Name: İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin, ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu kollajen matris içinde insan bağışıklık hücrelerinin görselleştirilmesi ve hücre göçünün izlenmesi yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında fotoblokajı azaltarak hızlı görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz klinik Hemostaseology Enstitüsü ve kan nakli tıp donör kan sağlamak için teşekkür ederiz; Carmen Hässig ve Cora hoca mükemmel teknik yardım için. Biz için değiştirilmiş değerleri vektör Jens Rettig (Saarland Üniversitesi), Roland Wedlich-Söldner (Münster Üniversitesi) orijinal LifeAct-yakut inşa etmek için ve Christian Junker (Saarland Üniversitesi) LifeAct-mEGFP yapı oluşturmak için teşekkür ederiz. Bu proje Sonderforschungsbereich 1027 (proje A2 BQ) ve 894 (projeye A1 M.H.) tarafından finanse edildi. Işık sayfalık mikroskop DFG tarafından finanse edildi (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Bu çalışmada insan malzeme (lökosit azaltma sistem odaları insan kan bağış) ile yürütülen araştırma Yerel Etik Komitesi (bildirim 16.4.2015 (84/15; dan tarafından yetki Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) ve karşılık gelen kuralları izler.
1. hazırlanması etkisiz kollajen çözüm (500 µL)
<ol><li>Soğutulmuş kollajen hisse senedi çözüm (10.4 mg/mL) 400 µL hücre kültür başlık altında bir steril 1,5 mL tüp aktarın. Yavaş yavaş, 50 µL 10 x (pH 7,0-7,3) PBS'ye soğutulmuş kollajen hisse senedi çözüm 400 µL soğutulmuş ekleyin. Çözüm yavaşça tüp fayans tarafından karıştırın. Not: Bölüm 1 tüm adımları bir hücre kültür başlık altında yapılmalıdır.</li>
	<li>0.1 M NaOH 8 µL 1.1--dan kolajen çözüm 500 µL ekleyin. pH 7.2-7,6 için ayarlamak için. PH Ölçüm Çubuğu Strip kullanın (pH Aralığı: 6-10) karışımı pH değerini belirlemek için. Not: Birimleri kollajen farklı gruplar için farklı olabilir. Yavaş yavaş hava kabarcıklarını önlemek için karışık olması NaOH çözümü vardır. Karışım kollajen jelleşme önlemek için buz üstünde tutulmalıdır.</li>
	<li>2 eklemek son hacim 500 µL. için yapmak için steril GKD2O µL iyice karıştırın ve bu kollajen çözüm (8.32 mg/mL) buz üzerinde veya 4 ° C'de daha fazla kullanmak kadar saklamak. Not: Bu durum altında etkisiz kollajen kullanılabilir için 24 h hava kabarcıklarını önlemek için Aliquots tavsiye edilmez.</li>
</ol>2. numune hazırlama için kılcal kullanarak ışık sayfalık floresans mikroskobu
<ol><li>Fluorescently istenen birincil floresan boyalar15 veya floresan proteinler11 ilgi canlı hücreleri daha önce açıklandığı gibi etiketleyin.</li>
	<li>1 × 106 hücre hücre kültür başlık altında bir steril 1,5 mL tüp içine aktarın. 200 x g 8 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet kültür orta 200 µL içinde resuspend. Not: 5 × 106 hücre/mL hücre yoğunluğu görselleştirme sitotoksik T lenfositler (CTL) ve doğal öldürücü (NK) hücreler için özellikle insan bağışıklık hücre göç için önerilir.</li>
	<li>Etkisiz kollajen çözüm 85,9 µL 1,3 ekleyin. 2.2 üzerinden hücre süspansiyon. ve 2.5 mg/mL bir kollajen konsantrasyon ulaşmak için düzgün karıştırın. Hücre/kollajen karışımı buz başlıklı açık bırak. Not: kollajen istenen konsantrasyonu N mg/mL olduğunu varsayalım, ses düzeyini nötralize kollajen çözüm (için 200 µL hücre süspansiyon) = 200 × N /(8.32-N)</li>
	<li>Daha sonra eşleşen pistonu kılcal damar koymak (iç çap ~ 1 mm) pistonu kılcal dışında 1 mm kadar. Pistonu kültür orta (Şekil 1A) daldırma tarafından ıslak. Not: Bu adım kapiller hücre/kollajen karışımı içine daldırma hava kabarcıklarını önlemek için yardımcı. Kılcal damar ve pistonu steril olması gerekmez.</li>
	<li>Kılcal 2.3 hücre/kollajen karışımından içine daldırma. Yavaşça çek pistonu geri için 10-20 mm (Şekil 1B). Kılcal dış duvarına kalan kollajen çözümü kaldırmak için % 70 etanol sprey ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu ile silin.</li>
	<li>Kil 5 mL tüp iç duvarında modelleme ile kılcal dağ ve hücre/kollajen mix kılcal (Şekil 1 c) kenarına doğru itin.</li>
	<li>Kılcal 37 ° C % 5 CO2 kollajen polimerizasyon için 1 h için tutun.</li>
	<li>Kültür orta (yaklaşık 1-2 mL) 5 mL tüp ekleyin. Dikkatlice dışarı polimerli kollajen çubuk yaklaşık 3/4 Orta (Şekil 1 d) asılı kollajen ortamına basın.</li>
	<li>Kılcal böyle, % 5 CO2 orta kollajen demiriyle equilibrate başka bir 30 dk 37 ° C'de tutun. Not: Daha sonra kollajen çubuk geri kapiller ve kültürlü daha fazla kullanılmadan önce daha da çekilebilir.</li>
</ol>3. resim alma ışık sayfalık mikroskobu kullanarak
<ol><li>Derleme üreticinin yönerge göre örnek odası.</li>
	<li>Kuluçka ve 37 ° C (canlı hücre yalnızca görüntüleme için) örnek odasına ısıtmak için mikroskop açın.</li>
	<li>Kılcal örnek odasında yerleştirin ve ilgi alanı resim alma için bulmak için örnek bulun.</li>
	<li>Karşılık gelen lazer aktif hale getirin. Aşağıdaki ayarları ayarla: lazer güç, pozlama süresi, adım-z-yığın, başlangıç ve bitiş konumları z-yığın ve canlı hücre görüntüleme için zaman aralığı boyutunu. Not: Örneğin, Şekil 2 ' deki örnek yansıma her 40 adım büyüklüğü 1 µm ile 37 ° c 6 h s (toplam kalınlığı: 538 µm). Lazer güç 30 Bayan x-y yönünde piksel boyutunda bir çekim hızı ile %1 0,23 µm olduğunu.</li>
	<li>Resim alma başlatın.</li>
</ol>4. otomatik izleme çözümlemesi
<ol><li>Dosya dönüştürücüsünü açıkken, (*.ims) yazılım dosya biçimine dönüştürmek için görüntü dosyaları seçmek için Dosya Ekle'yi tıklatın. Gözat ' ı tıklatın ve dönüştürülmüş dosyaları kaydetmek için bir klasör seçin. Tüm Başlat' ı tıklatın.</li>
	<li>Analiz yazılımı açın. Aşmak' ı tıklatın. Dosya gidin ve Aç' ı tıklatın, ardından çözümlenmesi için görüntü dosyasını seçin. Not: dosya boyutu büyük ise bu adım zaman alabilir. 1 terabayt (TB) büyük dosyaları tavsiye edilmez tek bir deneme için işlem olarak böyle büyük dosyalardır son derece Hesaplamalı kapasite talep.</li>
	<li>Yeni noktalar Ekleseçeneğini tıklatın. İşlemi tüm görüntü sonundakutuyu işaretleyin. İleri' yi tıklatın.</li>
	<li>X için koordinatları girin ve y (için piksel) bölgenin ilgi tanımlamak için. (Zaman ve z-pozisyon) çözümlemek için kare sayısını girin. İleri' yi tıklatın.</li>
