Name: Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Keşfedin endokard hücrelerinin atriyoventriküler kanal ve kalp kapakçığı oluşumu sırasında takibini canlı Danio rerio embriyolarında. Bu yöntem, kalp gelişimi mekanizmalarını anlamak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli ve Basile Gurchenkov tasarım ve bu protokol için açıklanan kalıp yapmak yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenen FRM (DEQ20140329553), (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01) ANR, EMBO genç araştırmacı programı, Avrupa Topluluğu, ERC CoG N ° 682938 tarafından Evalve ve bir Fransız devlet Fonu ANR-10-LABX-0030-INRT grant tarafından yönetilen tarafından Agence Nationale de la Recherche çerçeve programı Investissements d'Avenir altında ANR-10-IDEX-0002-02 etiketli.

1. kalıp hazırlama ve özel montaj
<ol><li>Bir 3D printerlere harcama maddeler veya geleneksel mekanik atölye araçlarını kullanarak şekil 1 ' de gösterilen boyutları ile bir kalıp oluşturun.</li>
	<li>Yaklaşık 1,5 mL erimiş % 1'özel bir 35 mm plastik montaj kabına pipet. Plastik kalıp kalıp ve özel arasındaki bindirme hava önlemek için dikkat çekici sıvı özel yerleştirin. 4 ° C'de çanak yerleştirin, özel (Bu alır yaklaşık 5 dk) sertleşir kadar bekle, sonra plastik kalıp kaldırın.</li>
	<li>Montaj çanak daha sonra kullanmak üzere saklamak için kapağı ile çanak kapağı sonra çanak ve kapak parafilm ile sıkıca sarın. Montaj çanak-ebilmek var olmak stok sonra kapak yüzü aşağı bakacak şekilde-4 ° C'de 5 güne kadar</li>
	<li>Önceden 1 mL aliquots %0,7 düşük erime noktası özel 1,5 ml, montaj gününde kullanılacak Eppendorf tüpleri hazırlayın. Not: Eğer parafilm yemekler sıkıca sarılır değil su buharlaşır gibi montaj çanak özel kuyu zamanla deforme.</li>
</ol>2. Photoconversion için embriyo elde
<ol><li>Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) satır ve yaklaşık 200 embriyo 28.5 ° C'de karanlıkta embriyo ortamda büyümeye Zebra balığı çizgiyi hakkında daha fazla bilgi için lütfen Jüpiter bilim eğitim veritabanı11' e bakın.</li>
	<li>5 h sonra ancak 24 saat önce 1-fenil-2-Tioüre (PTU pigment oluşumunu önlemek için) ile embriyo tedavi (%0,003 PTU embriyo orta).</li>
	<li>1 h, photoconversion, ekran embriyo bir floresan stereoscope altında ve select 5 sağlıklı embriyoların başlamadan en parlak yeşil Floresans ifade etmek için görünür. Embriyo görüntülenmesi zaman düşük yoğunluktaki ışık kullanımı photoconverting Kaede non-spesifik hücrelerdeki önlemek için embriyoların maruz ortam ışığı önlemek için önerilir.</li>
</ol>3. katıştırma
<ol><li>Ortam takma 10 mL hazırlamak: %0,02 tricaine ve 50 mM BDÖ embriyo orta.</li>
	<li>Montaj yemek için montaj orta 2 mL ekleyin ve özel yaygın çözüm için 15-30 dakika.</li>
	<li>Bu arada, 1 mL aliquot %0,7 düşük erime noktası (LMP) özel bir tüp hakkında 5 min için 70 ° C ısı bloğu yerleştirerek eritebilir.<ol>
<li>LMP özel biraz soğumasını bekleyin sonra 25 µL 8 mg/mL tricaine çözüm ve 1 M BDÖ çözüm 40 µL düşük erime noktası özel tüp için ekleyin. Yukarı ve aşağı, pipetting tarafından Mix ardından LMP özel sıvı durumundaki tutmak için 38 ° C ısı bloğu için tüp aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir Petri embriyoya zarar vermemeye dikkat çekici forseps kullanarak stereomicroscope altında önceden seçilen embriyolar ile embriyo orta, dikkatle dechorionate çanağı.</li>
