Name: Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Öğrenin, deterjan duyarlı yöntemle membran proteinleri arasındaki etkileşimleri nasıl tespit edeceğinizi. Sortilin ve GLUT4 örneğinde histidin ve myc etiketleme teknikleri kullanılarak hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser DK52057 ve K.V.K. X.P için gelen NIH DK107498 kurumsal eğitim grant 2T32DK007201 NIH üzerinden tarafından desteklenen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir.

1. peptid işlenmesi
<ol><li>Tasarım ve peptid sipariş<ol>
<li>Peptid istenen sırayı seçin ve myc epitope (EQKLISEED), onun ya da N - veya C-terminus gibi bir etiket ekleyin.</li>
		<li>Peptid suda peptid çözünürlük hesap makinesi http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php kullanarak tahmin edilen çözünürlük kontrol edin. Çözünürlük düşük ise, şarj dengeyi değiştirmek için başka bir suda çözünen etiket eklemeyi deneyin. Not: Biz N terminus (Myc-fll-GLUT4) ilk luminal döngü (fll) için myc epitope (kalın yazı tipi) ile öğesini GLUT4, karşılık gelen peptid kullanılır: "iyi" tahmin edilen suda var EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA .</li>
		<li>En az % 75 ile özel peptid sipariş saflık tahlil için yeterli olan ve çözünürlük testi için sağlayıcınıza danışın. Sipariş peptid eriterek ile beklenmedik sorunlar durumunda en az iki aliquots ayrı. Not: Myc-fll-GLUT4 iki aliquots emri verildi. Ultrasaf suda bildirilen onun ≤10 mg/mL'dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peptid eriterek Not: En iyi solvent ultrasaf su var. Peptid suda çözünür olmak görünmüyorsa yönergeler için http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html bakın.<ol>
<li>100 x peptid ultrasaf su veya 100 μg/mL konsantrasyonu ile seçim, arabellek çalışma çözüm hazırlamak.</li>
		<li>50-100 µL aliquots belgili tanımlık eriyik ayırmak ve onları-20 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre işleme
<ol><li>Hücre kültürü<ol>
<li>Vahşi türü (WT) hücreleri bir negatif kontrol ve altı histidines (HISP) ile öğesini hedef protein ifade hücreleri olarak kullanın. Not: Biz 3T3 L1 ön adiposit stabil Sortilin-myc/O'nun5ile transfected kullanılır.</li>
		<li>Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) yüksek şeker % 10 buzağı sığır serum ile desteklenmiş, hücrelerin büyümesine glutamin (2 mM) ve penisilin/streptomisin (5 μg/mL) % 10 CO237 ° C'de.</li>
		<li>Dört 10 cm yemekleri hücre oturup iki tane HISP ile transfect ve diğer iki denetim plazmid (WT) ile transfect. 48 h transfection sonra hücrelerin % 80-90 confluency ulaştırılması gerekmektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre Lysates hazırlanması<ol>
<li>Lizis arabellek (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM Imidazole, % 0.5 Triton X-100 ve proteaz inhibitörü EDTA kokteyl O'nun öğesini proteinler, pH 7.4 yalıtımı için) hazırlamak ve 4'te tutmak ° c</li>
		<li>Hücreleri üç kez 10 mL 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ° C'de yıkama</li>
		<li>Bulaşıkları buza koy ve 500 µL lizis arabelleği her yemek için ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücre lysates hasat.</li>
		<li>Lysate her yemeğin farklı 1,5 mL tüp içine yerleştirin. Tüpler WT-pH6, WT-pH8, HISP-pH6, HISP-pH8 olarak etiketleyin.</li>
