğer tezgah üstü plazma temizleyici 40kHz jeneratörlü (0-100W) Diener Zepto için Örnek Parametreler; 0.5 mbar, 5 sccm (Hava), %10 performans&nbsp;</td></tr><tr><td>Geniş alan floresan ışık mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternatifler: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Floresan filtre seti</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0.75 NA</td></tr><tr><td>GB boyutlu görüntü verilerini</td><td></td><td></td><td></td>işleyebilen iyi bir iş istasyonu</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternatifler: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Elmas bıçak, 45 derece düzeltme için;</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Elmas bıçak 90 derece;</td><td>Diatom</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Diatom DUJ3530</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret (parçalar)</td><td>Si-Mat</td><td>Özel Yapım</td><td>Doping: P/Bor, oryantasyon: < 100>, kalınlık: 525 &plusmn; 25 ve mikro; m, direnç: 1-30 &Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>ITO kaplı lameller</td><td>Balzers</td><td>Tip Z</td><td>22 & kez; 22 & kez; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Alüminyum taşıyıcı</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td>76 & kez; 26 mm</td></tr><tr><td>Gofret forseps</td><td>İdeal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Saplamalar forseps</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Elmas çizici</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Kirpik/çok yumuşak kedi tüyü</td><td>Kendi Kendine Yapılmış</td><td></td><td>Alternatif: Plano</td></tr><tr><td>Fırça</td><td>Selfmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pattex kontak yapıştırıcı</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td>Kraftkleber Classic (sarımsı olan)</td></tr><tr><td>Fixogum</td>Alt <td>tabakayı taşıyıcıya sabitlemek için</td> <td>Marabu</td><td>290110001</td></tr><tr>Alt <td>tabakayı taşıyıcıya sabitlemek için</td><td>yapışkan bant</td><td>3M</td><td>851</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>tutkal karışımı için tiner</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternatif, limonen bazlı tiner</td></tr><tr><td>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü işleme</td><td>Açık kaynak</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü edinme</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (Zeiss SEM modülü)</td><td>Otomatik görüntü alımı için alternatif: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Staining</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Stok çözeltisi:% 0,1 sodyum azit Uranylacetate içinde 1,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun (II) Nitrat</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>Tri Sodyum Sitrat Dihidrat</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>NaOH peletleri</td><td>Merck</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>1M NaOH çözeltisi</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Cam petri kabı</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mounting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Karbon pedler</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Bakır bant</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>çift taraflı yapışkan, iletken</td></tr><tr><td>Gümüş boya</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Çözeltiler/karışımlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaplama blokları</td><td></td><td></td> için yapıştırıcı karışımı <td>Pattex kontak yapıştırıcı / tiner olarak ksilen, oran 1: 3. (Ksilen için alternatif: Rotihistol)</td></tr> <tr><td>Reynolds kurşun sitrat</td><td></td><td></td><td>50 mL: 1.33 g kurşun (II) nitratı 10 mL dH 2 / sub >O. içinde çözün 1.76 g tri-sodyum sitrat dihidratı 10 ml dH2O. Karışımında çözün her ikisi de ve çözelti berraklaşana kadar 1 M sodyum hidroksit ekleyin. dH2O ila 50 mL ile doldurun.</td></tr><tr><td>Propidyum iyodür boyama çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Yeterli karıştırma için dH2O. Vorteks'te stoktan 1:1500 seyreltme hazırlayın.</td></tr><tr><td>Sulu uranil asetat</td><td></td><td></td><td>% 3 uranil asetatı dH2O içinde çözün (iyice karıştırın).</td></tr></tbody></table>

geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin multimodal hiyerarşik görüntüleme

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Bir karma hücre grubun veya bir doku içinde ultrastructural çözünürlükte belirli hücreleri hedefleme bir ışık ve elektron mikroskobu kullanarak hiyerarşik görüntüleme tarafından elde edilebilir. Reçine gömülü örnekleri ultrathin bölümleri yüzlerce kurdela oluşan diziye kesitli ve silikon gofret veya conductively kaplı coverslips parçaları yatırılır. Dizileri düşük çözünürlükte bir dijital tüketici smartphone kamera veya hızlı geniş alanı genel bakış için ışık mikroskobu (LM) veya geniş alan floresan mikroskop (Floresan ışık mikroskobu (FLM)) gibi fluorophores ile etiketleme sonra kullanarak yansıma. Ağır metaller ile sonrası sonra boyama, diziler bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü. Hedeflerin seçimi 3D rekonstrüksiyonlar FLM tarafından oluşturulan veya floresan hiçbir işaretleri yoksa SEM görüntü yığınları orta çözünürlükte yapılmış 3D rekonstrüksiyonlar mümkündür. Ultrastructural analiz için seçilen hedefleri sonunda yüksek çözünürlüklü, SEM kaydedilir (bir kaç nanometre görüntü piksel). Herhangi bir ultramicrotome için güçlendirilmiş bir şerit işleme aracı gösterilmiştir. Bu dizi üretim ve parça bıçak tekne substrat kaldırılması ile yardımcı olur. SEM dizilerin otomatik görüntüleme sağlayan bir yazılım platformu ele alınmıştır. Seri blok-yüz SEM (SBF-SEM) veya odaklı iyon demeti SEM (FIB-SEM), gibi büyük hacimli EM verileri oluşturan diğer yöntemlere göre bu yaklaşım iki önemli yararı vardır: (1) reçine gömülü örnek, dilimlenmiş-up versiyonu da olsa korunmuş. Farklı şekillerde lekeli ve farklı çözümler sunarak görüntüsü. (2) gibi bölümler sonrası Boyanabilen, kontrast için SEM düşsel tanıtmak veya doku blok iletken işlemek için ağır metaller ile örnekleri güçlü blok lekeli kullanmak gerekli değildir. Bu yöntem çok çeşitli malzeme ve biyolojik sorular için geçerli hale getirir. Özellikle önekli malzemeler örneğin, biyopsi bankalar ve patoloji laboratuarları, doğrudan olabilir gömülü ve 3D yeniden.

İş akışı (Resim 1) başlar bir reçine blok içinde gömülü bir örnek ile burada açıklanan. Numune Hazırlama sırasında bazı ağır metal dokusu içine tanıttı olabilir, ama oldukça güçlü metallization için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı kullanmak üzere gerekli değildir. Şekil 1A bitki kök (tere) blok standart olarak %1 OsO4 ile lekeli ve % 0.5 uranyl asetat kullanarak şekil 1B Arabidopsis kökte sadece zayıf ise % 1 uranyl asetat, metalize gösterir. Bazı ağır metallerin Floresans gidermek eğilimi olarak ikinci örnek türü Bağdaşık yaklaşımlar için uygundur. Bir adanmış substrat tutucu (Şekil 2) ile birkaç yüz bölümleri bir dizi olabilir (şekil 1 c) üretilen. Floresan etiketlemeyi sonra böyle diziler bir standart geniş alanlı FLM (şekil 1 d), yansıma sonra ağır metal çözümleri ile lekeli ve farklı çözünürlüklerde (şekil 1E-G) bir SEM görüntüsü.
Önemli diziler, tekrarlanabilir nesil için özellikle birkaç şeritler bir substrat üzerine microtome'nın bıçak tekneden yerleştirirken substrat tutucu (şekil 2A,) yazarın laboratuvarda özel olarak tasarlanmış ve bir Jumbo elmas araçlardır bir tekne mikroskop slaytlar (2B rakam) kapsayacak kadar büyük bıçak. Düz bir Menisküs, şerit, iyi gözlem izin gereklidir ve belgili tanımlık substrate plazma Temizleme tarafından elde edilebilir: distile su küçük damlacık bir objektif benzeri yapıda olduğu gibi şekil 2C (tedavi edilmemiş substrat), substrat üzerine oluşturması gerektiğini değil Ama ince bir film (2D rakam, aktif plazma yüzey). Bu koşullar altında kolayca bir ITO kaplı coverslip kuru bölümüne bağlı şeritler vardır (şekil 2E) görüntülenir ve gözlenen ve Asansör-dışarı-in belgili tanımlık substrate su sırasında kontrol.