	<li>Embriyo medya montaj 2 mL içeren ayrı bir yemek için transfer.<ol>
<li>Ne zaman kalpleri embriyoların durdurulur (yaklaşık 5-10 dakika sürer), montaj için embriyo çanağı ve embriyo Wells 25 derece açıyla yalan forseps kullanarak düzenlemek transfer kuyrukları daha derin kuyu, yukarı dönük olacak şekilde sarısı parçası doğru işaret.</li>
		<li>Ne zaman embriyo olan kabaca yerde, medyayı çıkarın, embriyo % 0.7 LMP özel tricaine ve BDÖ içeren ~ 200 µL içinde embed ve embriyo pozisyonları, yeniden ayarlamak için sola veya sağa gerektiği gibi embriyo devirme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yemek için montaj orta LMP özel setleri (alır yaklaşık 5 dk), o zaman eklemek kadar bekleyin. Embriyo şimdi photoconverted olmaya hazırız. Not: Tricaine ve BDÖ embriyo anestezi ve embriyo kalp, sırasıyla durdurmak için kullanılır. Montaj medya görüntüleme önceki gün hazırlanabilir, ama medya ışıktan korumak emin olun. Not: Embriyo doğru konumlandırma bir net lazer yol bir photoconvert için dilek hücrelere izin vermek önemlidir. Embriyo başkanı böylece lazer ışık çok embriyo ulaşmak için seyahat etmek zorunda değildir ve böylece embriyo photoconversion sonra kolayca monte edilmemiş olabilir iyi başlangıç yakın yerleştirin.</li>
</ol>4. Photoconversion
<ol><li>Bir 405 ile donatılmış bir dik confocal mikroskobu (gibi Leica SP8) üzerinde nm, 488 nm 561 nm lazer kaynak, yerini öğrenmek ve embriyonun kalp kullanarak beyaz ışık (aydınlık alan) ve bir objektif lens aktarılan'ın (tarihlerde Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 amaç). Kırmızı Kaede floresan 561 nm lazer (örneğin, ~ %5 yoğunluğu, 589-728 nm'de ayarla dedektörü, DPSS 561 lazer) kullanarak kontrol edin. O zaman, endokard 488 nm lazer (Yani, 30 mW çok satırlı Argon lazer ~ %5 yoğunluğu, 502-556 nm'de ayarla dedektörü) kullanarak görselleştirmek.</li>
	<li>"Sıkı BAĞLAMAK" moduna mikroskop edinme yazılım. % ~ 1 lazer güç için her iki 488 seçin nm ve 561 nm lazerler.</li>
	<li>Faiz uçakta odaklanmak, photoconvert hücreleri 405 nm diyot kullanarak yatırım Getirisi üzerinde üç kez tarama % 25 lazer güçte lazer sonra faiz (ROI), bir bölge seçin. Yetersiz Kaede-meli var olmak photoconverted içinde yatırım Getirisi, 405 nm Lazer alanı üzerinde üç kez tekrar tarayın. Tüm ROIs için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Yazılım "Kıbrıslı Türkler SP8" moduna dönmek ve bir z-yığını, 561 kullanarak elde nm ve 488 nm lazerler sırayla. Görüntüleme hızını artırmak için 'çift yönlü' seçeneğini seçtiğinizden emin olun. Not: Ne kadar photoconvert ve her embriyo değişir görüntü için gereken. Kalp atışı normal kalp kapak geliştirme için önemli, yani tüm 5 embriyo photoconvert için vaktin var mı anlamına gelse bile daha--dan 30 dk için durdu kalp tutulması önlemek için bilinir. Not: photoconversion işlemi sırasında kullanım Devresel_ödeme dedektörleri, photoconversion iken sonra bu melez dedektörleri 'modu bu sayıma' ayarla kullanmak için tavsiye edilir. Bunun nedeni hibrid dedektörleri daha hassas ve daha iyi kalitede görüntüler üretebilen, ama dozun tarafından kolayca zarar görebilir.</li>
