Yinelemeli Beyazlatma Genişletilmiş Çokluk Yaklaşımı kullanılarak tümör taşıyan dokunun üç boyutlu görüntülenmesi

Bu araştırma, immünomodülatör ilaçlar ve kompleks solid gastrointestinal tümörler için hedeflerin belirlenmesine odaklanmaktadır. Tümör mikroçevresinin hücresel manzarasını analiz etmek, immünoterapi gibi tedavilere duyarlılığı anlamak için kesinlikle çok önemlidir. Tek hücre dizilimi ve akış sitometrisi, tümör mikroçevresini karakterize etmeye yardımcı olur, ancak uzamsal bağlamdan yoksundur. Son zamanlarda, tümör mikroçevresini in vivo bağlamında incelemek için multipleks görüntüleme ve transkriptomik platformlar ortaya çıkmıştır.

Tümör mikroçevresini analiz etmek için mevcut multipleks teknolojileri, yinelemeli veya hepsi bir arada, iki boyutla sınırlıdır. Bu protokol, karakterizasyonu derinlik boyutuna genişleterek tek FFPE veya donmuş bölümlerin ötesinde içgörüler sağlar.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, doku tabakalarını ılık hasat ortamı içeren bir numune kabına aktarın ve hazırlama masasındaki bir ısıtma plakasına yerleştirin. Dokuyu, hasat ortamı içeren 15 santimetrelik bir plakadaki platformlara monte edin. Tümör taşıyan dokuyu, mezotelyal tarafı yukarı bakacak şekilde platformun küçük delik tarafının üzerine dikkatlice örtün ve 2-0 ipek dikişle sabitleyin. Hazırlanan doku platformunu, hasat ortamı içeren 24 oyuklu bir plakaya ters olarak tamamen batırılmış olarak yerleştirin. Sabitleme için, 40 mililitre sabitleme tamponu hazırlamak için 30 mililitre soğuk PBS içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe 10 mililitre fiksatif stok ekleyin. Forseps kullanarak, platformlara monte edilen dokuyu fiksasyon tamponuna aktarın. Ve 4 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Sabitleyiciyi boşaltın. 40 mililitre soğuk PBS ile değiştirin. Ve 4 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Boyama için, bir kuyucuğa 1 mililitre bloke edici tampon ekleyin ve doku platformunu yerleştirin. 30 RPM'lik düşük bir hıza ayarlanmış bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında en az iki saat bloke edin. Bir mikrosantrifüj tüpünde 0.8 mililitre antikor boya çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 10.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanın 0.75 mililitresini 9 oyuklu bir inkübasyon plakasının temiz bir kuyusuna aktarın. Ve yıkanmış bir platform yerleştirin. Plakayı alüminyum folyoya sarın. Ve 30 RPM'lik düşük bir hıza ayarlanmış bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Platformu 40 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpte 4 santigrat derecede 10 dakika yıkayın. 3,5 santimetrelik bir görüntüleme kabının cam tabanının ortasına 0,1 mililitre PBS ekleyin ve bir kenara koyun. Yükseklik ayar halkasını saat yönünde gevşek bir şekilde dış kapağa vidalayın. Ve platformu iç plastik tutucuya monte ederek çentik oluğu hizalamasını sağlayın. Platformu kaydırıcı ile sabitleyin. Monte edilmiş görüntüleme adaptörünü cam alt tabağa yerleştirin ve doku tampona temas edene kadar yükseklik ayar halkasını dikkatlice indirin. Camdan en uygun mesafeye ulaşıldığında, görüntüleme sırasında doku dehidrasyonunu önlemek için alt tarafı yukarı bakacak şekilde doku üzerine 0,2 mililitre PBS ekleyin. Görüntü alma yazılımını başlatın. 20X veya 40X gibi uygun hedefi seçin ve ilgili daldırma ortamını ekleyin. 600 hertz tarama hızı, 1024 x 1024 piksel XY çözünürlüğü, üç satırlı ortalamalar ve çift yönlü tarama gibi görüntü elde etme parametrelerini seçin. Uygun lazer çizgilerini seçin veya beyaz ışık lazerini, boyama için kullanılan floroforların uyarma ve emisyon spektrumlarına uyacak şekilde ayarlayın. Monte edilmiş görüntüleme kabını mikroskop tablasındaki numune tutucuya yerleştirin. XY kontrolünü kullanarak numuneyi ortalayın, objektifi kapak camına getirin ve görüntü almaya başlayın. Her görüntüleme turundan sonra bir beyazlatma adımı gerçekleştirin. Damıtılmış suda mililitre lityum borhidrür çözeltisi başına 5 mililitre 1.5 miligram hazırlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 1 mililitre lityum borhidrür çözeltisini 9 oyuklu inkübasyon plakasının temiz bir kuyusuna aktarın ve yıkanmış platformu oda sıcaklığında 60 dakika boyunca yerleştirin. Platformu konik bir tüp içinde 20 mililitre PBS'de kısaca yıkayın. Z telafisi için en yüksek lazer ayarını kullanarak kalan floresan sinyalini kontrol edin. Yinelemeli ağartmanın ilk turu ile boyanan tümör taşıyan bir peritoneal numune, görselleştirme için multipleksite veya IBEX 1 panelini genişletir. Tümör lezyonları, papiller mezotelyoma karakteristiği nükleer düzenlemelere sahip CD44 ve podoplanin için çift pozitif olan rozet benzeri yapılar olarak tanımlandı. Tümör taşıyan periton örneğinden seçilen bölgelerin yüksek çözünürlüklü immünofloresan görüntüleri burada gösterilmektedir. Bu görüntüler, tümör bölgelerini ve tümör üçüncül lenfoid yapı arayüzlerini ortaya çıkararak, yüksek yoğunluklu CD45 pozitif hücreler ile tutarlı bağışıklık hücresi infiltrasyonunu vurgular. Bu şekil, tümör lezyonu ve tümör üçüncül lenfoid yapı arayüzü içindeki immün ve yapısal belirteçlerin uzamsal dağılımını gösteren, bir ila altı IBEX döngüsü boyunca yinelemeli immünofloresan boyamayı sunar. Farklı optik bölümlerin maksimum projeksiyonları burada sunulmaktadır. Bu 3D görüntüleme, tümör lezyonlarının ve üçüncül lenfoid yapıların farklı Z derinliklerinde bulunduğunu doğruladı ve karmaşık doku mimarisini yakalamada 2D görüntülemenin sınırlamalarını gösterdi.