Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Aşağıdaki tekniklerin genel amacı, yeni başlayan araştırmacıları üniversite öğretim laboratuvarında ve lise sınıf ortamlarında Streptomyces ve diğer ilgili türlerle çalışmak üzere eğitmektir. Fenotipik gözlem, Streptomyces araştırma alanına giren birçok araştırmacı için önemlidir. Bu videoda bakteri üremesi, depolanması ve görsel ve mikroskobik inceleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Burada açıklanan fenotpi yöntemleri, model olarak Streptomyces coelicolor'u kullanır. Bununla birlikte, yöntemler büyük cinsin tüm üyelerine ve yakından ilişkili Actinomyces'e uygulanabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, bir lise sınıfında veya lisans öğretim laboratuvarında acemi araştırmacıların yanı sıra deneyimli laboratuvar personeli için erişilebilir olacak şekilde tasarlanmış olmalarıdır.

Bu videoyu izledikten ve beraberindeki protokolü okuduktan sonra, yeni araştırmacılar Streptomyces suşlarını manipüle edebilmeli, uygun şekilde saklayabilmeli ve görsel karakterizasyon deneylerine başlayabilmelidir. Prosedürleri gösteren, Otterbein Üniversitesi'ndeki laboratuvarımdan lisans araştırma öğrencileri Garret Kandell ve Sean Kirk olacak. Başlamak için, Streptomyces suşlarını MS agar plakalarına ve kültüre MS agar plakalarına çizgi yapmak için Saunders 2012'de gösterilen kadran çizgi yöntemi gibi standart bir yöntem kullanın.

Her dört ila altı günde bir, tek bir koloni seçin ve taze bir tabağa tekrar çizin. Koloniler yaşlandıkça rastgele mutasyona yatkın hale gelirler. Metin protokolüne göre mutajenez gerçekleştirdikten sonra, vahşi tip ana suşa kıyasla her mutant için koloni morfolojisine dikkat edin.

Yeni Streptomyces türlerini karakterize ederken, yeni izolatı, temel şekli, koloninin yüzeyini, opaklığını, yüksekliğini ve pigmentasyonunu not ederek iyi çalışılmış bir türün izolatıyla karşılaştırın. Bir MS agar plakasını etiketleyin ve kama desenlerinde vahşi tip ve mutant suşları çizgilendirin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için hiçbir suşun başka bir suşa temas etmemesine dikkat edin.

Suşların plakaya çizildiği tarih ve saate dikkat edin. Daha sonra plakaları 30 santigrat derecede inkübe edin. Unutmayın, Streptomyces numunenizi her zaman kontaminasyondan korumanız son derece önemlidir.

Tüm adımlar için en iyi steril tekniği kullanın: plakaları ve tüpleri mümkün olan en kısa sürede açın. Arka planı homojen hale getirmek için yetiştirilen Petri kaplarını renkli veya beyaz kağıda yerleştirin. Kağıda suş adını, tarihini, inkübasyon sıcaklığını ve ilk plaka çizgisinden itibaren geçen süreyi yazın.

Karışıklığın en aza indirilmesi için kağıt arka plan üzerine yazılan gerinim bilgileri ile plakanın dijital resimlerini çekin. Cımbızları %70 etanolde yıkayarak ve ardından etanolü buharlaştırmak için bir Bunsen brülör alevinden geçirerek sterilize edin. Lamelleri %70 etanolde yıkayarak ve ardından steril bir Petri kabında kurumaya bırakarak sterilize edin.

Daha sonra, bakteri üremesi için bir lamel asansörü hazırlamak için, steril bir lamel almak için steril cımbız kullanın ve lameli bakteri üremesinin yoğun olduğu bir MS agar plakasına yerleştirin. Cımbız kullanarak, bakteri sporlarının ve hava miselyumunun yeterli transferini sağlamak için lamel arkasına hafifçe bastırın. Lameli plakadan alın ve hücre malzemesi 15 mikrolitrelik bir damla %50gliserol içeren bir mikroskop lamının yüzeyine bakacak şekilde 45 derecelik bir açıyla yerleştirin.

Lamelin gliserolün üzerine düşmesine izin verin, bu da hava kabarcıklarını azaltacaktır. Çeşitli zaman aralıklarında faz kontrast mikroskobu yapmak için, hazırlanan slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve lamel ortasına bir damla daldırma yağı ekleyin. 100x faz hedefini yerine döndürün ve kondenser taretini uygun eşleşen faz ayarına ayarlayın.