</ol>5. photoconverted embriyo çıkarma
<ol><li>Photoconversion sonra bir cam pipet LMP özel kırmak, sonra yavaşça embriyo kadar emmek için embriyo başkanı biraz hemen üzerinde bastırın için kullanın.<ol>
<li>Cam pipet gelen embriyo bir 35 mm Petri PTU (orta içeren BDÖ silsin için) ile embriyo orta içeren içine dışarı atmak.</li>
		<li>PTU ile embriyo ortam içeren bir 6-şey plaka bir kuyuda embriyo transfer edin. Bu photoconverted hücreler konumunu daha sonra gelişim aşamalarında ilişkilendirmek için gerekli olduğu gibi bu adım sırasında hangi iyi, hangi embriyo Not tutmak emin olun gider.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şimdi bu embriyoların BDÖ içeren ortamından kaldırılır, kalplerini 5 dk. içinde karanlık 28.5 ° C'de embriyo normalde geliştirmeye devam etmek izin vermek için dönüş embriyolar tekrar atmaya başlayacaktır.</li>
</ol>6. photoconverted hücreleri embriyonik aşamada daha sonra görüntüleme
<ol><li>İstenen aşamada kalbini durdurması ve yeniden gibi embriyo altında Bu protokol, adım 3 embriyo embriyo izlemek için ayrı, işaretli yemeklerinde BDÖ ile tedavi edilmelidir önemli farkı embed.</li>
	<li>Embriyolar kadar 62 için hpf, z-561 kullanarak diyaframdan yığını elde nm ve 488 nm için kırmızı ve yeşil floresan sinyallerini, anılan sıraya göre. Embriyo aşamalarında 62 büyük için hpf, kullanım multiphoton bir lazer kümesine 940 nm 488 nm lazer yerine yeşil Kaede görüntü.</li>
</ol>7. görüntü analizi için embriyo küçük 48 hpf
Not: AVC doku hareketleri nedeniyle karmaşık üç boyutlu yapısını analiz etmek zor olabilir. AVC iki sigara photoconverted bölgeler veya AVC iki photoconverted bölgeler arasındaki bir sigara photoconverted bölgede uzunluğu arasında photoconverted bölgede uzunluğunu ölçmek için bu üç boyutlu yapısını eşlemek için arzu olabilir bir iki boyutlu harita. Photoconverted embriyo görüntülerini elde önce 48 hpf analiz istimal ertesi gün yöntem.
<ol><li>Matlab veya benzer herhangi bir yazılım alınan görüntüleri içe.</li>
	<li>El ile yatırım Getirisi, Yani endokard sınırlandırmak ve bu bölgenin dışında sinyal kaldırmak için bir maske uygulayın.</li>
	<li>Diyaframdan noktalarında belirlemek ve onları üç-boyutlu olarak çizmek için resmi bir yoğunluk eşik uygulanır. Hiçbir ilgi atrium ve ventrikül yazılımda Sil komutunu kullanarak el ile silerek AVC, dar ve en düz parçası karşılık gelen Puan yalıtmak.</li>
	<li>Yani elde AVC temsil eden noktaları uyacak bir silindir kullanın.</li>
	<li>Çeşitli örnekleri karşılaştırmak için bir referans sistemi tanımlayın. Örneğin, AVC Puan kütlenin merkezi başvuru sisteminin başlangıç noktası ve z ekseni olarak monte silindirin ekseni olarak kabul eder.<ol>
<li>Pozitif z-pozisyonlar her zaman kalp (ventrikül veya Atriyal) aynı tarafına karşılık emin olun.</li>
		<li>AVC Puan x-y uçakta proje ve onlara uyacak bir elips kullanın.</li>
		<li>Z ekseni etrafında endocardial Puan elipsin büyük ekseni ve y ekseni başvuru sisteminin paralel ve AVC embriyo ile ilgili iç tarafına pozitif y-değerlerini karşılık döndürür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AVC segmentlere ayırmak için uçakları yarı-uçak döndürerek elde edilen üç boyutlu veri kümesi kesme {y = 0, x > 0} z yönünde.<ol>