Örneğin, standart geniş alan FLM (şekil 3A) ile bitki hücre duvarları etiketlemek için propidium iyodür ile lekeli diziler görüntüsü. Bölümleri yalnızca 100 olduğundan kalın, hatta burada gösterildiği gibi aşırı boyama nm tanıttı biraz bulanık. Kayıt olduktan sonra tamamen restore edilmiş hacmindeki kapalı iki hücre için yüksek çözünürlüklü düşsel 3D görüntü yığını (şekil 3B) üzerinden seçildi (Ayrıca bkz: Tamamlayıcı film S1). Ek uranyl asetat ve kurşun sitrat ile boyama ardından dizileri görüntüsü SEM'de 3 C rakam 60 nm görüntü piksel; kaydedilen genel bir bakış, gösterir Resmin merkezine karanlık meydanda nerede otofokus işlevleri idam edildi ve ek doz için hafif kirlenme yol konumunu gösterir. Uygun ROIs bu seri bölümler (dilim 51-248 435 dilimleri toplam) içinde FLM yığın içinde seçilen iki hedef hücreleri içeren bir 5 nm görüntü piksel boyutu ile sonra kaydedildi (şekil 3D; Ayrıca Tamamlayıcı film S2bakınız).
Burada açıklanan SEM dizide otomatik hiyerarşik görüntüleme yazılım/donanım platformu çözüm ZEISS Atlas 5 ile yapıldı. İlk olarak, Bütün dizi genel bir bakış ile SE dedektörü kullanılarak oluşturulmuş çok büyük (1.000 nm) görüntü piksel ve çok düşük Işınma Zamanı (şekil 4A). Sadece doku özetleyen bir yatırım Getirisi için dizinin tüm diğer bölümleri bulaşan ve ilk bölümüne yerleştirilir. Bu bölümde set sonra uzun bekleme süresi (4B rakam) kullanarak 60 nm görüntü piksel ile kaydedildi. Son olarak, iki hedef hücreleri artı bir "sahne yanlışlık için hesap için hücreleri çevreleyen tabaka" içeren bir site küme aşağıdaki parametrelerle kuruldu: ESB (enerji seçici Backscatter) dedektörü, 5 nm görüntü piksel, çok uzun (40 µs) durmak zaman ( Şekil 4 c). Böyle bir görüntüye zum hücre altı detay (şekil 4 d) boşluklar (V), mitokondri (M), çekirdek (N) ve endoplazmik retikulum (oklar) gibi gösterir. Ayrıca bir hedef hücre hücre altı en ayrıntısına kadar bütün dizi bir bakış yakınlaştırma için Tamamlayıcı film S3 bakın.
Burada (200 bölümler) gösterilen dizi artı bir ek 250 bölümlerden birini üretmek için yaklaşık 8 h aldı, LM (el ile) FLM kaydetmek ve bir gün için leke için bir gece. Boyama sonrası yaklaşık 1-2 h toplam bireysel diziler sayısına bağlı olarak alır. SEM kayıt için bir kaç saat Atlas koşmak ayarlamak için gerekli ve otomatik kayıt oldu 3-4 h orta çözünürlük (60 nm piksel boyut) bölüm kümesinin (200 bölümleri, 450 x 200 µm2) ve yaklaşık 5 gün yüksek çözünürlüklü (5 nm piksel boyutu) için yatırım Getirisi iki hedef hücreleri (200 bölümleri, 55 x 30 µm2) içeren. Burada gösterilen örnek düşük metal içeriği nedeniyle, çok yavaş bir tarama hızı (belgili tanımlık şimdiki elde edilebilir bulmak için) bir bekleme süresi 40 µs, yüksek çözünürlüklü yatırım Getirisi için örtük bir iyi sinyal-gürültü algılama erişmek için kullanılan gerektiğini unutmayın.
