Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.

Drosophila türlerinde gelişmekte olan pupil ve yetişkin periferik koku dokularının evrelemesi ve diseksiyonunun genel amacı, periferik koku dokularının moleküler ve gelişimsel analizleri için örnekler oluşturmaktır. Bu yöntem, gelişmekte olan periferik koku dokularındaki belirli genlerin ifade dinamikleri, seviyeleri ve kalıpları gibi koku alma sistemi gelişimi ve evrimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem sayesinde, Drosophila türünde gelişen periferik koku alma sistemi hakkında bilgi edinebiliriz.

Periferik tat ve görsel sistemler gibi diğer duyusal sistemlere de uygulanabilir. Bir RNA dizileme deneyi için, dört farklı gelişim aşaması için 100 ila 200 anten diski veya anten toplamayı planlayın. İmmünohistokimya için 10 ila 20 sineği incelemeyi planlayın.

Diseksiyonda yer alan tüm malzemeleri %70 etanol kullanarak temizleyin. Ardından, malzemeleri RNase nötrleştiricilerle daha fazla temizleyin. Ve tüm çözümleri nükleaz içermeyen veya DEPC ile arıtılmış su kullanarak yapın.

Pupa toplamak için larvaları 30 dakikalık aralıklarla izleyin. Ve sıfırıncı saat APF hazırlık aşamasında pupa toplayın. Larvalar hareketsiz olacak ve çok hafif, neredeyse beyaz renkli bir pupa kılıfı ile çevrili olacaktır.

Bu aşamada, larvaları nemli bir filtre kağıdı ile iki inçlik küçük bir petri kabına aktarın. Sıfır saatlik APF evre diseksiyonları için, hemen prepupal anten diskini çıkarmaya devam edin. Aksi takdirde, çanağı parafin filmle örtün ve hayvanların ilgilendikleri gelişim aşamasına gelene kadar 25 santigrat derecede gelişmelerine izin verin.

Diğer Drosophila türlerinin pupa gelişimini evrelemek için sıfır saatlik prepupal larvaları toplayın ve bunları taze bir şişeye ayırın. Ardından prepupadan yetişkinliğe kadar olan gün sayısını kaydedin. Ve bu süreyi melanogaster için zaman çizelgesine göre ölçeklendirin.

Başlamak için, 150 mikrolitre RNA izolasyon solüsyonunu RNaz içermeyen 1,5 milimetrelik bir tüpte soğutun. Daha sonra, diseksiyon pedine birkaç ayrı PBS damlası bırakın. PBS'nin her damlasına, disseke edilecek bir pupa yerleştirin.

Sıfır ila iki saatlik pupa için, ağız kancalarını kavramak için forseps kullanın ve beyinleri ve hayali diskleri yırtmak ve ortaya çıkarmak için bu yapıları çekin. Sekiz saatlik pupa için, gelişmekte olan kafayı ortaya çıkarmak için önce pupa kılıfını pupanın en ön çeyreğinden nazikçe soyun. Sonra kafayı boyun ekleminden ayırın.

Anten diskleri, gelişimin bu aşamasında kafanın içindedir. Şimdi anten disklerini içeren dokuları başka bir PBS damlasına aktarın. Ardından, optik loblarda beyne bağlı göz anten diskini tanımlayın.

Forseps kullanarak, göz anten diskini ayırın ve yeni bir damlacığa aktarın. Sekiz saatlik pupalarda, göz diskleri anten disklerini kaplar ve her ikisi de beynin önündedir. Bir sonraki damlacıkta, forseps kullanarak gözü ve anten disklerini bölün.

Daha sonra bir P20 pipet ucu kullanarak, diseke edilen dokuyu minimum miktarda sıvı ile nazikçe toplayın. Diski RNA izolasyon çözeltisi reaktifine bırakın ve en az 100 toplanana kadar anten disklerini incelemeye devam edin. Pupa oluşumundan 40 saat sonra, yetişkin anten son şeklini almıştır, ancak hala şeffaftır.