		<li>Hücre lysates bir şırınga ile 26 G iğne ile beş kez yukarı ve aşağı, tam lizis için geçmek.</li>
		<li>Hücre lysates, 16.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Supernatants yeni aynı şekilde etiketlenmiş tüpler aktarın.</li>
		<li>Protein konsantrasyonu BCA Protein tahlil seti veya diğer seti kullanarak analiz.</li>
		<li>Lizis arabellek kullanarak, tüm dört lysates protein konsantrasyonu eşitlemek.</li>
		<li>Bir küçük (ca. 20 µL) aliquot, her lysate ayrı ve olası kontrol deneyleri ve/veya sorun çekim için-20 ° C'de tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HisPur kobalt boncuk için O'nun öğesini proteinlerin bağlama
<ol><li>Piyasada bulunan yıkama arabellek kullanın veya bir (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8) hazırlamak ve 4 ° C'de tutmak</li>
	<li>Yıkama hazırlamak pH 6 tarafından tittering yıkama tampon pH 8 ile birlikte tut HCl. bu 4 ° C'de tampon</li>
	<li>Yavaşça homojen süspansiyon yapmak kobalt boncuk şişe girdap.</li>
	<li>Kobalt boncuk süspansiyon 40 µL yukarıdaki gibi işaretlenmiş dört 1,5 mL tüpler içine (Adım 2.2.4) dağıtmak.</li>
	<li>1 mL lizis arabellek her tüp için ekleyin ve 5 s. aspiratı süpernatant için 1000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi ve 40 μL lizis arabelleği için kapatılan boncuk ekleyin.</li>
	<li>Hücre lysates karşılık gelen borular için ekleyin.</li>
	<li>Tüpler için 90 dk 4 ° c 20 d/d tüp rotator üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Tüpler santrifüj kapasitesi 1000 x g 5 s ve süpernatant toplamak için. 4 ° C'de süpernatant tutmak</li>
	<li>PH 8 veya pH 6 yıkama arabellek 500 µL karşılık gelen borular için ekleyin ve boncuk hafifçe yeniden askıya alma.</li>
	<li>1000 x g 5 s ve atmak için de tüpler santrifüj kapasitesi supernatants.</li>
	<li>Adım 3,9 ve 3.10 için dört kez tekrarlayın.</li>
</ol>4. peptid üstündeki immobilize O'nun öğesini Protein için bağlama
<ol><li>Peptid (1.2.1. adım) 100 x çalışma çözümü kullanarak 1 çalışma çözümler pH 6 veya pH 8 yıkama arabellek (her iki 100 µL aliquots, 1 µg/mL) x hazırlamak.</li>
	<li>1 x peptid çözeltinin 100 μL karşılık gelen pH ile yıkanmış boncuk ekleyin.</li>
	<li>Boncuk 20 rpm bir tüp rotator üzerinde 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>1000 x g 5 için de tüpler santrifüj kapasitesi s, süpernatant toplamak ve -20 ° C'de tutmak</li>
	<li>Adım 3,9 ve 3.10 için dört kez tekrarlayın. Not: olası arka plan azaltmak için aşağıdaki adımları adımları 4.4 & 4.5 yerini alabilir.</li>
	<li>Onları olduğu gibi adım 2.2.4 etiket ve sütunları koleksiyon tüplerde yer 30 mikron gözenekleri dört mikro sütunlarla alın.</li>
	<li>Sütunlara kuluçka karışımı adım 4.3, tamamlanması aktardıktan sonra çözüm yerçekimi tarafından geçmesine izin verin. -20 ° C'de aracılığıyla akış devam</li>
	<li>Yıkama tamponunun pH 6 veya pH 8 karşılık gelen sütunları aracılığıyla ile 500 µL yerçekimi tarafından geçmek. Aracılığıyla akış atmak.</li>
	<li>Adımı yineleyin 4,8 dört kez.</li>
	<li>Son yıkama sonra santrifüj kapasitesi 1000 x g 15 sütun s.</li>
</ol>5. elüsyon kobalt boncuk üzerinden
<ol><li>Kullanım ticari Tricine örnek arabellek (200 mM Tris-HCl, % 40 gliserol, % 2 SDS, %0,04 Coomassie mavi, pH 6.8) ve β-mercaptoethanol % 2 son konsantrasyonu ekleyin.</li>