Birkaç adım vardır tüm iş akışında tuzaklar için eğilimli: ideal şeritler az ya da düz ve doğru sırada (5A rakam) yerleştirilmiş olmalıdır. Ancak, bent (şekil 5B), eğri (şekil 5 d) ya da kırık şeritler kez üretilmektedir. Bu yanlış düzeltme (önde gelen ve firar kenarları tam olarak paralel) veya non-birörnek uygulanan yapışkan nedeniyle, aynı zamanda asimetrik ya da düzensiz infiltre örneği neden olabilir. Özellikle zahmetli olduğu çok sert ve yumuşak olan bileşenleri. İkinci bileşenleri (şekil 5C) burada gösterilen bitki kökleri gibi hücre duvarına sızmak zor olabilir. Bu durumda, kıvrımlar (ok uçları) kolayca değişken sıkıştırma ve gevşeme kesit sırasında neden olabilir. ROIs şerit eğriliği karşılamak için döndürülebilir beri SEM Imaging otomatik için kıvrımlı şeritler, büyük bir sorun değildir.
Başka bir önemli adım protokolündeki boyama: yetersiz yıkama yol kalıntıları bölümüne (şekil 5E, F) ve en kötü durumda en ilginç alanı ( şekil 5Fiki hedef hücrelerde birini yuvarlağına) kapsamaktadır. Ayrıca, bıçak tekne içine, örneğin, bir kirli substrat taşıyıcı ile tanıtılan toz (şekil 5 d, güçlü ışık saçılma parçacıklar) ciddi sorunlara neden olabilir: FLM, toz-ebilmek var olmak son derece floresan (bkz bazı dilimler halinde tamamlayıcı film. S1) bazı kayıt algoritmalar fonksiyonu için böyle bir ölçüde. TrakEM17 "align" işlevinde ancak, Tamamlayıcı film S1içinde gösterildiği gibi yığınlar işleyebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı için Bağdaşık hiyerarşik düşsel. Bir örnek başlayan katıştırılmış bir reçine bloğunda (A, güçlü metalize örnek), örnek ilk kesilmiş (B, zayıf metalize örnek) ve sonra diziler seri bölümler (C) birkaç kurdela oluşan, buraya yerleştirilen bir Coverslip, ITO kaplı bir ultramicrotome kullanılarak üretilmektedir. Bir floresan boya boyama sonra yığınları görüntülerin bir geniş alanlı FLM (D) kaydedilir. Sonra daha fazla mermi ağır metal boyama tuzlar, yığınlar farklı çözünürlüklerde (görüntü piksel boyutları) bir SEM (E-G) görüntüsü. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Şekil 2: diziler hazırlanması için araçları. Substrat tutucu bir standart ultramicrotome(a)bağlı dolaşım yedi eksenli micromanipulators monte: dikey (1) ve yatay (2) hız ve substrat taşıyıcı (3), devirme vurgulanmış olan daireler, vidalar, yöneliktir . Geniş yüzeylerde (ok), burada bir slayt ölçekli alüminyum taşıyıcı (B) monte edilmiş plazma-harekete geçirmek silikon gofret bir parçası ile karşılamak için büyük boy bir tekne ile jumbo elmas bıçak. 20 µL distile su damlaları bir plazma-harekete geçirmek substrat (D) üstünde ya da bir tedavi edilmezse silikon gofret substrat (C) üzerine yerleştirilir. Dört şerit ITO kaplı bir coverslip alt amaçları tarafından bağlı bıçak tekne yüzer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Şekil 3: SEM verilerle LM veri korelasyon. Genel bakışlar (A, C) ve hedef hücreler (B, D) kaydedilen FLM (A, B) ve SEM (C, D). (B) bir yazılım zoom ve (C) 60 nm görüntü piksel boyutu ve (D) ile kaydedilir iken özgün veri bir 1,388 x 1,040 piksel kamera yonga üzerinde 40 X objektif lens ile gerçek gösteren 5 nm görüntü piksel boyutu ile kaydedildi SEM çözünürlük artışı <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Şekil 4: hiyerarşik ZEISS Atlas 5 AT. kullanarak SEM görüntüleme Bir dizi genel bakış ile 1.000 nm Görüntü piksellerini SE dedektörü(a)kullanarak kaydetti. Doku her bölümünde yerleştirilir ve 60 nm görüntü piksel (B) ile kaydedilen yatırım Getirisi ile bölümü ayarlar. Hedef hücrelere yerleştirilir ve 5 nm görüntü piksel (C) ile kaydedilen bir seri yatırım Getirisi ile site belirler. Böyle yüksek çözünürlüklü görüntü (D) içine zum yapıldığında, hücre içi membran bölmeleri boşluklar (V), çekirdek (N), mitokondri (M) ve endoplazmik retikulum (oklar) gibi görünür hale gelir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Şekil 5: tipik sorunlar. 