Objektif lensi yağ ile temas ettiğinde, görüntüyü odaklamak için yalnızca ince ayar düğmesini kullanın. Mutant suşlar ve vahşi tür arasındaki gözle görülür ve tutarlı farklılıkları ayırt etmek için çeşitli görüş alanlarını inceleyin. Spor oluşturma yeteneği, spor boyutu ve şekli ve toplam spor sayısı gibi.

Steril cımbız kullanarak, bakteri sporlarının ve hava filamentlerinin yeterli transferini sağlamak için lamelin arkasına cımbızla hafifçe dokunarak, bakteri üremesinin belirgin olduğu bir MS agar plakasından daha önce olduğu gibi bir lamel kaldırma hazırlayın. Lameli plakadan alın ve lamelin kolaylık ve manipülasyonu için hücre malzemesinin bulunduğu taraf yukarı bakacak şekilde kart stoğuna yerleştirin. Buz gibi soğuk metanol ile lamel doldurun ve beş dakika bekletin.

PBS kullanarak, solüsyonu nazikçe dağıtarak ve çıkararak lameli iki kez yıkayın. Bir slayta mililitre propidyum iyodür çözeltisi başına 10 mikrogram 15 mikrolitre ve veya mililitre WGA-FITC başına 10 mikrogram ekleyin. Lameli yüzü aşağı bakacak şekilde bir damla floresan leke üzerine yerleştirin.

Numuneleri karanlık veya loş ışıklı bir odada 15 dakika inkübe edin. Floresan lekelerin ve leke örneklerinin stokları ışıktan korunmalıdır. Araştırmacıların numuneleri hazırlarken düşük ışık koşullarını kullanmaları ve numuneler hazırlandıktan sonra tutmak için karanlık bir kutu kullanmaları önerilir.

Promidyum iyodür ve FITC için epifloresan uyarma küpleri ile donatılmış bir faz kontrastı veya DIC mikroskobu kullanarak slaytları 100x objektif lens altında gözlemleyin. Görüntüleri metin protokolüne göre analiz edin. Burada, transpozon mutajenezinden kaynaklanan Streptomyces mutantlarının örnekleri gösterilmiştir.

Daha açık renkli bir hava miselyumu, sporülasyondaki bir kusurun neden olduğu daha düşük bir gri pigment seviyesini gösterebilir. Veya bulanık bir görünümün olmaması, hava miselyum oluşumunda bir bloğun göstergesidir. Faz kontrast mikroskobu ile görüldüğü gibi, yabani tip S.coelicolor kolonileri tipik olarak yaklaşık iki günlük büyüme ile bir hava miselyumu üretir.

Ve üç günlük büyüme ile uzun spor zincirleri. Beyaz mutantlar ya spor oluşumu için gecikebilir, üretilen sporların bolluğunda bir azalma gösterebilir, şekil ve/veya boyut kusurlu sporlar üretebilir ya da sadece olgun, gri spor pigmentinin daha düşük seviyelerini üretebilir. Burada PI boyamalı DIC ve floresan mikroskobu kullanılarak gösterilen, vahşi tip bir numunede bir spor zinciri için düzenli aralıklı boyama, bir kromozom ayrışma kusuru gösteren iki transpozon yerleştirme mutantı için aralıklı boyama modeli ile karşılaştırılır.

Hücre duvarını boyamak için WGA-FITC'yi kullanan vahşi tip S.venezuelae suşuşu, spor zincirleri arasında pürüzsüz hava filamentleri olarak bulunur. Ve tipik olarak sporülasyon sırasında görülen yanal benzeri bölünme septa dizisini sergiler. İpliksi bir organizma ile çalışmak, iyi bilinen, çubuk şeklindeki bir bakteri ile çalışmaktan çok farklıdır.

Buradaki video protokolleri, Streptomyces araştırma alanına giren yepyeni araştırmacılar için önemli bir kaynak görevi görmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, Streptomyces türlerini ve diğer ilgili bakterileri incelemeye nasıl başlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu ilk deneylerin ardından, Streptomyces suşlarınız hakkında daha fazla bilgi edinmek için bir araştırma laboratuvarında çeşitli teknikler kullanılabilir.

Örneğin, gelişmiş tekniklerden bazıları, gerçek zamanlı PCR ve RNA dizilimi gibi protein etiketleme veya gen ekspresyonu analizleri olabilir. İlk fenotipleme deneyleri, yeni suşları tanımlamak ve karakterize etmek ve belirli bir genin tipik rolünü ayırt etmek için kullanılır. Bu yöntemler, çok çeşitli Streptomyces suşlarını tanımlamak ve karakterize etmek için üniversite öğretim laboratuvarlarında zaten kullanılmıştır.