<li>Komşu piksel yoğunluğu bu uçaklarda proje ve endotel tutarlı bir şekilde tanımlayın. Örneğin, el ile bir çizgi Atriyal yarım endotel kalınlığı, AVC ventrikül tarafına çizin.</li>
		<li>Endotel ile üç boyutlu bir eğri yüzeyli AVC temsil etmek için eğri toolbox'ı kullanarak temsil eden satır ayırıcıları tanımlar. Not: Her iki ayrılmasını doğruluğunu ve zaman tüketimi bu adımın kesme uçak sayısını belirler. Genellikle, 8 uçak iyi sonuçlar elde etmek için yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her bir noktanın azimut yerini AVC yüzeyde silindirik koordinatları kullanarak tanımlar.<ol>
<li>Azimut her konumda AVC yüzeyi boyunca parametrik eğri ardışık noktaları arasındaki yüzeyinde yay uzunluğu hesaplayarak tanımlayın.</li>
		<li>Her parametrik eğri için AVC sıfıra ortasına yakın eğride nokta tanımlayın. AVC noktaları böylece tamamen azimut konumlarını ve konumlarına göre parametrik eğri üzerinde açıklanmıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AVC Puan parametrik konumunu kullanarak iki boyutlu bir görüntü içine açılmak.</li>
	<li>Bölge İkili resim eşik kenarları photoconverted yoğunluklarda ve sigara photoconverted kanalları arasındaki oran ölçmek için kenarları bulun. El ile sonuç gerekirse düzeltin.</li>
	<li>Azimut pozisyon bir fonksiyonu olarak doku uzunluğunu hesaplamak için kenarları arasındaki yay uzunluğu hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo%3A+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li>
<li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li>
<li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li>
<li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646(2016).</li>
<li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="NULL">Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005(2015).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li>
<li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li>
<li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhOTO+zebrafish%3A+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888(2012).</li>
<li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.

Photoconversion zamanlaması: her ne kadar Kaede bile 96 EdCs içinde parlak ifade kalır hpf, embriyo büyüdükçe, Kaede kapalı photoconversion daha zor hale AVC ulaşmadan önce lazer ışığı daha fazla yayılır olduğunu belirtmek gerekir. At embriyonik aşamalarında 55'dan sonra hpf, aynı zamanda atrium ve ventrikül Balonculuk anlamına gelir photoconversion için kullanılan Menekşe lazer ışını AVC hücreleri atrium ya da ventrikül üzerinden ilk geçen olmadan ulaşamıyorum. Bu demektir ki 55 hpf, photoconvert AVC, EdCs amac...

Zebra balığı şu anda hücresel ve gelişim süreçleri vivo içindeçalışmak için en önemli omurgalı modellerinden biri. Bu büyük ölçüde nedeniyle Zebra balığı'nın optik şeffaflık ve amenability genetik olarak içeren optik teknikleri uygulamak için güçlü bir model yapar genetik photoresponsive protein teknolojileri1kodlanmış. Kalp Geliştirme çalışma özgü, Zebra balığı almak yeterli oksijen Difüzyon yolu ile kalp atışı olmadan hatta mutantlar analizleri gelişimsel genlerin ve perişan etkisi izin geliştirme, ilk hafta boyunca yaşayamaz öyle ki kan akımı üzerinde kalp morfogenez çoğu omurgalılar2' mümkün değil.