1. parça işleminden doğan: kesit sırasında coverslips ITO kaplı olan ideal düz(a)ama düzensiz sıkıştırma yerleştirilen şeritler bent (B) veya kıvrımlı şeritler (D) veya hatta kıvrımlar (C) neden olabilir. 2. neden substrat ve kurdeleler su, örneğin, kesit ve boyama sırasında işleyerek: ışık parçacıkları substrat (D) saçılma, RIM damlacıkları bölümü ( Eçemberde) veya kir bulaşmış dışarı nedeniyle yetersiz doku üzerinde (F) Boyama sonra yıkama. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film S1: FLM görüntü yığını. 435 görüntüleri TrakEM17 kullanarak Fiji16 ' hizaladım ve film dosyası (.avi) olarak kaydedilmiş. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film S2: SEM görüntü yığını. 210 fotoğraf TrakEM17kullanarak Fiji16 ' uyumlu. Bu veri kümesinin özgün yığını (300 fotoğraf) 15 GB oldu. (Hizalama ve sadece iki hücre hedef için kırpma sonrası) 3,3 GB yığından küçültülmesi için o x ölçekli ve y 0.2 bir faktörle Fiji kullanarak ve sonra .avi film kaydedilir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film S3: SEM seviyelerinde farklı çözünürlük ile yakınlaştırma Film içinde oluşturulan ve .mp4 biçiminde Atlas 5 yazılım ihraç. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk görüntüsü

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Bu iş akışının genel amacı, ışık mikroskobu ve ardından çok yüksek çözünürlükte bir SEM'de 3D görüntüleme kullanarak bir doku içinde ultrastrüktürel görüntüleme için belirli hedefleri belirlemektir. Burada tanıtılan görüntüleme iş akışı, hücre biyolojisi, gelişim biyolojisi, sinirbilim ve hatta patoloji gibi bir dizi alanda hücresel veya doku üst yapısı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aslında dizi tomografisine dayanan tekniğin ana avantajı, dokuyu seri kesit dizilerine dilimlemenin, başlangıçta orijinal numune hacminin içine gömülmüş olsalar bile hedef yapıları tanımlamayı kolaylaştırmasıdır.Dizi tomografisi başlangıçta bir sinirbilim bağlamında tanıtıldı, ancak aynı zamanda bakteriler, bitkiler, hayvanlar ve hatta bir patoloji ortamındaki hasta örnekleri dahil olmak üzere çok çeşitli diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler zorlanacaktır çünkü birçok seri bölümü toplamak çok zordur. Ek destek olmadan çalışmak, bölümlerin kaybolmasına veya şeritlerin düzeninin bozulmasına neden olabilir.Bir kürdana sabitlenmiş birkaç kıldan oluşan küçük bir fırça kullanarak, önceden kesilmiş bir bloğun ön ve arka taraflarını yapışkan bir karışımla dikkatlice kaplayın. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin çünkü bu karışımın çözücüsü saniyeler içinde buharlaşır. Numuneler kururken, silikon gofret parçalarını bıçak teknesine sığacak boyutta kesin ve bunları bir elmas çizici ile işaretleyin.Ardından, silikon gofreti izopropanol ve tüy bırakmayan doku ile manuel olarak temizleyin. Çıkarılabilir bir yapıştırıcı kullanarak alt tabakayı taşıyıcı plakanın bir ucuna sabitleyin. Ayarlandıktan sonra plazma, hidrofilik bir yüzey elde etmek için hava ile kızdırma deşarjı kullanarak alt tabakayı aktive eder.Monte edilen alt tabaka bıçak kenarına daha yakın olacak şekilde, taşıyıcıyı alt tabaka