	<li>Tricine örnek arabelleği (β-mercaptoethanol ile) 40 µL yıkanmış boncuk ve girdap örnek ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri 100 ° C'de 10 dakika için ısı girdap örnekleri daha ve 1000 x g 5 için de tüpler santrifüj kapasitesi s. Not: elüsyon olası nonspesifik bağlama azaltmak için aşağıdaki adımları adımları 5.1-5,3 yerini alabilir.</li>
	<li>40 μL elüsyon Imidazole arabelleği (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0.25 M imidazole) yıkanmış için eklemek boncuk, girdap ve tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>3000 x g 30 de tüpler santrifüj kapasitesi s, süpernatant (eluted örnekleri) toplamak ve yeni etiketli tüpler için transfer.</li>
	<li>Tricine örnek arabelleği 40 μL her tüp eklemek, örnekleri 10 dk 100 ° C, girdap ve santrifüj için ısı tüpler 1000 x g 5 için de s. Not: mikro sütun kullanılıyorsa, elüsyon arabellek için yıkanmış boncuklar, eklemek için 20 dk kuluçkaya ve 8.000 x g 2 min için de Santrifüjü tarafından elüsyon toplamak. Not: Elektroforez gerçekleştirilir kadar örnekleri-20 ° C'de tutulabilir.</li>
</ol>6. Elektroforez ve Western Blot
Not: Örnekleri SDS-sayfa ve sonraki Western Blot tarafından ayrılması için hazırsınız demektir. Jel Elektroforez (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) aşağıdaki değişiklikler ile protokolünden izleyin.
<ol><li>Piyasada bulunan 10-%20 Tricine degrade jelleri kullanın.</li>
	<li>Üzerinde jel, eluted örnekleri 20 µL ve lysates (Adım 2.2.10) 20 µL yük. Sorun çekim için bu 20 µL ilişkisiz malzeme (Adım 3.8) yüklemek için tavsiye edilir ve 10 ng peptid; yükleme önce bu örnekler için Tricine örnek arabellek eşit miktarda ekleyin.</li>
	<li>Elektroforez ticari Tris/Tricine/SDS arabellek (100 mM Tris, 100 mM Tricine ve % 0.1 SDS, pH 8.3) çalıştıran içinde yerine getirir.</li>
	<li>Malzeme % 20 metanol ile desteklenen Aktarım arabellek (25 mM Tris Bankası, 192 mM glisin, pH 8.4) kullanarak 0,45 µm nitroselüloz membran üzerine jel transfer.</li>
	<li>Membran ile % 3 blok sığır Serum Albumin (BSA) oda sıcaklığında 1 h için. Önceden lekeli molekül ağırlığı işaretçileri kılavuz olarak kullanarak, membran yatay kesme, HISP karşı antikor ile üst kısmında leke ve alt kısmında bir antikor myc öğesini peptid tanımlamak için myc epitope karşı ile leke. Not: HISP ve Myc-fll-GLUT4 bir anti-myc antikor ile tespit edilebilir beri bizim durumda, membran kesme gerekli değildir.</li>
</ol>7. analiz sonuçları
<ol><li>Bir görüntü istasyonu veya ImageJ programı kullanarak tüm Western blot sinyalleri yoğunluğunu ölçmek.</li>
	<li>Myc öğesini peptid HISP sinyalini her iki pH değerlerinde karşı gelen sinyal normalleştirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sortilin her iki sinyal plazma zarı ve hücre içi sıralama olaylar6,7dahil bir evrimsel korunmuş çok ligand protein reseptörü var. Ancak, deterjanlar için duyarlı olmak sortilin etkileşim bazı bağlama ortakları ile göründüğü gibi otantik sortilin'ın ligandlar (bazıları luminal veya integral membran proteinlerinin olan) için arama karmaşıktır. Bu nedenle, bir kolay ve protein-protein etkileşimleri, türleri çalışmak için yaygın bir yaklaşım co-immunoprecipitation, k...