RNA dizisinin toplanması için bu aşamada en az 50 prepupaya ihtiyaç vardır. İlk önce 150 mikrolitre soğutulmuş RNA izolasyon çözeltisi hazırlayın. Diseksiyon pedinde, bir pupa damlası PBS içine yerleştirin.

Daha sonra vücudu bir çift forseps ile stabilize edin ve başınızı ortaya çıkarmak için pupa kılıfını en ön çeyrekten nazikçe soyun. Ardından, boyun eklemindeki başı dikkatlice çıkarın. Şimdi kafayı yavaşça temiz bir PBS damlasına aktarın.

Kafayı çevreleyen zarı çıkarmak için, kafayı PBS'de yukarı ve aşağı pipetleyin. Bu temizlik ile anten görünür hale gelmelidir. Şimdi anteni, segmental eklemdeki ikinci ve üçüncü segmentler arasındaki zardan ayırın.

Üçüncü segment, anten koku alma reseptörlerini içerir. Ardından, diseke edilen dokuyu nazikçe RNA izolasyon solüsyonuna aktarmak için bir pipet kullanın ve aktarılan sıvı miktarını en aza indirin. RNA ekstraksiyonu için, yetişkinleri bir CO2 pedi üzerinde anestezi altındayken inceleyin.

İlk olarak, CO2 pedini ve forsepsleri RNase inhibitörleri ile tedavi edin. Daha sonra yetişkinleri uyuşturun ve pedi diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. İki çift forseps kullanarak, vücudu stabilize edin ve dokuları toplamak için üçüncü anten segmentini ikinci anten segmentinden yavaşça çekin veya sıkıştırın.

Forsepsleri sıvıya batırarak ve serbest bırakarak anteni bir RNA izolasyon çözeltisi tüpüne aktarın. Anten suya batırılmalıdır. Anten yan duvara yapışırsa, RNA erken bozulur.

Yeterli anten topladıktan sonra, RNA ekstraksiyonuna devam edin. Veya toplama tüpünü süresiz olarak 80 santigrat derecede saklayın. Anten immünohistokimya için tasarlanmışsa, bu diseksiyonu, sinek Triton ile veya Triton olmadan PBS'ye batırılmış bir diseksiyon pedi üzerinde gerçekleştirin.

Diseke gelişen koku alma dokusu, RNA ekstraksiyonu için kullanılabilir ve ardından gen ekspresyonunu değerlendirmek için RT-PCR ile kullanılabilir. Örneğin, yüzey reseptör transkriptlerinin ve koku alma reseptör transkriptlerinin ekspresyonu bu şekilde incelenebilir. Alternatif olarak, dokular, ilgilenilen genlerin ekspresyon paternini ve hücre altı lokalizasyonunu belirlemek için immünohistokimya için kullanılabilir.

Örneğin, Rn-EGFP transgenik sinekler, anti-GFP ve anti-Laminin antikorları ile boyanabilir. Analiz, pupa oluşumundan 40 saat sonra, Or67d geninin antendeki spesifik hücrelerde aktif olduğunu ve GAL4-UAS sistemi altında GFP'nin ekspresyonunu yönlendirdiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa diseksiyonlar bir saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, her bir Drosophila türü için pupa gelişim zaman çerçevesine bağlı olarak zaman ayırmayı ve uygun şekilde planlanmış toplama, yaşlandırma ve diseksiyonu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, qRT-PCR, immünohistokimya gibi diğer yöntemlerin yanı sıra diğer in vivo boyama ve transkripsiyonel profilleme teknikleri, gelişmekte olan bir dokuda sistem düzeyinde transkripsiyon paterni ve profilleri ile ilgili ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, duyusal sistemlerin evrimi ve geliştirilmesi alanındaki araştırmacıların, Drosophila türlerindeki diğer duyusal sistemlerde transkripsiyonel dinamikleri ve yeni gen keşfini keşfetmelerinin önünü açacaktır.

Keskin forseps, bazı RNA ekstraksiyon solüsyonları ve formaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken daha önce diseksiyon uygulaması, ince motor becerilerin geliştirilmesi, yüksek dikkat ve uygun laboratuvar kıyafetleri giyilmesi gibi önlemler her zaman alınmalıdır.