Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Bu prosedürün genel amacı, zar proteinleri veya diğer proteinler arasındaki deterjana duyarlı etkileşimleri tespit etmektir. Bu prosedür, bir proteinin histidin etiketli olmasını ve hücrelerde aşırı eksprese edilmesini gerektirirken, diğeri myc etiketli bir peptittir. Bu yöntem, biyokimya alanındaki önemli protein etkileşimi çalışmalarındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, zar proteinleri arasındaki etkileşimi deterjana duyarlı bir şekilde tespit etme yeteneğidir. İşlem hızlı ve kolaydır. Bu yöntem, zar protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, zayıf protein etkileşimlerini incelemek için de kullanılabilir.

Bu yöntem fikrine ilk olarak, zar proteinleri, Saltilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi kontrol etmek istediğimizde sahip olduk, ancak bunları memeli lizizinden birlikte immünopresipite etme girişimleri başarısız oldu. Peptit için bir sipariş vermek için, etkileşim için kritik olan peptidin hedef dizisini seçin ve dizinin sonuna veya C terminaline bir myc epitop ekleyin. Peptit geldikten sonra, ultra saf suda peptidin çalışma çözeltisinin mililitresi başına 100 mikrogram pepare.

Dört adet 10 santimetrelik kültür kabında üç adet 3T3-L1 ön adiposit hücresi tohumlayın ve inkübatörde saklayın. Daha sonra, hedef protein 6X histodyn ile etiketlenmiş ve diğer iki kapta iki kontrol plazmidi ile HISP olarak etiketlenmiş ve WT olarak etiketlenmiş iki kültür kabını transfekte edin. Transfeksiyondan sonra,% 80 ila 90 birleşmeye ulaşmak için hücreleri 48 saat inkübatörde bırakın. Hücre lizatını hazırlamak için, hücreleri dört santigrat derece soğutulmuş 10 mililitre 1X tamponlu tuzlu su ile üç kez buz üzerinde yıkayın.

Ardından, her birine 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Ardından, lizatı hazırlamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri bulaşıklardan ayırın. Her bir kültür kabından hazırlanan hücre lizatını dört ayrı 1,5 milimetrelik tüpe aktarın ve tüm tüpleri etiketleyin.

Daha sonra, hücre lizatını toplam hücre lizizi için 26 gauge iğneli bir şırıngadan beş kez yukarı ve aşağı geçirin. Ardından, hücresel lizatları 16000xg'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları aynı şekilde etiketlenmiş dört yeni tüpe aktarın.

Gelecekteki sorun giderme ve kontrol deneyleri için, 20 mikrolitre hücre lizatını alın ve 20 santigrat derece saklayın. Daha sonra kullanmak için, PH6'yı elde etmek için PH8'deki yıkama tamponunu hidroklorik asit ile titre edin ve tamponu dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, kobalt boncukların homojen bir süspansiyonunu hazırlamak için şişeyi dikkatlice döndürün.

Ardından, 40 mikrolitre kobalt boncuk süspansiyonunu ayrı ayrı işaretlenmiş dört tüpün tümüne aktarın. Kobalt boncukları ekledikten sonra, tüplere bir mililitre lizis tamponu ekleyin. Ardından, tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve 40 mikrolitre lizis tamponunu çökelmiş boncuklara pipetleyin. Daha sonra, hücre lizatını karşılık gelen tüplere aktarın ve bir tüp döndürücü üzerinde 90 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. 90 dakika sonra, numuneleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin.

Ardından, Flowthrough-1 etiketli süpernatanı toplayın ve 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, PH8 ile 500 mikrolitre yıkama tamponunu tek tek tüplere ekleyin ve boncukları nazikçe yeniden askıya alın. Tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin ve süpernatanları dışarı atın.

Ardından, etiketlere göre tüplere PH8 ile veya altı ile yıkama tamponu ekleyin ve boncukları iyice askıya alın. Tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin ve süpernatanları dışarı atın. Peptitin mililitre çalışma çözeltisi başına bir mikrogram hazırlayın ve PH6 veya sekiz ile su tamponu hazırlayın.

