Name: Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Keşfedin Drosophila türlerinde gelişen periferik koku dokusunun evreleme ve diseksiyon protokolünü. Bu yöntem moleküler analizler, gen ekspresyonu ve duyu sistemi gelişimi araştırmaları için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada, Ulusal Bilim Vakfı Hibe için Pelin C. Volkan (DEB-1457690) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki iletişim kuralı Duke Üniversitesi Araştırma Etik Komitesi tarafından kurulan etik kuralları ile tutarlıdır.
1. doku hazırlık ve Drosophila melanogaster Pupa gelişimsel evreleme
<ol><li>İlk olarak, ne kadar çok sinek diseksiyon için gerekli olacaktır tanımlamak. RT-PCR ve RNAseq için 100-200 antennal diskler ve anten prepupal, 8 h APF, 40 h APF ve yetişkin aşamalarında gerekli olan bireyler toplamak. İmmünhistokimya için 10-20 kişi incelemek.</li>
	<li>Diseksiyon yastıkları ve forseps, % 70 ile mendil kullanarak da dahil olmak üzere tüm malzemeler temiz alkol. Eğer disseke malzeme RNA çekimi için kullanılan, RNase NÖTRALLEŞTİRİCİLER ile her şeyi temizlemek ve tüm çözümler nükleaz ücretsiz kullanarak yapmak için veya dietil pyrocarbonate (DEPC) su tedavi. Not: Bu protokol gruptakiler için cam yerine silikon diseksiyon yastıkları kullanır. Silikon yastıkları için ultra-ince forseps dostu olan ve hızlı ve yüksek kaliteli diseksiyonlarının teşvik.</li>
	<li>Pupa 0 h APF/prepupal sahne toplamak.<ol>
<li>En doğru evreleme, monitör larva 30 dk 1 h aralıklar sağlamak için. Not: Göçebe üçüncü INSTAR larva orta derecede kalabalık bir şişe büyük olasılıkla birkaç saat içinde YavruIar.</li>
		<li>Bir kez larvaları hareketsiz hale ve bir çok hafif (neredeyse beyaz) renkli pupa dava ile çevrili, onları içine bir küçük 2 - inç nemli bir filtre kağıdı ile Petri kabına aktarın.</li>
		<li>1-2 h için zaman zaman izleme, belirlenmesi ve prepupae transfer etme, devam edin. Not: Alternatif olarak, tüm pupa bir şişe temizleyin ve larvalar için 2 h geliştirmek izin. 2 h 0 - 2 h APF Aralık içinde olacak sonra tüm pupa toplanan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen 3.1 prepupal antennal disk 0 h APF sahne için incelemek için adımına. Prepupa yaşlı gerekiyorsa, onları bir tabak içine toplamak, çanak kapağı ve parafin film kuruluk etkisizleştirmek için kenarlarda yerleştirin ve 25 ° C'de Petri kabına yerleştirin Not: Pupa şimdi eclosion için yaşlı.</li>
	<li>Pupa değil emin olmak için prepupae 2 h istenen çağına için 2 h aralığında toplanan pupa için yaş fazlalığı.</li>
	<li>Çok küçük ve kırılgan doku olan Ultra-ince forseps (Dumont 55) kullanın.</li>
</ol>2. doku hazırlık ve Pupa diğer Drosophila tür gelişimsel evreleme
<ol><li>Diğer Drosophila türler pupa geliştirilmesinde uzunluğunu belirlemek için optimum sıcaklık örnekleri yer, kayıt tarihleri ne zaman prepupae gözlenir, taze bir şişe sıralamak ve prepupa gün yetişkinliğe kaydedin.</li>
	<li>Non -melanogaster türler ve melanogasterzaman pupa kalkınma oranı kaydedin. Melanogaster evreleme için non -melanogaster türler yaş için saat sayısı elde etmek için kullanılan saat sayısı gelişimsel zaman oranı ile çarpın.</li>
</ol>3. D. melanogaster pupa Antennal disk diseksiyon
Not: İçin açıklanan tüm yaşlanma kez ve diseksiyon protokolleri Drosophila melanogaster. Tüm diğer türler için yukarıda açıklandığı gibi bir değişiklik species-specific gelişimsel zaman puan dayalı yaşlanma Protokolü'nün gerekli, olacaktır.
<ol><li>Pupa antennal disk gruptakiler, 50-100 0 - 2 h veya 6-8 h eski pupa bir spatula kullanarak toplar ve bunları bir diseksiyon rampasında yer.</li>
	<li>RNA izolasyon çözüm 150 µL pipet bir RNase ücretsiz 1.5 mL microfuge 200-µL pipet kullanarak tüp ve tüp buza koyun içine.</li>
	<li>1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, nükleaz içermeyen) 150-200 µL içinde pupa incelemek. PBS (damlacık başına 150-200 µL) birden fazla damlacıkları diseksiyon altlığında yerleştirin.</li>
	<li>Diseksiyon altlığında birinde 1 x PBS damlacıkları disseke için 0 - 2 h veya 6-8 yaş arası h Pupa (damla başına bir pupa) yerleştirin. Forseps bir elinde vücut stabilize etmek için kullanın.</li>
	<li>0 - 2 h pupa prepupa en ön bölümü (ağız kancalar) üzerinde öte yandan, tutun forseps kullanarak, Yaşlı ve hem zeki hem ön pupa gövdesine yapıştırılmış Imaginal diskler ortaya çıkarmak için çıkar.</li>
	<li>8 h APF pupa için ilk yavaşça kafa vücut çevreleyen zar çuval içinde teşhir pupa, pupa olgusu en ön çeyreğinden akasındaki. Not: Vücut, bu aşamada bir degenerating larva gibi görünüyor.</li>
	<li>Boyun eklemi başında kaldırın. Not: Bu antennal diskleri kayıp, olmayacaktır sağlar ki bu aşamada için öncelikle optik loblar beyni bağlı olan.</li>
	<li>Başka bir 1 x Forseps veya 20 µL pipet kullanarak PBS damlacık doku beyin ve Imaginal diskler ile aktarın.</li>
	<li>Optik loblar, beyin bağlı göz antennal disk tanımlayın. Forseps kullanarak, göz antennal disk beyin ve pupa durumda çekin. Yeni bir 1 x Forseps veya 20 µL pipet kullanarak PBS damlacık aktarmak. Not: Prepupal göz antennal disk düz bir dokudur. Ancak, 8 h pupa tarafından göz diskler antennal diskler, çukurluğu hangi anterior merkezi beyin oturur döndürülür.</li>
