Name: Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Öğrenin, transgenik kemirgilerin kültür hücrelerinde Lambda Select cII mutasyon testi ile mutajenite değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, kimyasal ve fiziksel ajanların mutajen potansiyelini belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tüm meslektaşlarımızın katkıları ve ortak çalışanlar, sonuçlar için bu el yazması (görsel amacıyla) sevk edilmiştir orijinal çalışmalarımız için kabul etmek istiyoruz. Yazarların iş hibe Ulusal Enstitüsü diş ve ulusal sağlık Enstitüleri (1R01DE026043) AB için kraniyofasiyal araştırma ve California Tobacco-Related hastalığı araştırma programı için AB (Üniversitesi tarafından desteklenmektedir TRDRP-26IR-0015) ve ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorlar çalışmanın çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, veri yorumu, rapor yazma veya yayın için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

1. fare embriyonik fibroblastlar genomik DNA izolasyonu
Not: Birincil fare embriyonik fibroblastlar göre yayımlanmış protokolü53C57BL/6 genetik arka plan ile BB transgenik fareler türetilen embriyo etkilenmezsiniz. Bu iletişim kuralı için başlangıç materyali 1 x 106 -bileşik karşı test denetimi ile tedavi 1 x 107 embriyonik fibroblast hücreleri oluşur. Hasat ve standart yöntemlerle bu hücrelerin sayma başvurular10,54,55açıklanmıştır.
<ol><li>Hazırlamak bir (0,3 M Sükroz, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM spermidine, 0.15 mM spermine ve 2 mM EDTA) tampon, tampon B (150 mM NaCl ve 5 mM EDTA, pH 7.8) ve C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 arabellek 20 mM NaCl, 20 mM EDTA ve % 1 SDS) peşin ve en çok bir yıl54,55(RT) oda sıcaklığında koru.</li>
	<li>Geniş bir yelpazede kullanarak yukarı ve aşağı üst üste pipetting tarafından 15 mL konik santrifüj tüpü A 1000 µL pipet ucu delik 2-4 mL arabellek hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) arabellek A içeren %1 octylphenoxypolyethoxyethanol (örneğin, Nonidet P40) ekleyin cam serolojik pipet kullanarak.</li>
	<li>Buz 5 min için tüp kuluçkaya.</li>
	<li>1000 x g RT., 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atın ve Pelet 10-15 mL arabellek kullanarak bir cam serolojik pipet ile yıkayın.</li>
	<li>Pelet 2-4 mL arabellekte B. resuspend</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) arabellek C içeren 600 µg/mL İndinavir K. Ekle</li>
	<li>Tüp 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya</li>
	<li>RNase A 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	<li>Tüp bir ek 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) fenol ekleyin (0.1 doymuş M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alkol (25:24:1 vol/vol). Not: Fenol ağır sağlık tehlike oluşturabilir ve olağanüstü dikkatle ele alınması gerekir. Fenol cilt için son derece korozif ve içinden kolayca emilir ve diğer efektler sergiler. Fenol, işleme her zaman kullandığınızda double gloving, koruyucu gözlük giymek ve kimyasal duman mahallede iş.</li>
	<li>İyi bir tüp rotator 4 ° C'de 5 min için tüp ters çevirme tarafından mix</li>
	<li>1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Sulu faz (üst katman) için yeni bir tüp cam serolojik pipet kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Fenol: kloroform: izoamil alkol ayıklama 1-3 kat sulu faz açıktır ve arabirimidir artık bulanık kadar yineleyin.</li>
	<li>1/10 birim (200-400 µL) 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ekleyin.</li>
	<li>2.5 hacmi (5-10 mL) % 100 etanol (soğuk) ekleyin ve 2-3 dakika için elle tüpü yavaşça tersine çevirin.</li>
	<li>Bir cam kanca ile DNA biriktirmek ve %70 1 – 5 mL içeren yeni bir tüp transferi etanol ve iyice yıkayın. Alternatif olarak, DNA cips ve %70 1 – 5 mL ile iyice yıkayın için 4 ° C yüksek hızda (3.500 x g) tüp santrifüj kapasitesi etanol.</li>
	<li>Yüksek hızda (3.500 x g) tüp RT santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 10-15 dk için DNA kuruması.</li>