Zebra balığı kalbini tüp 24 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından kuruldu. Kısa bir süre sonra oluşumu, kalbini tüp aktif dayak başlar. 36 tarafından hpf, açık bir daralma ayıran atrium ventrikül üzerinden. Daralma bu bölgesine Atriyoventriküler kanal (AVC) ve bu bölge değişikliği hücrelerinin Skuamöz Morfoloji tetrahedron Morfoloji3denir. Zebra balığı Atriyoventriküler kapak morfogenez başlar yaklaşık 48 h Döllenme sonrası. Tarafından 3 gün Döllenme sonrası, iki kapak Beyannameler AVC genişletmek ve ventrikül kan atrium için geri akışı sırasında kalp döngüsü4önlemek. Hızlı atan kalp hücreleri geleneksel hızlandırılmış mikroskobu5,6takip etmek zor yapar gibi hücreleri AVC ve Vana oluşumu sırasında izleme meydan okuyor. Steed ve ark., 20167, uyarlanmış bu iletişim kuralı, photoconvertible protein Kaede olarak ifade edilir Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 Zebra balığı mutant satýr, bir yöntem açıklar endotel hücreleri, endokard dahil olmak üzere. Uyuşturucu 2,3-butanedione-2-monoxime (BDÖ) yenerek, EdCs 36 55 hpf ve photoconverted EdCs gelişimsel zaman belirli noktalarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme arasında doğru photoconversion sağlayan kalp geçici olarak durdurmak için kullanılır. Daha önce bu yöntemi kullanarak EdCs photoconverted beş gün veya daha fazla photoconversion7saat sonra dönüştürülmeyen komşularını ayırt kalabileceği gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı da photoconverted EdCs embriyo 48 genç görüntü analizi için kullanılan bir yöntem detaylar doku hareketleri sırasında AVC geliştirme (Boselli vd., Basında)9takip için başarılı bir şekilde kullanılmıştır hpf. Biz okuyucular bu protokolü yararlı AVC ve Vana geliştirme normal embriyo ve mutantlar, morphants veya uyuşturucu tedavi edilen embriyolar eğitimi için bulacağını umuyoruz. Zebra balığı geliştirme sırasında photoconvertible proteinleri kullanarak hücre izleme ile ilgili daha genel bir protokol için lütfen Lombardo vdtarafından 201210makaleyi görüntüleyin.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balık yetiştirmek ve yumurta toplamak için gerekli ekipman (ayrıntılar için Zebra Balığı Kitabına22 bakın).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dik konfokal mikroskop (488 nm, 561 nm ve 405 nm'de çalışan lazerler, ayarlanabilir bir çoklu foton lazer ve bir Leica HCX IRAPO L, 25 &times;, NA 0.95 objektif ile donatılmıştır)</td> <td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm doku kültürü kabı</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalıp</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg / mL Trikain stok çözeltisi &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM stok çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure düşük erime noktalı agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-fenil-2-tiyoüre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo ortamı: 30x stok çözümü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</ güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Görüntü Analizi, Eğri Uydurma, Biyo-Format Araç Kutuları ile donatılmış</td><td>Matlab MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>8 mg / mL Trikain stok çözeltisi< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mg trikain tozu (Etil 3-aminobenzoat metansülfonik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH 7'ye ayarlayın, alikot ve -20 ° C'de saklayın; C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>1 M BDM stok çözeltisi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquot ve -20 &°C'de saklayın; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Embriyo ortamı: 30x stok çözelti</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50.7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1.47 g Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2.1 g Kalsiyum nitrit tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19.52 g HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>pH 7.2'ye ayarlayın ve oda sıcaklığında</td><td></td><td></td><td></td> saklayın</tr><tr><td><güçlü>Küf< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasCLEAR reçine</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 39&nbsp; Serbest biçimli Pico 3D yazıcı</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyo hücre photoconversion ile aşağıdaki endocardial doku hareketleri