	<li>Forseps kullanarak, doku ve göz antennal disk arasında bağlantı yerinde kesti. 20 µL pipet yavaşça disseke doku RNA izolasyon çözüm reaktif aktarmak için kullanın. Mümkün olduğu kadar küçük bir miktar pipetting tarafından aktarılan sıvı miktarını en aza indirmek.</li>
	<li>Tüm pupa disseke kadar yineleyin.</li>
</ol>4. diseksiyon D. melanogaster orta-pupa ve yetişkin antenler
Not: APF 40 h tarafından metamorfoz çoğunluğu tamamlandıktan ve yetişkin yapıları belli oluyor ama hala beyaz ve tanımlanamaz. Bu gelişim zamanda noktada yetişkin anten son şeklini almıştır ama hala saydamdır ve birkaç dışında koku reseptörleri çoğunluğu ifade başlamış değil.
<ol><li>Pupa antennal gruptakiler, 1. adımda açıklandığı gibi 50-100 prepupae toplar ve onları 25 ° C'de 40 h için yaş</li>
	<li>Damlalıklı 150 µL RNA izolasyon çözüm içine bir RNase free 1.5 mL microcentrifuge 200-µL damlalıklı kullanarak tüp ve tüp buza koyun.</li>
	<li>Diseksiyon altlığında içine bir PBS damlacıkları x 1'in disseke pupa yerleştirin. Forseps bir elinde vücut stabilize etmek için kullanın. Forseps diğer elinde kullanarak, yavaşça kafa vücut çevreleyen zar çuval içinde teşhir pupa, pupa olgusu en ön çeyreğinden akasındaki.</li>
	<li>Forseps kullanarak, dikkatle pupa vücudun geri kalanından kafasını forseps kümesi ile vücut tutarak ve kapalı kafa boyun forseps başka bir set ile ortak ripping kesin. Yavaşça başından başka bir 1 x forseps kullanarak PBS damlacık içine aktarın. Yukarı ve aşağı pipet (beyin, vb) gelişmekte olan Drosophila kafa çevrelemek için kullanılan açık bir membran elde etmek için baş içeriğini temizlemek için. Not: 40-50 h APF, anten membran en ön bölümüne bağlanır. Pipetting ile baş içeriğini kaldırıldığında onlar diseksiyon için belirgin hale gelecektir.</li>
	<li>Forseps kullanarak, pupa anten membran bağlantısını kesin. 3 anten 2nd parçasını kesmek sadece 3rd segment koku reseptör nöronlar evi olacak gibi forseps dilim için gelen bir segmental ortak kullanarakrd .</li>
	<li>20 µL pipet yavaşça disseke doku RNA izolasyon çözüm reaktif aktarmak için kullanın. Mümkün olduğu kadar küçük bir miktar pipetting tarafından aktarılan sıvı miktarını en aza indirmek. Tüm pupa disseke kadar yineleyin.</li>
	<li>Yetişkin antennal gruptakiler, yaklaşık 50 Yetişkin toplar ve onları bir hafta sonrası eclosion için yaş. Not: Koku reseptör gen ifade ve diğer genler bir hafta eclosion sonra zirve. Yetişkinler algılama eşik yükselmeye düşük bereket tutanaklar ile biyolojik olarak ilgili gen emin olmak bir hafta boyunca büyükseniz.</li>
	<li>Onlar bir CO2 rampasında hala hayatta iken RNA çekimi için sinekler incelemek. CO2 yastık RNase inhibitörleri ile tedavi. Confocal görüntüleme için PBS veya PBS + % 0.2 x 1'deki bir diseksiyon yastık üzerinde sinekler teşrih Triton.</li>
	<li>İlk olarak, CO2 İstasyonu panelindeki diseksiyon kapsamı altında uyumak için yetişkin koymak. Vücut, stabilize etmek bir elinde forseps kullanarak CO2 istasyonu üzerinde forseps diğer elinde yavaşça çekin/ikinci üçüncü antennal segmentten dışarı çimdik için takımını kullanın.</li>
	<li>Antenler antenleri doğrudan sıvı içine yerleştirmek için forseps kullanarak bir RNA izolasyon çözüm içine aktarın. Tüm yetişkin disseke kadar yineleyin. Not: anten RNA izolasyon çözümde batık olun. Anten yan tarafındaki tüp kalmış olur. Bu artan bir bozulma, RNA, RNA kalite ve miktar azaltılması neden olur.</li>
	<li>Doğrudan RNA ayıklama devam etmek ya da uzun süreli depolama için-80 ° C'de tüpü yerleştirin.</li>
</ol>5. RNA izolasyonu disseke dokular
<ol><li>-80 ° C depolama biriminden tüm örneklerini kaldırmak ve onları buz çözme.</li>
	<li>Kısa bir süre (5-6 sn, ~ 6.000 x g) tüp alt malzeme toplamak için her örnek spin.</li>
	<li>Her örnek için 10 autoclaved bir plastik havaneli ve bir elektrik motoru kullanarak eziyet s buz üzerinde.</li>
	<li>5.2 ve 5.3 4 numaralı adımları yineleyin.</li>
	<li>Piyasada kitleri kullanarak ve bir en iyi verim için üreticinin iletişim kuralları takip RNA çıkarma gerçekleştirin.</li>
	<li>QRT-PCR genler ilgi ve üreticinin iletişim kuralları aşağıdaki karşı belirli astar ve piyasada bulunan reaktifler kullanarak gerçekleştirin.<ol>
<li>Aşağıdaki koşullar kullanarak tüm PCR reaksiyonları taşımak: 95 ° C denatürasyon 10 dk ardından 40 devredir 15 95 ° c s, 30 55 ° C s ve 60 ° C 30 s. Not: Astar çift daldırma ile dpr gen için Tablo 1' de listelenen ve astar koku reseptör genleri için Hueston CE ve ark. içinde yer almaktadır 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Pupa Antennal diskler ve antenler immünhistokimya için fiksasyonu
Not: doku dokular için zaman aynı miktarda giderilen emin olmak için 10-20 kişilerden toplu olarak düzeltmek. Dokuların bütünlüğünü en üst düzeye çıkarmak için bir sabitleştirici aktarmadan önce PBT (PBS deterjan ile) örnekleri ikamet süresini en aza indirmek.