	<li>10-100 µL TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) DNA'daki dağıtılması ve 4 ° c (için bir ay kısa depolama) veya (daha uzun süre depolama)-20 ° C'de depolayın. λ Select CII tahlil için DNA'ın konsantrasyonu en uygun olduğunu 0.5-1.0 µg/µL (TE arabellekte)56.</li>
</ol>2. Vitro ambalaj tepki
<ol><li>Bir ambalaj tepki ~ 5 µg genomik DNA ekleyin (son hacim: 8 – 12 µL, genomik DNA Bölüm 1 ' fare embriyonik fibroblastlar tedavi vitro bileşik bir testiyle veya denetiminden izole) ilk içeren bir microcentrifuge Tube reaksiyon mix (~ 10 µL). Not: İçinde-ev hazır veya piyasada bulunan λ ambalaj özleri farklı laboratuvarlarda kullanılır. Ticari ambalaj özü kiti burada56 kullanılan (bkz. Tablo reçetesi) kırmızı tüpler ilk tepki mix (~ 10 µL) ve mavi tüpler bulunan ikinci reaksiyon mix (en az 5 tepkiler ~ 70 µL).</li>
	<li>30 ° C'de 90 dk için tüp kuluçkaya</li>
	<li>Gerekli birim (~ 12 µL) tüp ikinci reaksiyon karışımı ekleyin.</li>
	<li>Tüp bir ek 90 dk 30 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>
SM arabellek 1.1 mL tüp ekleyin. Not: Bu çözüm (Yani, ambalaj tepki karışımı) 1 mL λ CIIeleme için kullanılan-mutant. Geri kalan titering için kullanılır.<ol>
<li>SM arabellek 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL karıştırarak hazırlayın 1 M Tris-HCl (pH 7.5) ve 5 mL %2 (w/v) jelatin. DH2O son hacmi 1 litre, otoklav ilâ 1 yıl için oda sıcaklığında 30 dk. mağaza için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girdap 10 için paketlenmiş DNA örneği içeren tüp RT (dinç vortexing), s.</li>
	<li>Nabız microcentrifuge ve buz üzerinde mağaza tüpte kullanıma hazır kadar spin. Örnek ambalaj aynı gün içerisinde kullanılacak gitmiyor, kloroform mL paketlenmiş DNA'ın başına 50 µL ekleyerek her örnek, girdap yavaşça ve 2 hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. E. coli G1250 bakteriyel kültür hazırlama
<ol><li>
En az iki gün önce kaplama, Escherichia coli (e.coli) G1250 TB1-sefaloridin agar Tabaklarda gelen birkaç bakteriyel çizgi plakaları olun.
	<ol>
<li>TB1-sefaloridin Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g agar karıştırın. 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. PH 7.0 NaOH veya HCl. Ekle ile ayarlamak dH2O son hacmiyle 1 litre.</li>
		<li>Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C'ye soğutmak için izin ver 50.0 mg sefaloridin ekleyip karıştırın. Steril 100-mm petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün. Tabaklar 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakteriyel çizgi plakaları bir sabit 30 ° C kuluçka için en az 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>
Bir gün önce kaplama, TB1 sıvı orta 10 mL % 20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 çözüm bir steril 50 mL vidalı kapak konik tüp 100 µL ile birleştirir.
	<ol>
<li>TB1 sıvı orta şekilde hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl ve 10.0 g kazein pepton, 800 mL dH2O, 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür, ekleyebilir ve 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilirsiniz. Mix iyi ve otoklav 30 dakika süreyle RT orta üç aya kadar saklamak, sonra dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.</li>
		<li>%20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 20.0 g maltoz ve 24.6 g MgSO4. 7H2O, o zaman 100 mL nihai bir birime dH2O ekleyin. Filtre sterilize ve 6 aya kadar 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sömürgeler steril inoculating döngü56kullanarak bakteriyel çizgi plaka ile sıvı orta aşılamak.</li>
	<li>Sıvı kültüründe gecede 30 ° C ile dinç (250 – 300 rpm) sallayarak kuluçka sallayarak kuluçkaya.</li>
	<li>Kaplama günde konik tüp G1250 sıvı kültür 1.500 x g RT bakteri hücreleri cips, 10 min için de içeren santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atın ve hücre Pelet 10 mL 10 mM MgSO4resuspend.</li>
	<li>1:10 Absorbans ölçmek seyreltme hücre süspansiyon, bir UV-VIS Spektrofotometre (örneğin, 100 µL hücre süspansiyon + 900 µL 10 mM MgSO4)56kullanarak dalga boyu 600 nm.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 0,5 ile 10 mM MgSO4son OD600 oranında seyreltin. G1250 E. coli OD600 ile hazırlanan süspansiyon = 0,5 'G1250 kaplama Kültür' adlandırılır.</li>