GLUT4 nerede insülin etkisi sonrası prandial kan glikoz izni1aracılık eder yağ ve kas hücrelerinde ağırlıklı olarak gösterilen bir glikoz taşıyıcı proteindir. Çok istikrarlı bir protein olmak, GLUT4 translasyon düzeyinde düzenlenir. İnsülin yokluğunda GLUT4 büyük ölçüde plazma membran (dolayısıyla düşük Bazal geçirgenliği glikoz için) gelen söz konusu değildir ve küçük insülin duyarlı veziküller (IRVs) hücre içinde ağırlıklı olarak yerelleştirilmiştir ve temsil etmek büyük olasılıkla trans-Golgi ağ (TGN) Irv donör bölüm. İnsülin yönetim, üzerine IRVs plazma zarı ile sigorta ve işleyişi siteye GLUT4 teslim. Bu glikoz alımı adiposit ve iskelet miyositler kandan 10'a 40-fold yükselir böylece bu glikoz, plazma membran geçirgenliği artar. İnsülin çekilme sonra GLUT4 erken/sıralama endosomes içselleştirilmiş ve IRVs yeniden kurulan nerede TGN alındı. Her iki sıralama adımlar GLUT4 yolu, Yani çevresel erken endosomes tarafından ulaşım perinükleer TGN için ve IRVs oluşumu üzerinde membranlar Vps10p aile üyesi tarafından bir türü temsil eden sortilin, etkin TGN donör ben transmembran protein ve sıralama reseptör. Bir modeline göre sortilin bir transmembran iskele protein çalışır: GLUT4 endosomes ve TGN Lümen bağlar ve onun C-terminus2, retromer veya clathrin adaptörler donör membran aracılığıyla sitoplazmik tarafına acemi 3. bu GLUT4 dağıtım GLUT4 hücre içi bölmeleri arasında translocate veziküler taşıyıcıları içine kolaylaştırır.
Sortilin sitoplazmik kuyruk retromer ve çeşitli adaptör proteinler ile etkileşim iyi belgelenmiş oldu. Ancak, sortilin GLUT4 (ve onun diğer protein ligandlar birkaç) bağlantısını kanıtlamak için zor oldu. Özellikle, co-immunoprecipitate sortilin ve GLUT4 girişimlerini muhtemelen bu iki proteinler arasındaki etkileşimi deterjan duyarlı olması nedeniyle başarılı olmamıştır. Ayrıca, bir tipik taşıyıcı protein olarak GLUT4 12 transmembran etki alanları ve 6 luminal döngüler hangi herhangi bir bileşimini potansiyel bir sortilin bağlama site temsil edebilir vardır. Aynı zamanda, membran geçirgen DSP ve etkileşim ile Maya iki hibrid sistemde cross-linking önemli ortak yerelleştirme hücresinde, gibi dolaylı kanıtların büyük bir vücut önermek o sortilin GLUT4 için bağlayabilirsiniz. Ayrıca, ikinci yaklaşımı mutagenesis tarama alanin ile bir arada kullanarak, biz daha önce sortilin Vps10p etki öncelikle GLUT4 ilk luminal döngüsünü için bağlar belirledik. Ancak, böyle bir etkileşim memeli hücreleri olarak kanıtı kayıp olmuştur. Burada, asidik ortamda benzer O'nun öğesini sortilin kobalt reçine kullanarak ve kimyasal olarak sentezlenmiş peptid GLUT4 ilk luminal döngü pH 6 ve pH 8 karşılık gelen ile etkileşim kurabilir gösterdi transfected 3T3-L1 hücreleri izole ettim endosomal Lümen ve TGN membranlar nötr ortam Lümen içinde. Hiçbir peptid bağlama denetimi deneylerde nerede sigara transfected hücrelerden hazırlanan özü aynı boncuk dolu olduğunu tespit edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8849</td>, <td>histidin etiket proteini</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin'in saflaştırılmasında kullanım için&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1 mL İnsülin Şırınga U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA Protein Test Kiti</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>His-tag protein saflaştırması için</td></tr><tr><td>HisPur Kobalt Reçine</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Trisin numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>SDS ile 161-0739</td><td>, bMerkaptaetanol Elution eklenmelidir</td></tr><tr><td>&nbsp; </td><td>Tampon Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>250mM İmidazol</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine prekast jeller ile His-tag protein saflaştırması için% 10-20 & nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>Peptit ve