<ol><li>Toplamak disseke antennal diskler veya %0,2 200 µL içeren 200-µL PCR tüp içinde pupa anten PBT buz üzerinde doku bütünlüğünü korumak ve örnek--dan 200-µL PCR duvarına yapışmasını önlemek için hangi-ecek götürmek için eksik bir fiksasyon tüpleri. Not: Pupa anten ve antennal diskler oldukça şeffaf oldukları gibi görmek zor olabilir. Doku kaybı önlemek için tüm çamaşır adımları için bir diseksiyon kapsam kullanılması önerilir. Alternatif olarak, 96-de Terasaki plakaları fiksasyon için kullanılır ve boyama doku en iyi izlemek için olabilir.</li>
	<li>Saptamak disseke antennal disk ve antennal örnekleri üzerinden yaklaşık 200 µL % 4'lük içinde pupa PFA (Paraformaldehyde), oda sıcaklığında 30 dakika. Bu ve sonraki adımları, devam örnekleri tüplerini çözüm örneklerinde mix düzgün bir nutator. Adım 6,7 ilerleme.</li>
	<li>Yetişkin anten için tüm başından önce incelemek ve içinde yaklaşık 200 µL % 4'lük tamir PFA (paraformaldehyde) Oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>3 x 200 µL % 0,2 ile yıkayın PBT 10 dk için. Örnekleri üzerinde nutator kuluçka sırasında tutmak.</li>
	<li>Sabit başları diseksiyon mikroskop ikinci antennal segment bir ince diseksiyon için geri dön. Forseps kullanarak kafa dengelemek, yavaşça çekin/ikinci üçüncü antennal segmentten dışarı çimdik için.</li>
	<li>Disseke üçüncü antennal kesimleri yaklaşık 200 µL % 4'lük aktarım PFA (paraformaldehyde) ve oda sıcaklığında 30 dakika düzeltmek.</li>
	<li>3 x 200 µL % 0,2 ile yıkayın PBT 10 dk için. Örnekleri üzerinde nutator kuluçka sırasında tutmak.</li>
	<li>Örnekleri 4 ° C'de depolayın veya doğrudan bütün Dağı immünhistokimya ile devam edin. Not: antikor kullanılıyor, boyama verimliliğini değişebilir. Bu yöntem daha az bol protein Etiketler için uygun veya zayıf antikorlar olmalıdır. Ancak, zaman zaman, (kimlik veya sabitleştirici miktarı veya fiksasyon saat) protokolü bir duruma getirilmesi gerekebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Barish, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory+receptor+neuron+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).</li>
<li>Pan, J. W., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/mechanisms-of-development-and-evolution-of-the-insect-olfactory-system-2168-9296.1000130.php?aid=21773">Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system.</a> Cell and Developmental Biology. 2, 130(2013).</li>
<li>Ramdya, P., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+olfactory+systems+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolving olfactory systems on the fly.</a> Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).</li>
<li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+a+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Knecht, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+combinations+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+mediate+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> eLife. 5, 44-60 (2016).</li>
<li>Enjin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Humidity sensing in Drosophila.</a> Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).</li>
<li>Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+endogenous+rotund+expression+and+function+in+developing+Drosophila.+olfactory+system+using+CRISPR-Cas9-mediated+protein+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).</li>
<li>Hueston, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modulatory+proteins+and+olfactory+receptor+signaling+in+the+refinement+and+maintenance+of+fruitless+expression+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons.</a> PLoS Biology. 14 (4), 1002443(2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+rules+of+precursor+specification+underlying+olfactory+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity.</a> Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+gene+regulatory+network+module+governing+olfactory+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity.</a> PLoS Genetics. 12 (1), 1005780(2016).</li>
<li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+transcriptional+parallelism+and+variation+in+the+developing+olfactory+system+of+Drosophila+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8804(2017).</li>
<li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+behavioral+and+transcriptional+variation+underlying+CO2+sensory+neuron+function+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila.</a> Fly. 11 (4), 239-252 (2017).</li>
<li>Stern, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transgenic+reagents+for+Drosophila+simulans%2C+D.+mauritiana%2C+D.+yakuba%2C+D.+santomea%2C+and+D.+virilis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı labs Drosophila Drosophila koku doku, hem de karşılaştırmalı analizi, bu programların geliştirilmesinde çalışma genetik ve transkripsiyon programları belirlenmesinde baktılar için yararlı bir kaynaktır bir tür. Gelecekteki çalışmaları için bir astar olarak farklı gelişim aşamalarında sistemleri düzeyi transkripsiyon profillerden gerekirse özellikle yararlıdır. Burada açıklanan protokol sahne ve dört anahtar gelişimin koku alma sistemi üzerinden ön desenlendirme için kullanılmak üzere...