	<li>İzlenmesi gereken nesneleri içerir, hedef kanal Kaynak kanalıaşağı açılan listesinde seçin. Tahmini xy çapı (µm) girin. İleri' yi tıklatın. Not: Tahmini xy çapı ortalama çap x-y boyut izlenmesi gereken nesneler olduğunu.</li>
	<li>Kalitesi' ni tıklatın. (Nesneler) hücrelerin çoğu dahil edilecek bir eşik ayarlamak. İleri' yi tıklatın.</li>
	<li>İstenen algoritma (Autoregressive hareketli önerilir) seçin. Maksimum uzaklığı girin (20 µm önerilir) ve maksimum boşluk boyutu (3 veya 2 önerilir). İşlemi tüm görüntü son olarak'ıtıklatın. Not: Max mesafe ve en büyük boşluk boyutu parça kırmak için iki eşikleri vardır. Aynı nesne arasındaki uzaklığı Max mesafe aştığında daha ayrıntılı olarak, iki sürekli çerçevelerde bu nesne daha sonra çerçeve içinde yeni bir nesne olarak kabul edilecektir. Bazen satın alma sırasında aynı nesne için birkaç kare kaybolur ve tekrar ortaya. Bu durumda, yalnızca bu nesne içinde en büyük boşluk boyutu yeniden görüntülenir zaman, aynı nesne olarak değerlendirilir.</li>
	<li>Filtre türü tıklatın ve istenmeyen parçaları dışlamak için seçeneği seçin. Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır.</li>
	<li>İleri ' yi tıklatın ve sonra son' u tıklatın. Not: Bu adımı saat bilgisayar performansına bağlı olarak gün kadar sürebilir.</li>
	<li>Parça Düzenle'yi tıklatın ve Doğru Driftseçin. (Translasyonel Drift önerilir) uygun algoritma seçin. İstediğiniz Sonuç veri kümesi boyutu seçin (Yeni boyutu geçerli boyutuna eşit tavsiye edilir). Tamam' ı tıklatın. Not: Bu sadece bir adımdır gerekli resim alma sırasında kolajen sürüklendi.</li>
	<li>İstatistikler ' i tıklatın ve Yapılandırdığınız liste, görünür istatistik değerleriseçin. Kontrol seçenekleri ilgi olmak (koordinatları, hız ve benzeri gibi) ihraç. Tamam' ı tıklatın.</li>
	<li>Tüm istatistiklerini dosyasına dışa aktar'ı tıklatın ve dosya adı girin.</li>
</ol>5. fiksasyon ve ayirt kollajen matrisler hücrelerinin boyama
<ol><li>%4 paraformaldehyde (PFA, PBS) 1.000 µL kimyasal bir başlık altında 5 mL tüp içine aktarın. Not: PFA oda sıcaklığına dengeli olmalıdır.</li>
	<li>Kılcal 2,9 dan polimerli kollajen ile daldırma. İngiltere'de yılın çözüm içine (için ~ 5 mm) ve kılcal ( Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi) kil modelleme ile 5 mL tüp iç duvara monte edin.</li>
	<li>Kollajen çubuk yarısı asılı 's kadar İngiltere'de yılın çözüm (Şekil 1 d) pistonu hafifçe bastırın. Tüp, oda sıcaklığında 20 dakika tutun.</li>
	<li>Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. Kılcal almak ve İngiltere'de yılın atın.</li>
	<li>Kılcal damar taze bir tüp dağ ve PBS 1 mL ekleyin. Kılcal PBS içinde dalmış emin olun.</li>
	<li>Kollajen çubuk yarısı asılı 's kadar çözümde pistonu hafifçe bastırın. Kılcal kil modelleme ile iç duvar bağlama.</li>
	<li>Tüp 5 min için oda sıcaklığında tutmak.</li>
	<li>5.4 yineleyin. -5.7 için başka bir 2 kere.</li>
	<li>Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. PBS atmak. Engelleme/permeabilization arabellek (PBS + % 1 BSA + %0,1 non-iyonik yüzey aktif) 1-2 mL tüp içine aktarmak ve 5.6 tekrarlayın. Not: BSA (% 1) %5 serum ikincil Ab içinde büyüdü hayvan tarafından değiştirilebilir.</li>
	<li>Tüp 30-60 dakika oda sıcaklığında tutmak.</li>
	<li>Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. Permeabilization arabellek atmak. 200-500 µL engelleme/permeabilization tampon birincil antikor, transfer ve çözüm içine çubuk ihraç etti.</li>
	<li>Tüp 1 h için oda sıcaklığında tutmak.</li>
	<li>Kollajen çubuk 3 kez ile PBST (PBS + % 0,1 - iyonik olmayan yüzey aktif) 5.4 içinde açıklandığı gibi yıkayın. -5,8.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için engelleme/permeabilization arabellekte ikincil antikor çubuk kuluçkaya. Işıktan tutun.</li>
	<li>Kollajen çubuk 3 kez PBS ile 5.4 içinde açıklandığı gibi yıkayın. -5,8.</li>
	<li>Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. Örnekleri PBS içinde görüntüleme kadar tutun.</li>
	<li>Örnekleri 3'te açıklandığı gibi inceden inceye gözden geçirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro%3F+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li>
<li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li>
<li>Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+migration%2C+search+strategies+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell migration, search strategies and mechanisms.</a> Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).</li>
<li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+methods+of+human+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis methods of human cell migration.</a> Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).</li>
<li>Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+cell+survival+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a cell survival factor.</a> Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).</li>
<li>Schoppmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+profilin+1+is+a+negative+regulator+of+CTL+mediated+cell-killing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration.</a> Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).</li>
<li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+driven+by+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+cells+enhance+NK+cytotoxic+efficiency+by+reducing+search+time%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time.</a> Sci Rep. 7, 44357(2017).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+leading+edge+of+three-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">At the leading edge of three-dimensional cell migration.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer).</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), e59689(2013).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Verveer, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+large+specimens+with+light+sheet-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy.</a> Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir mali veya ticari çıkar çatışması beyan ederim.