	<li>G1250 kaplama kültür buza kapaklarý takýlý içinde 1-2 h.</li>
</ol>4. kaplama paketlenmiş DNA örnekleri
<ol><li>
Bir paket DNA örneği on altı steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüpler ve on altı TB1 Ağar kaplamalar hazırlayın. 10'dan her küme için tarama ve altı titering (titresi 20 3) ve üç titresi 100 için kullanılacaktır.
	<ol>
<li>TB1 Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g Agar, sonra 800 mL dH2O ve 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilir ve dH2O 1 L. son bir hacim için ekleyebilirsiniz</li>
		<li>Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C-cool, sonra steril 100 mm Petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün karışımı sağlar. Plakayı 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın. Not: En az 24 kullanılmadan önce s TB1 Ağar kaplamalar hazırlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her yuvarlak alt tüpün içine G1250 kaplama kültürünün aliquot 200 µL.</li>
	<li>
Titering için1: 100 seyreltme paketlenmiş DNA örneği yapmak ve de vortexing tarafından (Yani, 10 µL paketlenmiş DNA örneği + 990 µL SM arabellek) karıştırın.</li>
	<li>1: 100 seyreltme 20 µL her üç titresi 20 tüpler için ekleyin.</li>
	<li>1: 100 seyreltme 100 µL her üç titresi 100 borular için ekleyin.</li>
	<li>
Tarama için100 µL Ekle 'su katılmamış ' her on tarama tüplerinin paketlenmiş DNA örneği.</li>
	<li>Tüm titering ve tarama tüpler işlemek (2 x 3 + 10 = 16 tüpler), aşağıdaki gibi: mix de tarafından yaklaşık 10 için vortexing s ve sonra ana bilgisayarın E. coli phages absorbe sağlamak 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>
Mikro dalgada erimiş TB1 kontör agar (55 ° C için soğutmalı) her titresi veya tüp, eleme hemen vortexing tarafından (), karışımı yavaşça 2.5 mL ekleyin ve uygun titresi dökme veya TB1 Ağar kaplamalar eleme.
	<ol>
<li>TB1 en iyi agar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 7.0 g Agar, sonra 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin, sonra 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlama. Son olarak, dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.</li>
		<li>İyi ve otoklav 20-25 dk. mağaza oda sıcaklığında üç aya kadar karıştırın.</li>
		<li>Kullanım önce hazır TB1 en iyi agar bir mikrodalga eritmek, iyice karıştırın ve bir su banyosu içinde 55 ° C için soğumasını bekleyin. Not: Erimiş ve soğutulmuş TB1 üst her titresi veya tarama tüp içeriği eklenir ve karıştırma sonra uygun titresi veya tarama TB1 agar tabak dökülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15-30 dakika oda sıcaklığında, yoğunlaşma önlemek için Aralık kapaklı stand plakaları ver.</li>
	<li>Tabakları ters çevir ve sabit 24 ° C kuluçka makinesine on tarama tabak yerleştirin ve 46-48 h (Yani, seçici koşullar) ve sabit 37 ° C kuluçka altı titresi plakaları için kuluçkaya ve 24 saat kuluçkaya / (Yani, bir gecede Seçici olmayan koşullar). Not: kalite güvence ve sonuçları standardizasyonu için bilinen mutant frekans ile wildtype ve mutant CII karışımı içeren ticari olarak kullanılabilir denetim fajının çözümler paketlenmiş DNA örnekleri kaplama ve tüm tahlil56çalışır.</li>
</ol>5. inceleme titresi ve eleme plakaları CII Mutant frekansı belirlemek için
<ol><li>37 ° C'de 24 h/gecede kuluçka sayısı plaklar sayısı her üç titresi 20 tabakalar ve titresi 100 tabak içinde oluşmuş. Plaklar daha kolay tanımlamak için plaka beyaz bir ışık kutusunun yanındaki ve karanlık bir arka plan (bkz. Şekil 2) kaldırıldı kapak ile tutun.</li>
	<li>Plaklar sayısı ortalama (ortalama) sayılan titresi 20 tabak ve titresi 100 tabak her kümede yapmak (her triplicate).</li>