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış çalışmalar ve davranışsal evrim1,2,3 Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir, 4. Drosophila koku dokulara ek olarak hidro ve termo duyusal sinir hücreleri1,5,6uçucu kimyasal ipuçlarını bulmak koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu makale genel amacı nasıl sahne ve pupa ve yetişkin koku doku Drosophila türlerin geliştirme incelemek için göstermektir. Örnekleri farklı pupa aşamaları moleküler ve gelişimsel analizleri gibi RNAseq ve kantitatif RT-PCR, periferik koku sistem ayrıca teknikleri etiketleme vivo içinde doku oluşturmak için bu tekniği için mantığı olduğunu . Bu teknik özellikle gelişmekte olan yetişkin koku alma sistemi belirli hücre türünün tüm transgenik reaktifler var mı non -Drosophila melanogaster türlerden transkripsiyon profilleri dinamikleri tanımlamak yararlı olabilir etiketleme ve analizler. Bu makale, antennal diskler ve antenler pupa ve yetişkin Drosophila türlerden incelemek nasıl gösterir. İlk olarak, Drosophila puparium oluşumu (APF, beyaz pupa veya prepupae) gelişimsel evreleme ve species-specific yaşlanma için 0 h tanımlamak nasıl gösterir. Ardından, antennal diskler ve üçüncü antennal segment incelemek nasıl gösterir; Özellikle, nasıl onları göz disk ve ikinci antennal segment RNAseq veya RT-PCR için gereken doku saflık için ayırmak için. Bu protokol için kabaca açıklanan D. melanogaster aşamada önceden desenli antennal disk (prepupae) karşılık, öncüleri antennal üzerinden yelpazesi disk (8 h APF), ORNs (40 h APF), için terminal farklılaşma başlangıcı ve Yetişkin anten. Son olarak, örnek bir kantitatif RT-PCR için yetişkin anten istimal belgili tanımlık yöntem izole ve in vivo immünhistokimya için veriyoruz. Bu yöntem örnekleri bir RNA/DNA analizi ve koku dokulardan periferik Drosophila tür geliştirme immünhistokimya oluşturmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>10X Fosfat tamponlu Tuzlu Su</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>RNaz içermeyen suda 1X'e seyreltin</td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td>Hava Gazı</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>İki keskin forseps (Dumont #55)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA izolasyon solüsyonları</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buzlu</td><td></td><td></td><td></td>küçük kova</tr><tr><td>P20 ve P200 mikropipetleri ve uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Mikrofüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>En iyi sonuçlar için nükleaz ücretsiz satın alın</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit tozu</td><td>Polysciences</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>%10 Triton X-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td>1X PBS 2" petri kaplarında</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> %0,2 v/v'ye seyreltin <tr><td>55 mm filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Su ile ıslatın ve pupaları nemli tutmak için bir petri kabına koyun</td></tr><tr><td>25 C inkübatörde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>deiyonize H2O</td><td></td><td></td><td>Nükleaz içermeyen satın alın veya DEPC</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td></td> <td>ile tedavi edinTerizaki plaka kapaklarından diseksiyon pedleri yapmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>MicroWell Kapaklı Mini Tepsiler</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td>Kapaklar silikon diseksiyon pedleri yapmak için kullanılabilir</td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP antikoru</td><td>MBL uluslararası corpor</td><td>PM005</td><td>birincil antikoru</td></tr><tr><td>Fare anti RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td>birincil antikoru</td></tr><tr><td>ADL195 (anti lamin, fare)</td><td>Dev çalışmaları hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>birincil antikoru</td></tr><tr><td>Alexa Flor&reg; 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L)</td> <td>invitrojen</td><td>A11008</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Cy3 keçi anti-fare IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Triton X-100, Protein Sınıfı Deterjan,% 10 Çözelti, Steril Filtreli</td><td>CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td>deterjan</td></tr><tr><td>Lab Döndürücü</td><td>Termo bilimsel</td><td></td><td>Döndürücü Nükleaz</td></tr><tr><td>İçermeyen Su</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>Su</td></tr><tr><td>Hafif Hizmet Doku Silecekleri</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>Diseksiyon malzemelerini temizlemek için</td></tr><tr><td>Superscript II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>Ters Transkriptaz&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>RNA ekstraksiyonu</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 Primer</td><td>RT</td><td>ömrü teknolojileri</td><td>18418012</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Temizleme Kiti (50)</td><td>RNA ekstraksiyonu</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche 06402712001</td><td></td></tr><tr><td>LIGHTCYCLER 480 - ÇOK KUYULU PLAKA 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04729692001</td></tr><tr><td>NEBNext Yüksek Kaliteli 2X PCR Master Karışımı</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal drosophila analizde