Daha sonra, benzer PH'a karşılık gelen yıkanmış boncuklara 100 mikrolitre peptit çözeltisi ekleyin. Ardından, boncukları bir tüp döndürücü üzerinde dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, dört mikro sütun alın, etiketleyin ve sütunları Akış-2 etiketli toplama tüplerine yerleştirin. Kuluçka bittikten sonra, kuluçka karışımını sütunlara ekleyin.

Çözeltinin yerçekimi kuvveti ile geçmesine izin verin ve numuneyi akıştan toplayın. Sütunları yeni toplama tüplerine yerleştirin ve 20 santigrat derecede saklayın. Ardından, tek tek sütunlardan yerçekimi akışıyla PH6 veya sekiz ile 500 mikrolitre yıkama tamponu geçirin ve akışı atın.

Bu adımı dört kez tekrarlayın. Tüpleri 1000xg'de beş saniye santrifüjleyin. Sütunu Elution etiketli yeni toplama tüpüne yerleştirin.

Bağlanmamış peptitten kurtulmak için tüm tüplerdeki boncukları çok dikkatli ve eşit bir şekilde yıkamak önemlidir. Yıkanan boncuklara, beta merkaptoetanol ile 40 mikrolitre trisin numune tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.

Kolonu 8000xg'de iki dakika santrifüjleyin. Sütunları atın ve toplama tüplerini 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Ardından, beş saniye boyunca 1000xg'de santrifüjleyin.

Alternatif olarak, yıkanmış boncuklara 40 mikrolitre Elution İmidazol tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon bittikten sonra, tüpleri iki dakika boyunca 8000xg'de santrifüjleyin. Sütunları atın ve 40 mikrolitre trisin örneği ekleyin.

Toplama tüplerini 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ardından beş saniye boyunca 1000xg'de santrifüjleyin. Piyasada bulunan %10-20 trisin gradyan jellerini kullanın. Tris/Trisin/SDS çalışma tamponu kullanın, ardından ayrıştırılan numunelerin her birine 20 mikrolitre yükleyin ve jel üzerine toplam lizat koyun ve elektroforez ünitesini çalıştırmaya başlayın.

Elektroforez bittiğinde, malzemeyi jelden 0.45 mikrometre nitroselüloz membrana aktarmak için %20 metanol ile desteklenmiş transfer tamponu kullanın. Membranı bloke ettikten sonra yatay olarak kesin. Daha sonra, zarın üst kısmını Anti His P antikoru ile, zarın alt yarısında anti myc ile araştırın.

GLUT4'te kobalt boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş Sortilin arasındaki etkileşimi incelemek için immünoblot analizi yapıldı. Hücresel lizatlar ve elüatlar vahşi tip ve Sortilin-myc/His etiketli transfekte edilmiş 3T3-L1 hücreleri elde edildi ve daha sonra SDS sayfasına yüklendi. Leke anti-myc antikor ile incelendi.

Leke, transfekte edilmiş elüatlardan 110 kilodotin Sortili-myc / His etiketli ve beş kilotin myc-birinci luminal loop-GLUT4 gösterir. Daha sonra, PH'ın önemini ve kobalt boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilen Sortilin ile GLUT4 arasındaki etkileşimi incelemek için immünoblot analizi yapıldı. Bu testte, Myc-birinci luminal döngü GLUT4, hem PH6 hem de sekizde Sortilin-myc / His etiketli proteinler ile hareketsiz hale getirilmiş boncuklarla inkübe edildi.

Leke, hem PH6'da hem de Sortilin-myc / His etiketli transfekte edilmiş 3T3-L1 hücrelerinden elde edilen elüatlardan sekizde Sortilin-myc / His ve myc-birinci luminal döngü GLUT4 arasında açık bir etkileşim gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, numuneler Batı kan analizi için hazır olana kadar üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tercihen suda çözünür olan peptit tasarlamayı hatırlamak önemlidir.

Sonuçlarınızı güçlendirmek için, çapraz bağlamayı takiben immünopresipitasyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, deterjana duyarlı bir prosedürde zar proteini, protein etkileşimlerinin nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Aynı zamanda protein parçaları arasındaki etkileşimi keşfetmeye de izin verir.

Yumuşak Ritmik caz.