Vivo hücreleri, özellikle bağışıklık hücreleri, çoğunlukla bir 3D microenvironment deneyim, ancak çoğu vitro deneyleri bir 2D yüzeyi, hücre kültürü kaplamalar, Petri yemekler veya coverslips, örneğin devam etmektedir. Kanıt ortaya çıkan geçiş desen bağışıklık hücrelerinin 2D ve 3D senaryoları17arasında farklılık gösterir. Ayrıca, tümör hücrelerinin ifade profilleri de 2D ve 3D kültürlü doku18,19,<sup class="xre...

Geçiş hakkında birçok bilgi hücreleri gelir üzerinden 2D deneyleri1,2,3, hangi normal bir cam veya plastik yüzey bir kültür/görüntüleme yapılmaktadır çanak. Ancak, fizyolojik bir senaryo, çoğu durumda, hücre dışı matriks (ECM) belirleyici bir rol oynayan bir 3D microenvironment gerektirir. ECM sadece uygun hücre morfolojisi korumak için 3D yapısı temel sağlar ama aynı zamanda yaşam sinyalleri veya bir en uygun birçok hücre4,5 / işlemesi için yön ipuçları sunmaktadır. Bu nedenle, bir 3D çevre hücresel işlevler ve davranış fizyolojik içeriği daha iyi yansıtan bir ortamda daha iyi tanımlamak için gereklidir.
İnsan vücudunda en hücreleri özellikle bağışıklık hücreleri, onların işlevler'in altında bir 3D senaryo uygulamayın. Örneğin, aktive T hücreleri hedef hücreler için arama doku devriye, saf T hücreler lenf düğümleri sırasında geçiş modu ve makine ekstraselüler karşılık gelen için adapte olmuşlardır soydaş antijen sunan hücreler için arama üzerinden göç çevre3,6,7. 3D kollajen jel yaygın bir iyi kurulmuş ve iyi karakterize 3D hücre kültür sistemi8,9,10kullanılmıştır. Önceki çalışmalarımız birincil insan lenfosit son derece mobil ve yaklaşık 4.8 µm/dk % 0.25 kollajen tabanlı matris11' deki ortalama bir hızda geçiş gösterir. Sitoiskeleti düzenlenmesi Hücre geçiş12içinde önemli bir rol oynar. Kanıt biriken lenfosit göç sadece tek bir mod geçerli değildir henüz yer, microenvironment, sitokinler, kemotaktik degradeler bağlı olarak bazı geçiş davranışı arasında geçiş yapabilirsiniz ve ekstraselüler hangi melodi sinyalleri gösterir göçmen davranış farklı yolu 3.
Bağışıklık hücre fonksiyonları ve davranış, örneğin, göç, çıkıntı oluşumu veya veziküler ulaşım, güvenilir bir şekilde çözümlemek için görüntüleri nispeten büyük 3B cilt olarak hızlı ve güvenilir bir şekilde elde edebilmek için büyük avantaj taşımaktadır. 3D görüntüleme için tatmin edici bir çözüm13,14(tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji sunmaktadır. Edinme görüntüleme sırasında ince bir statik hafif levha örnek aydınlatmak için oluşturulur. Bu şekilde, odak düzlem üzerinde geniş bir alanda aynı anda uçak-hücreleri etkilemeden aydınlatılmış. Bu özellik, bir büyük ölçüde azaltılmış ağartma ve photocytotoxicity ile bir yüksek satın alma hızı sağlar. Bu yazıda, birincil insan bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak görselleştirmek ve 3D senaryosunda geçiş analiz anlatan.