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış ve davranışsal evrim Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. Drosophila koku doku uçucu kimyasal cues hidro ve termo duyusal sinir hücreleri ek olarak algılayan koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu protokol için yetişkin Drosophila türlerin periferik koku doku geliştirme diseksiyon açıklar. İlk aşama ve Drosophila larva, antennal disk diseksiyon tarafından erken pupa aşamaları, orta-pupa aşamaları ve yetişkin anten diseksiyon tarafından takip ardından yaş nasıl açıklar. Ayrıca nerede hazırlıklar qRT-PCR, RNAseq veya immünhistokimya RNA ayıklama gibi moleküler teknikleri kullanılabilir yöntemleri gösterir. Bu yöntemler aynı zamanda diğer Drosophila türler species-specific pupa geliştirme sürelerinin ve ilgili aşamaları için uygun yaşlanma hesaplanır sonra uygulanabilir.

Disseke gelişmekte olan koku doku RT-PCR tarafından takip RNA çıkarılması için gen ekspresyonu değerlendirmek için kullanılabilir veya onun ifade deseni ve genler alt hücrede yerleşimi belirlemek için immünhistokimya iletişim kuralları üzerinden alınan faiz. Bu bölümde, her iki protokolden temsilcisi sonuçları sunmak. Şekil 1 temsilcisi kantitatif RT-yüzey hücre reseptörü ve koku reseptör Gen transkripsiyonu vahşi-türü yetişkin anten gösterilen PCR var. <stro...

Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Drosophila türlerinde gelişmekte olan pupil ve yetişkin periferik koku dokularının evrelemesi ve diseksiyonunun genel amacı, periferik koku dokularının moleküler ve gelişimsel analizleri için örnekler oluşturmaktır. Bu yöntem, gelişmekte olan periferik koku dokularındaki belirli genlerin ifade dinamikleri, seviyeleri ve kalıpları gibi koku alma sistemi gelişimi ve evrimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem sayesinde, Drosophila türünde gelişen periferik koku alma sistemi hakkında bilgi edinebiliriz.Periferik tat ve görsel sistemler gibi diğer duyusal sistemlere de uygulanabilir. Bir RNA dizileme deneyi için, dört farklı gelişim aşaması için 100 ila 200 anten diski veya anten toplamayı planlayın. İmmünohistokimya için 10 ila 20 sineği incelemeyi planlayın.Diseksiyonda yer alan tüm malzemeleri %70 etanol kullanarak temizleyin. Ardından, malzemeleri RNase nötrleştiricilerle daha fazla temizleyin. Ve tüm çözümleri nükleaz içermeyen veya DEPC ile arıtılmış su kullanarak yapın.Pupa toplamak için larvaları 30 dakikalık aralıklarla izleyin. Ve sıfırıncı saat APF hazırlık aşamasında pupa toplayın. Larvalar hareketsiz olacak ve çok hafif, neredeyse beyaz re