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Embriyo sırasında hücre hücre davranış dinamik değişiklikleri meydana ve bu değişiklikleri arkasındaki hücresel mantık deşifre gelişim biyolojisi alanında temel bir hedeftir. Büyük ölçüde bulma ve geliştirme photoconvertible proteinlerin anlayışımız bu dinamik değişiklikleri optik hücre ve dokulara vurgulamak için bir yöntemi sağlayarak destekli. Photoconversion, hızlandırılmış mikroskobu ve sonraki görüntü analizi beyin veya göz gibi organlarda ortaya çıkarılması hücre dinamiği içinde çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır iken, ancak, bu yaklaşım genellikle nedeniyle gelişen kalp kullanılmaz Kalbin hızlı hareket tarafından kalp döngüsü sırasında yarattığı sorunlar. Bu protokol iki bölümden oluşur. İlk bölümü photoconverting ve endocardial hücreleri (EdCs) Zebra balığı Atriyoventriküler kanal (AVC) ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında daha sonra izlemek için bir yöntem açıklanır. Yöntem kalp sırayla gerçekleşmesi doğru photoconversion için bir ilaç ile geçici durdurma içerir. Kalpler devam etmek için izin verilen dayak kaldırmadan ilaç ve embriyonik gelişim devam ediyor normal kalp tekrar photoconverted EdCs daha sonra gelişimsel zamanda noktada yüksek çözünürlükte görüntüleme için durduruluncaya kadar. İkinci protokolünün bir parçası olarak bir iki boyutlu harita üç boyutlu yapısını floresan sinyalini eşleyerek genç embriyo AVC photoconverted veya photoconverted olmayan bir bölgede uzunluğunu ölçmek için bir görüntü analiz yöntemi açıklar . Birlikte, protokol iki bölümden bir Zebra balığı AVC ve Atriyoventriküler kalp kapakçığı oluşturan ve potansiyel olarak mutantlar, morphants veya ile tedavi edilmiş embriyoların eğitimi için uygulanan olabilir hücreleri davranışını ve kökeni incelemek izin verir reaktifler AVC ve/veya Vana geliştirme bozabilir.

Örnek olarak bir embriyo photoconverted 48 hpf ve tekrar 80 yansıma hpf gösterilen Şekil 2, film 1 ve 2. Kaede geri dönüşümsüz 405 nm ışığa maruz yeşil ya da kırmızı kendi formu ile takip edilmesi ile etiketli hücreleri davranışını etkinleştirme dönüştürür floresan yeşil şekliyle protein flüoresan kırmızı forma,--dan onların differentially renkli için saygı Komşular Vana oluşumu sırasında. 48 hpf AVC kaç photoconverted hücrel...

Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Bu işlemin genel amacı, atriyoventriküler kanal ve kalp kapakçığı oluşumu sırasında endokardiyal hücreleri takip etmektir. Bu yöntem, endokardiyal hücrelerin farklı mutant türlerinde nasıl davrandığını anlamak gibi kardiyak gelişim alanındaki kilit soruyu ele almaya yardımcı olabilir. AVC ve kapak oluşumu sırasında hücrelerin izlenmesi, kalbin hızlı atması nedeniyle zordur.Geleneksel hızlandırılmış mikroskopi ile hücreleri takip etmeyi zorlaştırır. Bu tekniğin temel avantajı, bu zorlukların bir kısmını atlamasıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Renee olacak.Metin protokolüne göre bir kalıp oluşturduktan sonra, yaklaşık 1,5 mililitre erimiş %1 agarozu 35 milimetrelik plastik bir montaj kabına pipetleyin. Ardından, kalıp ile agaroz arasında hava sıkışmamasına dikkat ederek plastik kalıbı sıvı agarozun içine yerleştirin. Agaroz sertleşene kadar tabağı dört santigrat dereceye yerleştirin.Ardından plastik kalıbı agarozdan çıkarın. Daha sonra, montaj kabına iki mililitre önceden hazırlanmış montaj ortamı ekleyin ve çözeltinin agaroza yayılması için 15 ila 30 dakika bekleyin. Bu arada, tüpü yaklaşık beş dakika boyunca 70 derecelik bir ısı bloğuna yer

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Burada, canlı zebra balığı embriyosunda fotokonverte edilebilir floresan proteinlerin (PCFPs) fotoaktive anahtarlaması ve fotokonverte edilmiş proteinin gelişim sırasındaki belirli zaman noktalarında takibi için bir yöntem sunmaktayız. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmadaki farklı gelişimsel süreçlerin temelini oluşturan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine olanak tanır.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.

Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Keşfedin endokard hücrelerinin atriyoventriküler kanal ve kalp kapakçığı oluşumu sırasında takibini canlı Danio rerio embriyolarında. Bu yöntem, kalp gelişimi mekanizmalarını anlamak için değerli bir araç sunar.

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

Daha fazla video keşfet