tutucusunun kelepçesine yerleştirin. Ardından, bıçak tutucusuna bir jumbo elmas bıçak yerleştirin ve boşluk açısını sıfır dereceye ayarlayın. Ardından bıçak teknesini damıtılmış su ile doldurun.Bıçağa, numuneden bir ila iki milimetre uzakta olacak şekilde yaklaşın. Ardından, alt tabaka tutucusunun bir ila üç arasındaki vidalarını kullanarak alt tabakayı suya indirin. Su hattının alt tabakanın üst üçte birlik kısmında yer aldığını kontrol edin.Silikon gofret kullanırken yerden yüksekliği görmek zor olduğundan, alt tabakayı zemine değdiğini hissedene kadar indirin. Ardından, alt tabakayı küçük bir miktar yükseltin. Kesim sırasında ne alt tabakanın ne de taşıyıcının bıçak teknesine temas etmediğinden emin olun.Ardından, teknedeki su seviyesini ayarlamak için bir şırınga veya pipet kullanın. Dürbünle izlerken, su yüzeyinin tam alanı ultramikrotomun üst ışık aydınlatmasının homojen bir yansımasını gösterene kadar su ekleyin veya çıkarın. Kurulum tamamlandıktan sonra örneği bölümlere ayırmaya başlayın.Birkaç bölüm kesildiğinde, kesit alma işlemini durdurun ve bir kirpik veya çok yumuşak bir kedi tüyü ile bıçak kenarını hafifçe okşayarak şeridi bıçak kenarından serbest bırakın. Şeridi alt tabakaya doğru hareket ettirin ve alt tabakanın kuru kısmına yapıştırmak için şeridin ilk bölümünü yavaşça itin. Numuneyi bölümlere ayırmaya ve şeritleri alt tabakaya yapıştırmaya devam edin.Alt tabakanın bir tarafından başlayın ve her yeni şeritle birlikte yavaş yavaş diğerine doğru hareket edin. Alt tabaka tamamen kurdelelerle kaplandığında, alt tabaka tutucunun mikro manipülatör vidalarını kullanarak alt tabakayı bıçak teknesinden nazikçe kaldırın. Şerit dizisini kurumaya bırakın ve ardından tozsuz bir ortamda saklayın.Kuruduktan sonra, yapışkanla monte edilmiş alt tabakayı mümkün olan en kısa sürede taşıyıcıdan çıkarın. Ardından, numunenizi ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ışık mikroskobu için boyayın ve görüntüleme yapın. Ardından, numuneyi elektron mikroskobu için boyayın ve yapışkan bir karbon ped ile alüminyum saplamalara monte edin.Şimdi bu dizileri alan emisyon taramalı elektron mikroskobunda görüntüleyin. Şarjı önlemek için, üç kV veya daha düşük birincil elektron enerjileri ve 50 ila 800 pikoamper arasında bir ışın akımı kullanın. ITO kaplı cam kapak kızaklarını kullanırken, iletken yüzeyi bakır bant ve gümüş boya ile mikroskop taşıyıcısına bağlayın.Hiyerarşik olarak görüntüleme kademesindeki ilk adım, tek tek bölümlerin tanınabileceği şekilde diziye genel bir bakış oluşturmaktır. Öncelikle, her köşenin düşük büyütme oranında, yaklaşık 100x boyutunda bir görüntüsünü grafiklendirerek dizinizin dört köşesini tanımlayın, ardından tüm diziyi kapsayan bir yatırım getirisi oluşturun. Aşağıdaki parametrelerle bu ROI'ye bir görüntüleme protokolü atayın.Yaklaşık 0,2 mikrosaniyelik kısa bir bekleme süresi kullanarak yüksek hızlı görüntüleme için ikincil elektron dedektörünü kullanın. Büyük bir görüntü piksel boyutu ve 2000 x 2000 piksellik bir döşeme boyutu seçin. Sonuç çok gürültülü bir görüntüdür, ancak burada bile kesit içindeki doku görülebilir.Ardından, yalnızca ilk bölümdeki dokunun ana hatlarını çizen bir ilgi alanı oluşturarak bir bölüm kümesi oluşturun. Damga aracını kullanarak sonraki tüm bölümlere klonlayın. Bükülmüş şeritlere uyum sağlamak için gerektiğinde ilgilenilen bölgeleri döndürün.Dokunun alt yapısını en iyi gösteren bölüme bir protokol atayın. Burada, 60 nanometrelik bir ara piksel boyutu, 12000 x 12000 piksellik bir döşeme