küçük protein</td></tr><tr><td>Tris/Trisin/SDS çalışma tamponunun ayrılması için&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Tamponu</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td>% <td>20 metanol Nitroselüloz</td></tr><tr><td>membran ekleyin & nbsp; 0.45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Anti Myc antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>2272</td><td>Tavşan</td></tr><tr><td>Peptit</td><td>Genscipt</td><td></td><td>Siparişi özelleştirmek</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Çift renk Standartları</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

membran proteinlerinin hofstede deterjan duyarlı tespiti

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Protein-protein etkileşimleri keşfetmek için bizim yetenek hücredeki düzenleme bağlantılarını anlama anahtarıdır. Ancak, protein-protein etkileşimler birçok durumda tespiti önemli deneysel sorunlar ile ilişkilidir. Özellikle, sıralama reseptörleri kez deterjan duyarlı moda co-immunoprecipitation bu proteinlerin kullanılamaz yapar, membran bölmeleri Lümen içinde onların protein kargo ile etkileşim. Sıralama reseptör sortilin GLUT4 membran proteinlerinin arasındaki zayıf luminal etkileşimlerin bir örnek olarak hizmet verebilir glikoz taşıyıcı için bağlama. Burada, sortilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi doğrulamak için hızlı, basit ve ucuz bir tahlil açıklayın. Bunun için biz tasarladık ve kimyasal potansiyel sortilin bağlama epitope GLUT4 luminal kısmında karşılık gelen myc öğesini peptid sentez. Tagged ile altı histidines Sortilin memeli hücrelerinde ifade ve kobalt boncuk kullanarak hücre lysates izole. Üstündeki immobilize Sortilin peptid çözüm farklı pH değerlerinde ile inkübe ve eluted malzeme Western Blot tarafından analiz edildi. Bu tahlil diğer deterjan duyarlı protein-protein etkileşimleri çalışmaya kolayca adapte edilebilir.

Lysates 3T3 L1 hücreleri stabil Sortilin-myc/O'nun5 ve WT 3T3 L1 hücreleri, bir negatif kontrol kullanılan transfected hazırlanmıştır. Her iki lysates kobalt boncuk pH 6 veya pH 8 ile inkübe edildi ve iyice yıkanır. Boncuk immobilize proteinler ile sonra Myc-fll-Glut4 çözümünde inkübe. Dikkatli yıkamadan sonra boncuk için bağlı proteinler 0.25 M Imidazole ile eluted. Örnekleri tabi, SDS-sayfaya degrade jel takip her ikisi de tespiti için sortilin-myc/O'nun izin Ant...

Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Bu prosedürün genel amacı, zar proteinleri veya diğer proteinler arasındaki deterjana duyarlı etkileşimleri tespit etmektir. Bu prosedür, bir proteinin histidin etiketli olmasını ve hücrelerde aşırı eksprese edilmesini gerektirirken, diğeri myc etiketli bir peptittir. Bu yöntem, biyokimya alanındaki önemli protein etkileşimi çalışmalarındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, zar proteinleri arasındaki etkileşimi deterjana duyarlı bir şekilde tespit etme yeteneğidir. İşlem hızlı ve kolaydır. Bu yöntem, zar protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, zayıf protein etkileşimlerini incelemek için de kullanılabilir.Bu yöntem fikrine ilk olarak, zar proteinleri, Saltilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi kontrol etmek istediğimizde sahip olduk, ancak bunları memeli lizizinden birlikte immünopresipite etme girişimleri başarısız oldu. Peptit için bir sipariş vermek için, etkileşim için kritik olan peptidin hedef dizisini seçin ve dizinin sonuna veya C terminaline bir myc epitop ekleyin. Peptit geldikten sonra, ultra saf suda peptidin çalışma çözeltisinin mililitresi başına 100 mikrogram pepare.Dört adet 10 santimetrelik kültür kabında üç adet 3T3-L1 ön adiposit hücresi tohumlayın ve inkübatörde saklayın. Daha sonra, hedef protein 6X histodyn ile etiketlenmiş ve diğer iki kapta iki kontrol plazmidi ile HISP olarak etiketlenmiş ve WT olarak etiketlenmiş