Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

Bu işlemin genel amacı, atriyoventriküler kanal ve kalp kapakçığı oluşumu sırasında endokardiyal hücreleri takip etmektir. Bu yöntem, endokardiyal hücrelerin farklı mutant türlerinde nasıl davrandığını anlamak gibi kardiyak gelişim alanındaki kilit soruyu ele almaya yardımcı olabilir. AVC ve kapak oluşumu sırasında hücrelerin izlenmesi, kalbin hızlı atması nedeniyle zordur.

Geleneksel hızlandırılmış mikroskopi ile hücreleri takip etmeyi zorlaştırır. Bu tekniğin temel avantajı, bu zorlukların bir kısmını atlamasıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Renee olacak.

Metin protokolüne göre bir kalıp oluşturduktan sonra, yaklaşık 1,5 mililitre erimiş %1 agarozu 35 milimetrelik plastik bir montaj kabına pipetleyin. Ardından, kalıp ile agaroz arasında hava sıkışmamasına dikkat ederek plastik kalıbı sıvı agarozun içine yerleştirin. Agaroz sertleşene kadar tabağı dört santigrat dereceye yerleştirin.

Ardından plastik kalıbı agarozdan çıkarın. Daha sonra, montaj kabına iki mililitre önceden hazırlanmış montaj ortamı ekleyin ve çözeltinin agaroza yayılması için 15 ila 30 dakika bekleyin. Bu arada, tüpü yaklaşık beş dakika boyunca 70 derecelik bir ısı bloğuna yerleştirerek% 0.7 düşük erime noktasına sahip bir mililitrelik bir alikotu veya LMP, agarozu eritin.

LMP agarozu hafifçe soğutmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, tüpe mililitre trikaya başına 25 mikrolitre sekiz miligram ve 40 mikrolitre bir molar BDM çözeltisi ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Ardından, LMP agarozunu sıvı halde tutmak için tüpü 38 santigrat derecelik bir ısı bloğuna aktarın. Embriyoları iki mililitre montaj ortamı içeren ayrı bir kaba aktarın. Daha sonra, kalpler atmayı bıraktığında, embriyoları montaj kabına aktarın ve onları 25 derecelik bir açıyla uzanacak şekilde oyuklara yerleştirmek için forseps kullanın, kuyruklar kuyunun daha derin kısmına doğru bakacak şekilde, yumurta sarısı yukarı bakacak şekilde.

Embriyolar kabaca yerine oturduğunda, ortamı çıkarın ve bunları trikin ve BDM içeren yaklaşık 200 mikrolitre% 0.7 LMP agarozuna gömün. Ardından, embriyo pozisyonlarını gerektiği gibi sola veya sağa eğerek yeniden ayarlayın. Fazla agarozun montaj kabının yan bölgelerine taşmasına izin vermek için girintili karenin duvarlarına bastırın.

LMP agarozun sertleşmesi için yaklaşık beş dakika bekleyin, ardından tabağa montaj ortamı ekleyin. Embriyolar artık fotokonversiyona hazır hale getirilmeye hazırdır. Fotodönüşümü gerçekleştirmek için, 405, 488 ve 561 nanometre lazer kaynaklarıyla donatılmış dik bir konfokal mikroskopta, embriyonun kalbini bulmak için iletilen beyaz ışığı ve objektif bir lensi kullanın.

561 nanometre lazeri kullanarak kırmızı Kaede floresansını kontrol edin. Ardından, endokardları görselleştirmek için 488 nanometre lazeri kullanın. Ardından, mikroskop edinme yazılımında FRAP moduna girin.

Ardından, hem 488 hem de 561 nanometre lazerler için yaklaşık %1 lazer gücü seçin. İlgi düzlemine odaklanırken, bir ilgi alanı veya yatırım getirisi seçin. Ardından, %25 lazer gücünde 405 nanometre diyot lazeri kullanarak, hücreleri fotodönüştür ve yatırım getirisini üç kez tarayın.