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu teknik immünohistokimya veya elektrofizyolojik kayıt için Drosophila embriyonik neuromusculature ortaya çıkarır. Nöromüsküler gelişiminde erken olayları okuyan veya yumurtadan değil mutantlar elektrofizyoloji yapmak için yararlıdır.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Yetişkin hazırlamak için standart bir...

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Bu videoda, canlı bir Drosophila sineği elektrofizyolojik çalışmalar için bir tüpe monte edilmiştir. Elektrotlar, sineğin koku alma reseptör nöronları ile feromonlara spesifik nöronal tepkileri kaydetmek için sensillumun tabanına yerleştirilir.

Drosophila Sensilla'dan Uçucu Koku Maddelerine Yanıt Olarak Elektrofizyolojik Kayıtlar

Burada, koku alma reseptör nöronlarının (ORN) çeşitlenmesinde rol oynayan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlayan Drosophila antenlerinin tüm montaj immün boyama sürecini açıklıyoruz.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu kağıt doku immünhistokimya, Batı analiz ve RNA-ekstraksiyon için işlenmesi için protokolleri ile birlikte Drosophila pupa retina dissekan için cerrahi bir yöntem sunuyor.

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

Bu protokol, koku alma devresi düzeneğinin incelenmesi için diseksiyon prosedürünü, kültür durumunu ve anten-beyin eksplant sisteminin canlı görüntülenmesini açıklar.

Drosophila'da Koku Alma Devresi Düzeneğinin Hızlandırılmış Görüntüleme Çalışmaları için Bir Explant Sistemi

Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Keşfedin Drosophila türlerinde gelişen periferik koku dokusunun evreleme ve diseksiyon protokolünü. Bu yöntem moleküler analizler, gen ekspresyonu ve duyu sistemi gelişimi araştırmaları için kullanılabilir.

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

Daha fazla video keşfet