iki kültür kabını transfekte edin. Transfeksiyondan sonra,% 80 ila 90 birleşmeye ulaşmak için hücreleri 48 saat inkübatörde bırakın. Hücre lizatını hazırlamak için, hücreleri dört santigrat derece soğutulmuş 10 mililitre 1X tamponlu tuzlu su ile üç kez buz üzerinde yıkayın.Ardından, her birine 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Ardından, lizatı hazırlamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri bulaşıklardan ayırın. Her bir kültür kabından hazırlanan hücre lizatını dört ayrı 1,5 milimetrelik tüpe aktarın ve tüm tüpleri etiketleyin.Daha sonra, hücre lizatını toplam hücre lizizi için 26 gauge iğneli bir şırıngadan beş kez yukarı ve aşağı geçirin. Ardından, hücresel lizatları 16000xg'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları aynı şekilde etiketlenmiş dört yeni tüpe aktarın.Gelecekteki sorun giderme ve kontrol deneyleri için, 20 mikrolitre hücre lizatını alın ve 20 santigrat derece saklayın. Daha sonra kullanmak için, PH6'yı elde etmek için PH8'deki yıkama tamponunu hidroklorik asit ile titre edin ve tamponu dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, kobalt boncukların homojen bir süspansiyonunu hazırlamak için şişeyi dikkatlice döndürün.Ardından, 40 mikrolitre kobalt boncuk süspansiyonunu ayrı ayrı işaretlenmiş dört tüpün tümüne aktarın. Kobalt boncukları ekledikten sonra, tüplere bir mililitre lizis tamponu ekleyin. Ardından, tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve 40 mikrolitre lizis tamponunu çökelmiş boncuklara pipetleyin. Daha sonra, hücre lizatını karşılık gelen tüplere aktarın ve bir tüp döndürücü üzerinde 90 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. 90 dakika sonra, numuneleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin.Ardından, Flowthrough-1 etiketli süpernatanı toplayın ve 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, PH8 ile 500 mikrolitre yıkama tamponunu tek tek tüplere ekleyin ve boncukları nazikçe yeniden askıya alın. Tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin ve süpernatanları dışarı atın.Ardından, etiketlere göre tüplere PH8 ile veya altı ile yıkama tamponu ekleyin ve boncukları iyice askıya alın. Tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin ve süpernatanları dışarı atın. Peptitin mililitre çalışma çözeltisi başına bir mikrogram hazırlayın ve PH6 veya sekiz ile su tamponu hazırlayın.Daha sonra, benzer PH'a karşılık gelen yıkanmış boncuklara 100 mikrolitre peptit çözeltisi ekleyin. Ardından, boncukları bir tüp döndürücü üzerinde dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, dört mikro sütun alın, etiketleyin ve sütunları Akış-2 etiketli toplama tüplerine yerleştirin. Kuluçka bittikten sonra, kuluçka karışımını sütunlara ekleyin.Çözeltinin yerçekimi kuvveti ile geçmesine izin verin ve numuneyi akıştan toplayın. Sütunları yeni toplama tüplerine yerleştirin ve 20 santigrat derecede saklayın. Ardından, tek tek sütunlardan yerçekimi akışıyla PH6 veya sekiz ile 500 mikrolitre yıkama tamponu geçirin ve akışı atın.Bu adımı dört kez tekrarlayın. Tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin. Sütunu Elution etiketli yeni toplama tüpüne yerleştirin.Bağlanmamış peptitten kurtulmak için tüm tüplerdeki boncukları çok dikkatli ve eşit bir şekilde yıkamak önemlidir. Yıkanan boncuklara, beta merkaptoetanol ile 40 mikrolitre trisin numune tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.Kolonu 8000xg'de iki dakika santrifüjleyin. Sütunları atın ve toplama tüplerini 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Ardından, beş saniye boyunca 1000xg'de santrifüjleyin.Alternatif olarak, yıkanmış boncuklara 40 mikrolitre Elution İmidazol tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon bittikten sonra, tüpleri iki dakika boyunca 8000xg'de santrifüjleyin. Sütunları atın ve 40 mikrolitre trisin örneği ekleyin.Toplama