<table><tbody><tr><td>Fibricol, sığır kollajen çözeltisi</td><td>Gelişmiş Biomatrix</td><td>&nbsp;#5133-20ML</td><td>Kollajen matrisi</td></tr><tr><td>0.5 M NaOH Çözeltisi</td><td>Fibricol çözeltisini nötralize etmek için</td><td>Merck</td><td>1091381000</td></tr><tr><td>Ultra-Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Affymetrix</td><td>32821-10GM</td><td>Düşük c [Col] Dynabeads'de numune hazırlama</td></tr> <tr><td>El değmemiş İnsan CD8 T Hücreleri Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>11348D</td><td>PBMC Dynabeads İnsan T-Aktivatöründen Birincil İnsan CD8 + T hücrelerinin izolasyonu</td></tr><tr><td>T Hücresi Genişlemesi ve Aktivasyonu için İnsan T-Aktivatörü CD3 / CD28</td><td>Thermo Fisher</td><td>11132D</td><td>CTL popülasyonlarının aktivasyonu</td></tr><tr><td>İnsan rekombinant interlökin-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC0023</td><td>Kültürlenmiş CTL</td></tr><tr><td>P3 Birincil çözüm kitinin</td> uyarılması <td>Lonza</td><td>V4XP-30XX</td><td>Transfeksiyon</td></tr><tr><td>&alpha;-PFN1 antikoru, tavşan, IgG</td><td>Abcam</td><td>ab124904</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22284</td><td>IF</td></tr><tr><td>CellMask Turuncu Plazma zarı Leke</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10045</td><td>Floresan hücre etiketi</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-250mL</td><td>IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Eurobio</td><td>018774</td><td>IF</td></tr><tr><td>DPBS Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>IF Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A9418-100G</td>, <td>IF</td></tr><tr><td>Keçi ve alfa; Tavşan 568, IgG, tavşan</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11011</td><td>IF</td></tr><tr><td>Işık Tabakası Z.1 (Işık tabakası mikroskobu)</td><td>Zeiss</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü başlığı</td><td>Thermo Fisher</td><td>HeraSafe KS</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü HERACell 150i&nbsp;</td><td>Termo Balıkçı</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5418 ve 5452</td><td>Eppendorf</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pippette ipuçları</td><td>VWR</td><td>89079-444, 89079-436, 89079-452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal damarlar 50 & L</td><td>VWR (Marka)</td><td>613-3373</td><td>Zeiss LSFM numune hazırlama</td></tr><tr><td>Kılcal damarlar için piston</td><td>VWR (Marka)</td><td>BRND701934</td><td>"Teflon uçlu pullar" LSFM numune hazırlama</td></tr><tr><td>MColorPhast pH uçları</td><td>Merck</td><td>,</td><td>nötralize Fibricol</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 mL şırıngaların</td> pH'ını test etmek için <td>1095430001 Z230723</td><td>&nbsp; ALDRICH</td><td>, Alternatif numune hazırlama</td></tr><tr><td>, Kil modelleme (Hasbro, Play-Doh A5417EU7)</td><td>Play-Doh</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Imaris dosya dönüştürücü</td><td>Bitplane</td><td>http://www.bitplane.com&nbsp; adresinde bulunabilir.</td><td>Görüntüleme dosyalarını Imaris dosya formatına dönüştürün</td></tr><tr><td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td><td>Bitplane</td><td>http://www.bitplane.com&nbsp; adresinde bulunabilir.</td><td>3D ve 4D görüntüleme verilerinin analizi</td></tr></tbody></table>

