Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi

Bu protokolün genel amacı, transgenik kemirgenlerin kültürlenmiş hücrelerinde veya ilgilenilen kimyasal ve fiziksel ajanlarla tedavi edilen ilgili hayvanlarda Lambda Select cII mutasyon testinde yer alan adım adım prosedürleri görselleştirmektir. Bu test yöntemi, mutasyon araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin: Bir test bileşiği mutajenik midir? Ve eğer öyleyse, ne kadar güçlü bir mutajen?

Diziye özgü mutasyonları indükler mi? Bu tekniğin ana avantajı, hemen hemen her test bileşiği için minimal olmasıdır. Yöntem, kromozomal olarak entegre edilmiş bir raportör gen kullanılarak memeli hücrelerinde mutajenite testi için kullanılabilir.

Tek bir paketleme reaksiyonu oluşturmak için, ilk reaksiyon karışımını içeren bir mikro santrifüj tüpüne beş mikrogram genomik DNA ekleyin. Daha sonra tüpü 30 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüpe 12 mikro litre ikinci reaksiyon karışımı ekleyin ve 30 santigrat derecede 90 dakika daha bırakın.

90 dakika sonra, tüpe 1.1 mililitre SM tamponu ekleyin. Daha sonra, paketlenmiş DNA ile tüpü oda sıcaklığında yaklaşık 10 saniye kuvvetlice girdaplayın. Mikro santrifüjde hızlı bir şekilde nabız dönüşü yapın.

Ardından tüpü kullanana kadar buz üzerinde bırakın. Daha sonra, paketlenmiş DNA'nın her mililitresi için 50 mikrolitre kloroform ekleyin. Numune aynı gün işlenmeyecekse, numuneyi nazikçe vorteksleyin ve iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın.

Tek bir paketlenmiş DNA örneği için 16 steril yuvarlak tabanlı tüp ve 16 TB1 agar plakası hazırlayın. Tarama için on tüp ve titre için altı tüp kullanın. Daha sonra her yuvarlak alt tüpte 300 mikrolitre G1250 kaplama kültürü alın.

Daha sonra, titre etmek için, 990 mikrolitre SM tamponuna ve 1:100 seyreltmeye 10 mikrolitre paketlenmiş DNA ekleyin. Ardından numuneyi girdaplayın. Sırasıyla üç titre 20 veya titre 100 tüpün her birine 20 veya 100 mikrolitre 1:100 DNA çözeltisi ekleyin.

Tarama amacıyla, 10 tarama tüpünün her birine 100 mikrolitre seyreltilmemiş paketlenmiş DNA örneği ekleyin. 16 titre ve eleme tüpünün tümünü işleyin. Bileşenleri karıştırmak için tüpleri 10 saniye boyunca vorteksleyin.

Daha sonra, konakçı E.coli'nin fajları emmesi için tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, 2,5 mililitre erimiş TB1 üst agar ekleyin. Bu 55 santigrat dereceyi uygun titre ve tarama tüplerine kadar koruyun.

Ekledikten sonra, tüpleri hemen hafifçe girdaplayın. Şimdi, TB1 agarını uygun titre veya eleme TB1 agar plakasına dökün. Plakaların oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika bekletilmesine izin verin.

Agar katılaştıktan sonra, 10 eleme plakasının tümünü ters çevirin ve sabit inkübatörde 24 santigrat derecede 46 ila 48 saat bekletin. Kalan altı titre plakasını gece boyunca veya bir gün boyunca 37 santigrat derecede sabit bir inkübatörde bırakın. 37 santigrat derecede inkübasyonun ardından, 3 titre 20 ve titre 100 plakanın tümünde oluşan plak sayısını sayın.

24 santigrat derecede inkübasyonun ardından, 10 tarama plakasında oluşan plakların sayısını sayın. Putitif mutant plakları doğrulamak için, plakayı steril geniş delikli bir pipet ucuyla çekirdekleyin. Daha sonra plağı 500 mikrolitre steril SM tamponu ile doldurulmuş steril mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra mikro santrifüj tüpünü oda sıcaklığında oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Daha sonra, özlü faj çözeltisinin bir mikrolitresini steril yuvarlak tabanlı bir tüpte 200 mikrolitre G1250 kaplama kültürü ile karıştırın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, özlü faj çözeltisini 2,5 mililitre erimiş TB1 üst agar içinde kaplayın ve 24 santigrat derecede 46 ila 48 saat inkübe edin. İkincil plaklar görünür hale geldiğinde, iyi izole edilmiş tek bir Lambda cII mutant plak seçmek için bir pipet ucu kullanın. Plakayı birkaç kez pipette 25 mikrolitre çift damıtılmış su ile doldurulmuş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü beş dakika kaynar suda bırakın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden hemen sonra, 10 mikrolitre süpernatantı 40 mikrolitre PCR ana karışımı içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

PCR amplifikasyonundan sonra, 432 baz para-amplifiye edilmiş ürünü, PCR saflaştırma kiti kullanılarak dahil edilen cII geni ve yan bölgeleri ile saflaştırın. Daha sonra mutasyonları tespit etmek için bir DNA analizörü kullanarak cII transgenini sıralayın. Hem titre 20 hem de titre 100 plakalarında elde edilen plaklar, beyaz bir ışık kutusunun yanında ve koyu bir arka plana karşı tutularak açıkça görülebilir.

Burada, çubuk grafik, test edilen fiziksel bileşiklerdeki çeşitli kimyasalların mutajenik gücünü göstermektedir. Bu, fare embriyonik lif blastlarından izole edilen nispi cII mutant frekansındaki artışın derecesini analiz ederek yapılır. Çubuk grafik, cII mutant frekansında istatistiksel olarak anlamlı kat artışı gösteren tüm bu test reaktiflerini göstermektedir.

Daha sonra, UVB ile ışınlanmış fare embriyonik lif blastlarındaki cII transgeninin mutasyon spektrumları gösterilmiştir. Pasta grafiği, kontrolle karşılaştırıldığında, pirimidin dinükleotidlerinde tek veya tandem sitidin timidin timidin geçişine nispi sıklığında önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, kültürlemede bakteri çizgi plakası için hazırlık süreleri hariç, uygun şekilde uygulanırsa sekiz ila on saat içinde yapılabilir.

DNA diziliminde, cII mutantlarının puanlanmasını takiben. Bu videoyu izledikten sonra, bir in vitro model sisteminde bir test bileşiğinin mutasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.