İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

Bu yöntem, immünoloji alanında, bağışıklık hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda tam olarak nasıl davrandığı, hedef hücrelerin üç boyutlu bir ortamda verimli bir şekilde nasıl aranacağı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, düzlem dışı hücreleri etkilemeden sadece odak düzlemini aydınlatmak için çok ince bir ışık tabakası oluşturmaktır. Bu, ağartma ve fotositotoksisitenin belirgin bir şekilde azaltılması ile çok hızlı bir alım hızı sağlar.

Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Renping Zhao olacak. Başlamak için, bir hücre kültürü başlığı altında, 400 mikrolitre soğutulmuş kollajen stok çözeltisini steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Yavaşça 50 mikrolitre soğutulmuş 10X PBS ekleyin.

Ardından tüpü hafifçe eğerek çözeltiyi karıştırın. PH'ı 7,2 ila 7,6'ya ayarlamak için kollajen çözeltisine 48 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Karışımın pH değerini belirlemek için pH test şeritleri kullanın.

Son hacmi 500 mikrolitreye çıkarmak için iki mikrolitre steril damıtılmış deiyonize su ekleyin. İyice karıştırın ve kollajen çözeltisini daha fazla kullanana kadar buz üzerinde veya dört santigrat derecede saklayın. Canlı hücreleri metin protokolüne göre floresan olarak etiketledikten sonra, hücre kültürü başlığının altında, steril 1.5 mililitrelik bir tüpe altıncı hücrelere bir kez 10 kez aktarın.

Tüpü sekiz dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı atın ve peleti yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre kültür ortamı kullanın. Hücre süspansiyonuna 85.9 mikrolitre nötralize kollajen çözeltisi ekleyin ve mililitre başına 2.5 miligramlık bir kollajen konsantrasyonuna ulaşmak için uygun şekilde karıştırın.

Hücre kollajen karışımını başlıktaki buzun üzerinde bırakın. Ardından, piston kılcal damardan bir milimetre dışarı çıkana kadar eşleşen kılcal damara bir piston yerleştirin. Daha sonra kültür ortamına daldırarak pistonu ıslatın.

Bu adımın atlanması, piston ile kollajen matrisi arasında istenmeyen hava kabarcıklarının girmesine neden olabilir. Kılcal damarı hücre kollajen karışımına batırın ve pistonu yavaşça 10 ila 20 milimetre geri çekin. Daha sonra% 70 etanol içeren bir sprey şişesi ile bir kağıt havluyu nemlendirin ve kalan kollajen çözeltisini çıkarmak için kılcal damarın dış duvarını silmek için kullanın.

Şimdi kılcal damarı beş mililitrelik bir tüpün iç duvarına monte etmek için modelleme kili kullanın. Hücre kollajen karışımını kılcal damarın kenarına itin. Daha sonra kollajeni polimerize etmek için tüpü kılcal damar ile 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir saat inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, tüpe bir ila iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra polimerize kollajen çubuğunu, kollajenin yaklaşık yarısı ortamda asılı kalana kadar dikkatlice ortama boşaltın. Kılcal damarı 30 dakika daha inkübe edin.

Hafif levha mikroskobu yapmak için, numune odasını üreticinin talimatlarına göre monte edin. Canlı görüntüleme yapıyorsanız, mikroskobu ve inkübatörü açtıktan sonra, kılcal damarı numune odasına yerleştirin, numuneyi bulun ve görüntü elde etmek için ilgilenilen alanı bulun. İlgili lazerleri etkinleştirin.

Ardından lazer gücünü ve pozlama süresini ayarlayın. Ayrıca Z yığınının adım boyutunu, Z yığınının başlangıç ve bitiş konumlarını ve canlı hücre görüntüleme için zaman aralığını ayarlayın. Ardından görüntü alımını başlatın.