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Vivo, harekete geçirmek, yayılması ve bağışıklık hücreleri tüm fonksiyonu bir ortamında üç boyutlu (3D), örneğin lenf düğümleri veya doku oluşur. Tarihe kadar iki boyutlu (2D) yüzeyler, hücre kültürü plakaları veya coverslips gibi çoğu vitro sistemde güveniyor. En iyi şekilde kopyalama fizyolojik şartlarda vitroiçin biz basit 3D kollajen matris kullanmaktadır. Kollajen hücre dışı matriks (ECM) ana bileşenlerini ve yaygın olarak 3B matrisleri oluşturmak için kullanılan. 3D görüntüleme için (tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji yüksek satın alma hızı, büyük penetrasyon derinliği, düşük beyazlatma ve photocytotoxicity bulunmamaktadır. Ayrıca, ışık sayfalık mikroskobu özellikle uzun vadeli ölçüm için avantajlıdır. Burada nasıl ayarlamak ve insan bağışıklık hücreleri, Örneğin birincil insan sitotoksik T lenfositler (CTL) işlemek en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar ve doğal öldürücü (NK) hücreleri canlı hücre görüntüleme için ışık sayfalık mikroskobu ile kullanım için 3D kollajen matris ve sabit örnekleri. Resim alma ve çözümleme hücre göç prosedürü sunulmaktadır. Belirli bir odak kritik adımlar ve numune hazırlama ve veri analizi için etkenler vurgulamak için verilir. Bu iletişim kuralı bir 3D kollajen Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam ve bağışıklık hücreleri için sınırlı değildir.