boyutu ve 3.2 mikrosaniyelik bir bekleme süresi kullanıldı. Düşük kalite nedeniyle, daha küçük bir piksel boyutu ve daha hassas bir dedektör kullanılarak seçilen birkaç hücreyi özetleyen ikinci bir bölüm seti oluşturuldu.Artık iki hedef hücreyi çok iyi tanımak mümkün. Daha yüksek çözünürlüklü SEM görüntüleme için hedef yapıyı içeren bölüm kümesi içinde bir site kümesi oluşturun. İlgi alanını, aşamalı hassasiyeti hesaba katacak kadar büyük yapın.Sitelerin konumlarını kontrol edin ve ayarlayın. Birçok bölüm görüntülendiğinde otomatik ayarlama gereklidir. İlgilenilen bölgeleri, merkezin yapısal detay olmadan boş malzemeye, örneğin vakuollere oturmayacak şekilde yerleştirilmesi önemlidir.Ardından, otomatik odaklama ayarlarını tanımlayın ve görüntülenecek alana yakın olan küçük bir ilgi alanındaki bir şeridin uzunluğu boyunca görüntüleme performansını kontrol edin. Ardından, yüksek çözünürlüklü SEM alımı için bir görüntüleme protokolü tanımlayın. Membran bölmelerini görmek için, üç ile beş nanometre arasında bir görüntü piksel boyutu seçin.Görüntünün çok gürültülü olmaması için dedektöre bağlı olarak bir bekleme süresi seçin. Sahne alanının bu ve bu bölümün kaydedilmesi arasında büyük bir mesafe kat etmesi gerektiğinden, protokolü denetle seçeneğini kullanarak odak değerlerini her şeridin en azından ilk bölümünde tanımlayın. Ardından, tüm hedef ilgi alanları dizisi üzerinde otomatik SEM görüntülemeyi başlatın.Bittiğinde, elde edilen verileri tercihen TIF formatında bir görüntü serisi olarak dışa aktarın. Görüntü serilerini sanal bir yığın olarak Fiji'ye aktarın. Ardından, alanı ilgilenilen yapıya mümkün olduğunca yakın bir şekilde kırparak daha sonraki işlemler için yığını kırpın.Ayrıca, parlaklığı ve kontrastı ayarlayın ve yığını kaydedin. Kırpıldıktan ve optimize edildikten sonra, Dosya menüsünden yeni bir TrakEM açın. Görüntü alanına sağ tıklayın ve yığını katman başına bir dilim olacak şekilde TrakEM'e aktarın.Sağ tıklatarak Katmanları hizala'yı seçin. Mod olarak en küçük kareler'i seçin, aralığı ilkinden sonuncusuna ayarlayın ve referans olarak hiçbiri'ni seçin. Ardından, varsayılan ayar değerlerini seçin ve istenen dönüştürme olarak Rijit'i seçin.Kayıt tamamlandığında ve tatmin edici olduğunda, sağ tıklayıp Dışa Aktar'ı seçerek hizalanmış veri kümesini kaydedin. Düz bir görüntü oluşturun, ilk görüntüden son görüntüye kadar olan aralığı ayarlayın ve yazılımın ortaya çıkan yığını göstermesine izin verin. İşiniz bittiğinde, yığını TIF biçiminde kaydedin.Hazırlıktan sonra, kesit dizisi, birkaç seri bölüm şeridinden oluşan bir dizi olarak görünür. Bu bölüm, propidyum iyodür ile boyanmış bir arabidopsis kök ucuna genel bir bakış göstermektedir. Bu örneğin sıralı bölümleri, protokolde açıklandığı gibi hizalandı ve örneği 3B olarak tek bir film dosyası olarak göstermek için birleştirildi.Burada, daha sonra SEM'de nanometre çözünürlükte görüntülenecek olan iki hedef hücre görülebilir. Uranil asetat ve kan sitrat ile ek boyamanın ardından, diziler elektron mikroskobunda görüntülendi. Bu statik görüntü, ilk olarak 20 nanometre çözünürlükte ve ikinci görüntüleme turunda beş nanometre çözünürlükte görüntülenen örnek kesiti göstermektedir.Burada, elektron mikroskobundan alınan 210 ardışık görüntü, protokolde açıklandığı gibi hizalandı ve kırpıldı. Video sadece iki hücreyi hedef alıyor ve hücrelerin içindeki vakuollerin nasıl düzenlendiğini ve bazen 3D olarak nasıl bağlandığını gösteriyor. Burada gösterilen SEM'deki dizilerin otomatik hiyerarşik görüntülemesi, tüm