tüplerini 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ardından beş saniye boyunca 1000xg'de santrifüjleyin. Piyasada bulunan %10-20 trisin gradyan jellerini kullanın. Tris/Trisin/SDS çalışma tamponu kullanın, ardından ayrıştırılan numunelerin her birine 20 mikrolitre yükleyin ve jel üzerine toplam lizat koyun ve elektroforez ünitesini çalıştırmaya başlayın.Elektroforez bittiğinde, malzemeyi jelden 0.45 mikrometre nitroselüloz membrana aktarmak için %20 metanol ile desteklenmiş transfer tamponu kullanın. Membranı bloke ettikten sonra yatay olarak kesin. Daha sonra, zarın üst kısmını Anti His P antikoru ile, zarın alt yarısında anti myc ile araştırın.GLUT4'te kobalt boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş Sortilin arasındaki etkileşimi incelemek için immünoblot analizi yapıldı. Hücresel lizatlar ve elüatlar vahşi tip ve Sortilin-myc/His etiketli transfekte edilmiş 3T3-L1 hücreleri elde edildi ve daha sonra SDS sayfasına yüklendi. Leke anti-myc antikor ile incelendi.Leke, transfekte edilmiş elüatlardan 110 kilodotin Sortili-myc / His etiketli ve beş kilotin myc-birinci luminal loop-GLUT4 gösterir. Daha sonra, PH'ın önemini ve kobalt boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilen Sortilin ile GLUT4 arasındaki etkileşimi incelemek için immünoblot analizi yapıldı. Bu testte, Myc-birinci luminal döngü GLUT4, hem PH6 hem de sekizde Sortilin-myc / His etiketli proteinler ile hareketsiz hale getirilmiş boncuklarla inkübe edildi.Leke, hem PH6'da hem de Sortilin-myc / His etiketli transfekte edilmiş 3T3-L1 hücrelerinden elde edilen elüatlardan sekizde Sortilin-myc / His ve myc-birinci luminal döngü GLUT4 arasında açık bir etkileşim gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, numuneler Batı kan analizi için hazır olana kadar üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tercihen suda çözünür olan peptit tasarlamayı hatırlamak önemlidir.Sonuçlarınızı güçlendirmek için, çapraz bağlamayı takiben immünopresipitasyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, deterjana duyarlı bir prosedürde zar proteini, protein etkileşimlerinin nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Aynı zamanda protein parçaları arasındaki etkileşimi keşfetmeye de izin verir.Yumuşak Ritmik caz.

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, deterjan çözünmesini takiben Escherichia coli'de yeşil floresan proteini (GFP) ile kaynaşmış membran proteini stabilitesini taramak için bir floresan algılama boyut dışlama kromatografisi tekniği gösteriyoruz. Boyut dışlama profilinde çok az veya hiç serbest GFP ile simetrik bir tepe sergileyen proteinler, daha sonra yapı-fonksiyon analizi için seçilebilen, minimum bozunma ve agregasyon ile saflaştırılmış proteinleri gösterir.

Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Bu iletişim kuralı, düşük çözünürlüklü ab initio manken ve yapısal bir deterjan çözündürüldükten membran proteini küçük açı Nötron saçılma kontrast-eşleştirme ile deterjan kullanarak çözümde detaylarını elde etmek gösterilmiştir.

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Membran protein saflaştırma ve peptidiskler içine reconstitution birleştiren bir yöntem tek bir kromatografik adımda salıyoruz. Biyotinylated iskeleler biyolayer interferometri ile protein-ligand etkileşimlerinin doğrudan yüzey eki ve ölçümü için kullanılır.

PeptiQuick, Aerodinamik Protein Bağlayıcı Tahliller için Biyotinylated Peptidiskler içine Membran Proteinlerin Bir Adım Dahil

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Öğrenin, deterjan duyarlı yöntemle membran proteinleri arasındaki etkileşimleri nasıl tespit edeceğinizi. Sortilin ve GLUT4 örneğinde histidin ve myc etiketleme teknikleri kullanılarak hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilir.

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Daha fazla video keşfet