ROI'de yetersiz Kaede fotodönüşümü olursa, 405 nanometre lazeri alan üzerinde üç kez tekrar tarayın. Yazılımda TCS SP8 moduna dönün ve 561 ve 488 nanometre lazerleri sırayla kullanarak, Çift Yönlü modda bir Z yığını elde edin. Fotokonversiyondan sonra, LMP agarozunu kırmak için embriyonun başının hemen üzerine hafifçe bastırmak için bir cam pipet kullanın.

Ardından, embriyoyu nazikçe emdirin. BDM içeren ortamı yıkamak için, embriyoyu cam pipetten PTU'lu embriyo ortamı içeren 85 milimetrelik bir Petri kabına çıkarın. Embriyoyu, PTU'lu embriyo ortamı içeren altı oyuklu bir plakadaki bir kuyucuğa aktarın.

Bu adım sırasında, hangi embriyonun hangi kuyuya girdiğini not ettiğinizden emin olun, çünkü bu, daha sonraki gelişim aşamalarında fotokonvertif hücrelerin konumunu ilişkilendirmek için gereklidir. Artık embriyolar BDM içeren ortamdan çıkarıldığına göre, kalpleri yaklaşık beş dakika içinde tekrar atmaya başlamalıdır. Normal şekilde gelişmeye devam etmelerini sağlamak için embriyoları 28.5 santigrat derecede karanlığa geri koyun.

İstenilen aşamada, kalbi durdurun ve bu videoda daha önce gösterildiği gibi embriyoları yeniden gömün, embriyoların BDM ile onları takip etmek için ayrı, işaretli kaplarda tedavi edilmesi gerektiği önemli bir farkla. 62 hpf'ye kadar olan embriyolar için, kırmızı ve yeşil floresan sinyaller için sırasıyla 561 ve 488 nanometre kullanarak endokardın Z yığınlarını elde edin. 62 hpf'den daha eski embriyolar için, 488 nanometre lazer yerine yeşil Kaede'yi görüntülemek için 940 nanometreye ayarlanmış bir multifoton lazer kullanın.

48 hpf'den daha genç embriyolar için, üç boyutlu AVC'yi analiz için iki boyutlu bir görüntüye yansıtmak mümkündür. İlk olarak, görüntüyü eşikleyin. Ardından, kalbin dışında kalan noktaları silin.

Manuel segmentasyon yapmak için, soldaki görüntüyü sağdaki görüntüyle eşleşecek şekilde yönlendirin. Turuncu vektörün geçtiği kalbin kenarını bölümlere ayırın ve mavi vektör yönünde noktalar ekleyin. Ardından, kesitleri enterpolasyon yapın ve renk yoğunluğunu yüzeye yansıtın.

Son olarak, ESÜ'nin yönünü ayarlayın ve 2B bir yüzeye yansıtın. 48 hpf'de fotokonversiyondan hemen sonra embriyonik bir kalp örneği burada gösterilmiştir. ESÜ'nin üst tarafındaki birkaç hücredeki sitoplazmik Kaede, yeşilden kırmızıya dönüştürülmüştür.

80 hpf'deki aynı embriyoda, fotokonvertif hücrelerin çoğaldığı ve üst atriyoventriküler kapağın iç tarafına göç ettiği açıktır. Atriyum ve ventriküldeki EdC'lerin fotokonversiyona uğradığı 36 hpf'lik bir embriyo örneği burada gösterilmiştir. AVC daha sonra daha kolay görselleştirme ve analiz için iki boyuta yansıtılır ve birinin iki foto-dönüştürülmüş bölge arasındaki mesafeyi ölçmesine olanak tanır.

Bu prosedürü denerken, normal gelişimi etkilememek için kalbin durma süresini minimumda tutmak önemlidir. Uygulama ile foto dönüşüm, her şeyin önceden hazırlanması şartıyla yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı zebra balığı embriyosunda fotokonversiyondan sonra endokardiyal hücrelerin nasıl izleneceğini iyi anlamalı ve veri setlerinizi analiz etmelisiniz.