	<li>Ortalama 50-200 plaklar plaka set başına dizi yakın düşüyor titresi plakaları kümesinden seçin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi on tarama levhalar yaylıdır ekranlı plaklar toplam sayısını hesaplar: Toplam ekranlı plaklar (ortalama sayısı plaklar titresi plakaları ÷ seyreltme µL sayısı seçilen titresi plaka kullanılan seçilen küme) = seyreltme faktörü x x µL plaka [100 µL/plaka] eleme başına paketlenmiş DNA örneği sayısı x tabak [10] tarama sayısı. Not: Örneğin, plaklar titresi 20 plakaların kümedeki plaka başına ortalama sayısı 128'dir ve 478 titresi 100 plakaların kümedeki karşılık gelen sayıdır, sayı 128 ekranlı plaklar toplam sayısı hesaplanması için kullanılır , aşağıdaki gibi: (128 ÷ 20) x 100 [µL/plaka] x 10 [plakaları] x 100 [seyreltme faktörü] 640.000 = Bu ortalama titresi 20 plakaları veya titresi 100 Kaplamalar, sayıları sırasıyla temel alıyorsa plaklar ortalama sayısı 5.000 veya 1.000, teksir makinesi için eşdeğerdir.</li>
	<li>24 ° c 46-48 h kuluçka plaklar (Bölüm 5. 1'sağlanan yönergeleri izleyin) on tarama plakaları oluşan toplam sayısını saymak. Not: CII mutant frekans tarama levhalar yaylıdır oluşan plaklar ile ekranlı plaklar toplam sayısı toplam sayısı bölünerek hesaplanır. Yukarıdaki örnekte, sayılan plaklar toplam sayısı on tarama levha kullanarak 112, CII mutant frekans bu DNA örneği için 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5olacaktır.</li>
</ol>6. Putative λ CII mutantlar doğrulanması, PCR güçlendirme ve DNA Sekanslama
<ol><li>Steril, geniş-geçişli damlalıklı ucu ile söz konusu plak çekirdek ve bu 500 µL steril SM arabelleği içeren bir steril microcentrifuge tüpüne sınırdışı (yukarı ve aşağı pipetting tarafından).</li>
	<li>Oda sıcaklığında en az 2 h için kuluçkaya veya 4 ° C'de fajının parçacıklar agar elute izin vermek için bir gecede takın.</li>
	<li>Bir steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüp G1250 kaplama kültürünün 200 µL özlü fajının çözüm 1 µL ile karıştırın ve RT., 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>2,5 mL 55 ° C erimiş TB1 üst agar kullanarak örnek plaka ve plaka 24 ° c 46-48 h (seçici koşulları), bölümler 4,8-4,10 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil plaklar oluşmuş bir pipet ucu bir tek iyi izole doğrulanmış λ CIIdikkatle almaya kılabilmesi-mutant plak (alt agar dokunmaktan kaçının). Not: sözde CII mutant plaklar Replating iki amaca hizmet eder: (i) eserler kaplama bazen yanlış olabilir küçük boyutlu plaklar için; ve (ii) bir tarama tabaktan alınan bir özel çekirdek mutant olmayan phage(s) ile birlikte bir mutant fajının içerebilir. Düşük yoğunluklu replating üzerinden ikincil plaklar PCR ve sonraki DNA dizi analizi için kirlenmemiş bir mutant şablonu sağlar.</li>
	<li>Plak yukarı ve aşağı pipetting tarafından 25 µL çift distile su içeren bir microcentrifuge tüp aktarın.</li>
	<li>Tüp 5 min için kaynar suda koyun.</li>
	<li>Maksimum hızda (18.000 x g) RT. 3 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>10 µL süpernatant, hemen 40 µL PCR mastermix reaktifleri son konsantrasyonları olan 1 x Taq PCR tampon, 10 pmol her ileriye ve geriye doğru astar, her dNTP 12.5 nmol içeren yeni bir microcentrifuge tüp transferi ve 2.5 U Taq DNA polimeraz. Not: İleriye ve geriye doğru astar aşağıdaki gibidir: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (-68 -50 CII göre için başlamak kodon pozisyonlar) ve 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (+345 365 CII başlama kodonu göre için sırasıyla pozisyonlar).</li>
	<li>Aşağıdaki Bisiklete binme parametrelerini kullanarak şablon yükseltmek: 3 dk denatürasyon 95 ° C'de 30 30 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 1 dk. 60 ° C'de ve uzantısına sahip bir son 72 ° C'de 10 dk 72 ° C'de 1 dk</li>
	<li>CII gen içeren ve piyasada bulunan PCR arıtma kitleri, kullanarak bölge kanat 432 bp PCR ürünü üreticinin yönergelerine göre arındırmak.</li>
	<li>DNA sıralama bir uygun sıralama platformu kullanarak gerçekleştirmek ve mutasyonlar CII transgene algılamak için elde edilen DNA dizilerinin analiz (aşağıdaki nota bakın). Not: Bu en iyi yazılım, web tabanlı T-kahve sıra hizalama server gibi kullanılarak başvuru CII sırası ile hizalama tarafından sağlanır. Program kullanımı hakkında yönergeler için ziyaret edin: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