PBS'deki bir mililitre% 4 paraformaldehiti kimyasal bir başlık altında beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra kılcal damarı polimerize kollajen ile paraformaldehit çözeltisine batırın ve kılcal damarı tüpün iç duvarına monte etmek için modelleme kili kullanın. Kollajen çubuğunun yarısı paraformaldehit çözeltisinde asılı kalana kadar pistona hafifçe bastırın.

Ardından, kollajen çubuğunu kılcal damara geri almak için pistonu geri çekin. Kılcal damarı tüpten çıkarın ve paraformaldehiti atın. Kılcal damarı yeni bir tüpe monte edin ve bir mililitre PBS ekleyin.

Kılcal damarın PBS'ye daldırıldığından emin olun. Kollajen çubuğunun yarısı solüsyonda asılı kalana kadar pistonu hafifçe bastırın ve beş dakika inkübe edin. Kılcal damardaki kollajen çubuğunu almak için pistonu geri çekin.

Ardından PBS'yi taze PBS ile değiştirin ve kollajen çubuğunu çözeltiye boşaltın. Üçüncü yıkamadan sonra, tüpe bir ila iki mililitre bloke edici geçirgenlik tamponu ekleyin. Kollajen çubuğunu çözeltiye boşaltın ve tüpü oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin.

Bloke edici geçirgenlik tamponunu, bloke edici geçirgenlik tamponunda 200 ila 500 mikrolitre birincil antikorla değiştirin ve batık kollajen çubuğunu çözelti içinde bir saat inkübe edin. Kollajen çubuğunu üç kez yıkamak için PBST'yi kullandıktan sonra, çubuğu bir saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici geçirgenlik tamponunda ikincil antikorlarda inkübe edin. PBS'de üç yıkama daha yaptıktan sonra, kollajen çubuğunu kılcal damara geri çekin ve numuneyi görüntülemeye kadar PBS'de tutun.

Bu filmde görüldüğü gibi, göç sırasında bir EGFP aktin füzyon proteini ile transfekte edilen CTL hücreleri, ince iğ benzeri yapılarla saçaklanmış limon şeklinde ana çıkıntılar oluşturdu. CTL'lerin yörüngeleri burada hız ve kalıcılık veya ölçülen parametreler olarak toplam iz uzunluğuna bölünen yer değiştirme ile gösterilmektedir. Hızlar, neredeyse 20 kat farkla saniyede 0,01 ila 0,19 mikron arasında değişir ve kalıcılık sıfır ila 0,7 arasında değişir.

Bu şekil, endojen perforin-1 ve aktin için boyanmış 3D kollajen jel içindeki sabit CTL hücrelerini göstermektedir. Numune tek bir taraftan veya her iki taraftan aydınlatıldı. Farklı Z pozisyonlarından, hücreler eşit şekilde boyanır, bu da antikorların kollajen jellerine iyi bir şekilde nüfuz ettiğini gösterir.

Sabit CTL, canlı hücrelerle aynı morfolojiyi sergiledi, bu da morfolojinin bu protokolle iyi korunduğunu gösteriyor. Bu prosedürü denerken, hava kabarcıklarından kaçınmayı ve pH değerini doğru şekilde ayarlamayı unutmamak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre davranışının farklılaşma veya farklı hücre alt tipleri ile nasıl ilişkilendirileceği gibi ek soruları yanıtlamak veya hücre-hücre etkileşimini ve hücre kaderini araştırmak için belirli yüzey molekülleri ile canlı hücre boyama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, hücre biyolojisi, immünoloji ve kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların hücre davranışını, hücre kaderini, farklılaşmasını ve hücre etkileşimini fizyolojik olarak en ilgili sistemde in vitro olarak keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu bir kollajen matrisine gömülü hücrelerle numunelerin nasıl hazırlanacağını, canlı veya sabit ışık tabakası mikroskobu kullanılarak numunelerin nasıl görselleştirileceğini ve hücre göçünün 3D olarak nasıl izleneceğini iyi anlamış olmalısınız.