Çıkıntı oluşumu T hücre göç sırasında aktin bağımlı olan son derece dinamik bir süreçtir. Birincil insan CTL oluşumu çıkıntı görselleştirmek için geçici11' den önce açıklandığı gibi CTL aktin sitoiskeleti etiketlemek için erimiş mEGFP protein transfected. Bir gün transfection sonra hücreleri kollajen matris içinde gömülü. Görüntü yığınları alınan her 40 s ışık sayfalık mikroskobu kullanılarak 37 ° C'de 1 µm boyutunda adım. Şekil 2A ve ...

Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Bu yöntem, immünoloji alanında, bağışıklık hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda tam olarak nasıl davrandığı, hedef hücrelerin üç boyutlu bir ortamda verimli bir şekilde nasıl aranacağı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, düzlem dışı hücreleri etkilemeden sadece odak düzlemini aydınlatmak için çok ince bir ışık tabakası oluşturmaktır. Bu, ağartma ve fotositotoksisitenin belirgin bir şekilde azaltılması ile çok hızlı bir alım hızı sağlar.Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Renping Zhao olacak. Başlamak için, bir hücre kültürü başlığı altında, 400 mikrolitre soğutulmuş kollajen stok çözeltisini steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Yavaşça 50 mikrolitre soğutulmuş 10X PBS ekleyin.Ardından tüpü hafifçe eğerek çözeltiyi karıştırın. PH'ı 7,2 ila 7,6'ya ayarlamak için kollajen çözeltisine 48 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Karışımın pH değerini belirlemek için pH test şeritleri kullanın.Son hacmi 500 mikrolitreye çıkarmak için iki mikrolitre steril damıtılmış deiyonize su ekleyin. İyice karıştırın ve kollajen çözeltisini daha fazla kullanana kadar buz üzerinde veya dört santigra

light-sheet-microscopy-for-three-dimensional-visualization-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, canlı T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için kafes ışık tabakası mikroskobu tekniğini açıklıyoruz. Yöntem, hücre-hücre etkileşiminin uzay-zamansal dinamiklerini ortaya çıkaran yüksek çözünürlüklü dört boyutlu görüntüler elde etmek için birleştirilen bir dizi iki boyutlu görüntü elde etmek için ultra ince bir kafes ışık tabakasının etkileşimli bir hücre çifti üzerine odaklanmasını içerir.

Canlı hücrelerde reseptör-ligand etkileşimlerini görselleştirmek için kafes ışık tabakası mikroskobu

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Tek düzlem aydınlatma mikroskopi için bir modül (SPIM) kolay bir şekilde ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edildiği açıklanmaktadır. Numune bir dikdörtgen kılcal içinde yer almaktadır ve mikro-akışkan sistem floresan boyalar ile, farmasötik maddeler ya da ilaç küçük miktarlarda uygulanabilir.

Tek Düzlem Aydınlatma Modülü ve geniş alan Mikroskop Mikro-kılcal Yaklaşım

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Keşfedin, ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu kollajen matris içinde insan bağışıklık hücrelerinin görselleştirilmesi ve hücre göçünün izlenmesi yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında fotoblokajı azaltarak hızlı görüntüleme sağlar.

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

Daha fazla video keşfet