λ Select CII tahlil organ/dokulardan BB kemirgenler3türetilmiş hücre genomik DNA kurtarıldı CII transgene mutasyonların tespiti için kullanılır. Bu Transjenik hayvanlar genom CII taşıdığı genetik entegre λLIZ Servisi vektör, birden çok tandem kopyalarını içerir (294 bp) ve lacI (1,080 bp) transgenes, mutational muhabir gen1, 2 , 25. λ Select CII tahlil genomik ...

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri geniş bir memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik Big Blue (bundan sonra BB adlandırılır) fareler ve λ Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için bu grup ve birçok diğer araştırma grupları dünya çapında1,2tarafından istihdam edilmiştir, 3,4,5,6,7,8,9. Son 16 yıldır, biz bu Transjenik hayvanlar kullanarak çeşitli kimyasal ve/veya fiziksel ajanların mutajenik etkileri araştırdık veya onların karşılık gelen embriyonik fibroblast hücre kültürlerinde bir test karışımı ile tedavi ve daha sonra analiz λ Select CII tahlil ve DNA sıralama, sırasıyla10,11,12,13,14 CII transgene genotip ve fenotip , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. bu Transjenik hayvanlar genom kromozom 4 Çoklu kopya kafa kuyruk concatemer1,2,25üzerinde entegre bir bakteriyofaj λ Servisi vektör (λLIZ) içerir. ΛLIZ Servisi vektör iki mutational muhabir gen taşır yani lacI ve CII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select CII tahlil λLIZ Servisi vektörel çizimler kurtarma organ/dokulardan Transjenik hayvanlar1,2,25 türetilmiş hücre genomik DNA dayanır . Kurtarılan λLIZ Servisi vektörel çizimler sonra bir göstergesi ana Escherichia colibulaşmasını yetenekli λ fajının zihinlerine paketlenmiştir. Daha sonra virüs bulaşan bakteriler puanlama ve CII transgene1,3mutasyon analizi için izin vermek için seçici koşullar altında yetiştirilmektedir.
Burada, biz hücreleri/Transjenik hayvanlar tedavi vitroorganlarının genomik DNA izolasyonu oluşur λ Select CII tahlil için detaylı bir protokol tarif /vivo λLIZ test bileşik, alımı ile olan yakındaki vektörel çizimler genomik DNA vektörler ambalaj içine bulaşıcı λ phages, bacteriophages, CIItanımlaması ile ana E. coli enfeksiyonu- CII mutant frekansını belirlemek için mutantlar seçici koşullar altında ve DNA dizi analizi CII mutasyon spektrum oluşturmak için. Protokol transgenik mouse/fare hücre kültürleri tedavi vitro ilgi bir kimyasal/fiziksel maddesi ile uygulanabilir veya doku/organ karşılık gelen hayvanların vivo içinde test kimyasal/ajan1ile tedavi, 2,4,48,49,50,51,52. λ Select CII tahlil şematik bir sunumunu şekil 1' de gösterilen.