diziye genel bakıştan hücre altı ayrıntılara kadar farklı çözünürlük seviyelerinde sorunsuz eşleme sağlayabilir.En yüksek büyütmede, vakuoller, mitokondri, çekirdek ve endoplazmik retikulum tanınabilir. Ustalaştıktan sonra, kesit şeritlerini tipik bir alt tabaka üzerine yan yana yerleştirmek, düzgün bir şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir. Bu, görüntüleme için bir alt tabaka üzerinde yüzlerce bölüm sağlayabilir.Bu kadar çok sayıda bölüm için görüntüleme süresi bir mikroskoptan diğerine değişebilir, hatta en sevdiğiniz görüntüleme cihazlarınızın farklı otomasyon seviyeleri varsa daha da fazla değişebilir. Genel iş akışının, standart histo boyama ve hatta kandolüminesans gibi diğer görüntüleme teknikleriyle kolayca birleştirilebileceğini veya büyük hacimlerin artoyapısal görüntülemesi için bağımsız bir araç olarak kullanılabileceğini belirtmek ilginçtir. Bu iş akışının bir başka yönü de kolay erişilebilirliktir.İlk çalışmalar, ek araçlar veya otomasyon olmadan, yani büyük yatırımlar olmadan yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iş akışı ve ilginç yapıları farklı çözünürlük seviyelerinde büyük bir 3D hacimde hedeflemek ve görüntülemek için çok modlu ve hiyerarşik görüntülemenin nasıl kullanılabileceği hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.

multimodal-hierarchical-imaging-serial-sections-for-finding-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

In vivo biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme (i) ve (ii) post mortem histolojik analiz: Bu makale ile kemirgen beyinde hücresel greft multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi anlatılmaktadır. Tek bir hayvan bu görüntüleme yöntemleri birleştirerek, yüksek çözünürlüklü, duyarlılık ve özgüllük ile hücresel greft değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Mevcut protokol, (SWITCH  - H2O2 - Antijen Reterival - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan  mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.

Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Seri iki fotonlu tomografi (STPT) görüntüleme, iki fotonlu görüntülemeyi otomatik evre kontrolü ve mikrotom dilimleme ile birleştirerek bir doku kütlesini üç boyutlu şeklinde görüntülemek için kullanılan bir tekniktir. Burada, marmoset beyinlerinin yapısal özelliklerini daha iyi anlamaları için bunu uygulamak için bir protokol açıklıyoruz.

Nöroanatomik Analizler için Tüm Marmoset Beyninin Seri İki Fotonlu Tomografisi

Bu makale, peritoneal metastazların üç boyutlu mimarisini karakterize etmek için optimize edilmiş bir multipleks immünofloresan protokolünü açıklamaktadır.

Yinelemeli Beyazlatma Genişletilmiş Çokluk Yaklaşımı kullanılarak tümör taşıyan dokunun üç boyutlu görüntülenmesi

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Beyin örneklerindeki tüm hücrelerin mezoscale olarak tarafsız görüntülenmesini sağlayan ve aynı örnekte bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopisinin görüntüleme iş akışına sorunsuz entegre edilebilen Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı yeni bir görüntüleme tekniği tanıttık.

Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

Öğrenin, hücresel hedefleri belirlemek için dizi tomografi kullanarak ışık mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu ile hiyerarşik görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilimde yüksek çözünürlüklü 3D yapı analizi sağlar.

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Daha fazla video keşfet