<table><tbody><tr><td>Ağar</td><td>MO Biyo Laboratuvarları A.Ş.</td><td>12112-05</td><td>Bakteriyolojik sınıf</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Döngü Sıralama Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Kazein Pepton</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>JT Baker</td><td>2124-01</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>Yok</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>Yok</td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR saflaştırma reaksiyonları</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat Trihidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>Hiçbiri</td></tr><tr><td>Taq5000 DNA Polimeraz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Tiamin Hidroklorür</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>2722-57</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Transpack Ambalaj Özü</td><td>Stratagene Corp., BioReliance Tarafından Satın Alındı | Sigma-Aldrich A.Ş.</td><td>200223</td><td>50 paketleme reaksiyonu</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>Yok</td></tr></tbody></table>

lambda seçin cii mutasyon tespit sistemi

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri bir dizi memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik fareler ve Lambda (λ) Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için birçok araştırma grupları tarafından dünya çapında istihdam edilmiştir. Burada, biz transgenik fareler/fareler kültürlü hücrelere uygulanan Lambda seçin CII mutasyon tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak veya faiz kimyasal/fiziksel Aracısı ile ilgili hayvan tedavi. Protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) yalıtım hücrelerden genomik DNA'ın veya organ/Transjenik hayvanlar dokuların vitro veya vivo içindesırasıyla, bir test karışımla; tedavi (2) (Yani, CII transgene) mutational muhabir gen genomik DNA taşıyan lambda Servisi vektör kurtarılması; (3) bulaşıcı bacteriophages içine kurtarıldı vektörlerin ambalaj; (4) bir ana bilgisayar bakteri hastalık ve seçici koşullar altında indüklenen CII mutasyonlar yayılmasını sağlamak için kültür; ve (5) skorlama CII-mutantlar ve DNA dizi mutasyon spektrum ve CII mutant sıklığı sırasıyla belirlemek için analizi.

Veri dağıtımı bağlı olarak, parametrik ya da non-parametrik testler (spontan mutant Frekanslar karşı indüklenenYani) tedavi ve kontrol grupları arasında CII mutant frekans farkı önemini belirlemek için kullanılır . İndüklenen CII mutant frekansları farklı tedavi grupları arasında karşılaştırılması yapılmış çeşitli tarafından (ikili) uygulanabilir istatistiksel testler. χ2 test veya Varyans analizi (ANOVA), gibi diğer testler de sıklığını karşılaştırma...

Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.

Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Bu protokolün genel amacı, transgenik kemirgenlerin kültürlenmiş hücrelerinde veya ilgilenilen kimyasal ve fiziksel ajanlarla tedavi edilen ilgili hayvanlarda Lambda Select cII mutasyon testinde yer alan adım adım prosedürleri görselleştirmektir. Bu test yöntemi, mutasyon araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin: Bir test bileşiği mutajenik midir? Ve eğer öyleyse, ne kadar güçlü bir mutajen?Diziye özgü mutasyonları indükler mi? Bu tekniğin ana avantajı, hemen hemen her test bileşiği için minimal olmasıdır. Yöntem, kromozomal olarak entegre edilmiş bir raportör gen kullanılarak memeli hücrelerinde mutajenite testi için kullanılabilir.Tek bir paketleme reaksiyonu oluşturmak için, ilk reaksiyon karışımını içeren bir mikro santrifüj tüpüne beş mikrogram genomik DNA ekleyin. Daha sonra tüpü 30 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüpe 12 mikro litre ikinci reaksiyon karışımı ekleyin ve 30 santigrat derecede 90 dakika daha bırakın.90 dakika sonra, tüpe 1.1 mililitre SM tamponu ekleyin. Daha sonra, paketlenmiş DNA ile tüpü oda sıcaklığında yaklaşık 10 saniye kuvvetlice girdaplayın. Mikro santrifüjde hızlı bir şekilde nabız d

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Vahşi tip blokaj PCR ve ardından doğrudan dizileme, çeşitli numune türlerinde düşük frekanslı somatik mutasyonlar için oldukça hassas bir tespit yöntemi sunar.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Nicel katil hücre immünglobulin benzeri reseptör (kır) yarı otomatik (qKAT) yazarak sayı türü kır genler kendi uygulama için nüfus ve hastalığı Derneği çalışmalarda kopyalamak için basit, yüksek performans ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

qKAT: nicel Semi-automated yazmaktan katil hücreli immünglobulin benzeri reseptör gen

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım,...

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Bu makale, RNA virüsleri ve doku kültürü aslına Değişiklikleri onaylamak için mutasyon sıklığı verileri kullanmak RNA polimeraz sadakat varyantları izole ve karakterize etmek için gerekli adımları açıklamaktadır.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

Öğrenin, transgenik kemirgilerin kültür hücrelerinde Lambda Select cII mutasyon testi ile mutajenite değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, kimyasal ve fiziksel ajanların mutajen potansiyelini belirlemeye yardımcı olur.

Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi

Daha fazla video keşfet