Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak

Bu prosedürün genel amacı, farklı koşullar altındaki thal kord membranlarında bulunan MultiPro komplekslerinin kompozisyonunu karşılaştırmalı olarak analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle anaerobik koşullara maruz bırakılan lamona hücrelerinden thal membranlarının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, thal kord membranları çözülür ve bir sükroz yoğunluk gradyanı üzerinde fraksiyone edilir.

Ardından, istenen fraksiyonların eşit hacimleri karıştırılır ve SDS page ile ayrıştırılır. Son olarak, Coomassie ile boyanmış bantlar tripsin ile sindirilir. Nihai olarak, incelenen fraksiyonlar arasındaki protein bolluğundaki değişiklikleri gözlemlemek için örnekler, kantitatif kütle spektrometrisi ile analiz edilir.

Bu tekniğin, belirli miktardaki proteinleri karşılaştıran kantitatif proteomik çalışmalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bizim yaklaşımımızda fraksiyone edilmiş numunelerin eşit hacimlerinin birleştirilip analiz edilmesidir. Bu durum, proteinlerin gradyan içindeki migrasyon davranışının incelenmesine ve ayrıca üçüncü grup membrandaki farklı protein dışı komplekslerin bileşiminin analiz edilmesine olanak tanır. Uygulanan suşlar ile ilgili olarak, metin protokolüne göre Chlamydomonas reinhardtii suşlarını kültüre aldıktan sonra, iki molar sükroz, suda %10 beta DM ve 0,5 molar Tris pH 8.0 stok çözeltilerini kullanın.

Sükroz yoğunluk gradyanlarını 14 x 89 mm'lik santrifüj tüplerinde hazırlamak için, öncelikle bir mililitre 1,3 molar çözeltiyi ve ardından bir mililitre 1,0 molar çözeltiyi yavaşça dökerek başlayın. Sonra sırasıyla 0,85, 0,7, 0,65 ve son olarak 0,4 molar çözeltilerden ikişer mililitre dökün. Anaerobik koşulları sağlamak için gradyanları gece boyunca soğuk odada saklayın.

Klamidomonas kültürlerinde, tilakoyit membranları izole etmek için kültüre kaplarına cam bir pipet yerleştirin ve sürekli karıştırma ile aydınlatma altında dört saat boyunca Argon ile havalandırın. İnkübasyonun ardından, hücreleri 2.500 ×g ve 4 °C'de beş dakika boyunca çöktürerek başlayın. Ardından, hücre peletlerini 30 mL H1 tamponu içerisinde yeniden süspande edin.

Santrifüj işlemini tekrarlayın ve hücreleri tekrar süspande edin. Hücreleri parçalamak için H one tamponunda süspande edin, 1.500 Pascal azot basıncına sahip bir nebülizörden geçirin. Seramik top ile metal arasındaki mesafenin hücrelerin parçalanacağı kadar küçük olduğundan emin olun.

Ardından hücreleri 4 °C'de 2.500 ×g'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatant açık yeşil renkte olmalıdır. Hücre parçalanması başarılı olduysa, hücreleri 50 mL H₂ buffer içerisinde yeniden süspande edin ve 4 °C'de 32.800 ×g'de 10 dakika boyunca pelletleyin.

Ardından, hücreleri 10 mililitre H three tamponu içinde süspanse ederek resüspansiyon sonrası, resüspande edilmiş peleti homojenize etmek için bir potter kullanın. Daha sonra, thal kordon sakroz yoğunluk gradyanlarını hazırlamak için 12 mililitre H three tamponu içindeki hücrelerle başlayın.

Ardından, yavaşça 12 mililitre H four tamponu ekleyerek bir katman oluşturun ve işlemi 12 mililitre H five tamponu ile tamamlayın. Rotoru dengelemek için H five kullanın ve gradyanları 70.700 ×g'de bir saat boyunca santrifüjleyin. TH bantlarını gradyanlardan çıkarın ve bunları seyreltmek için uygun hacimde H six tamponu kullanın.

Hücreleri 4 °C'de, 37.900 ×g hızında 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Eğer pelet sıkı değilse, santrifüj adımına daha fazla H6 tamponu ekleyin. Ardından yeniden süspanse edin.

Bir fotosistem sükroz yoğunluk gradyanı yüklemek için tilakoit kordları küçük bir hacim H altı tamponunda süspande edin. Öncelikle, her bir gradyan için gerekli olan tilakoit kord, beta DM ve H altı tamponu miktarlarını hesaplayın. Bu yönergelere göre, her gradyan %0,9 beta DM içinde mililitre başına 0,8 miligram klorofil içerecek ve H altı tamponu ile son hacim 700 mikrolitreye tamamlanacaktır.

Thylakoidleri çözünür hale getirmek için, her gradyan için ayrı ayrı Thylakoid beta DM ve H six tamponu içeren Eloqua'lar hazırlayın. Örnekleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin ve karıştırmak için birkaç dakikada bir alt üst edin. Ardından örnekleri 4 °C'de, 14,000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Pelet küçük ve beyazımsı olmalı, süpernatant ise koyu yeşil renkte olacaktır. Süpernatantı, H six tamponu ile dengelenmiş gradyanlara yükleyin ve 4 °C'de 14 saat boyunca 134.470 ×g'de ultrasentrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, fraksiyonlamaya geçmeden önce gradyanların fotoğraflarını çekin.

Tüpün altına bir iğne yardımıyla delik açın ve fraksiyonları 500 µL'lik tüplere toplayın. Alternatif olarak, 96 kuyucuklu plaka yöntemi kullanılabilir. Jel sindirimi ve kütle spektrometrisi için SDS-PAGE örnekleri, burada gösterildiği gibi metin protokolüne uygun olarak; immün kan analizi sonuçlarından wild type'ın altıncı fraksiyonu ve delta PS1'in 13. fraksiyonu kullanılarak hazırlanır.

Bu şekildeki analizde, döngüsel elektron akışı süper kompleks bileşenlerinin incelenmesi için A ve R birinin pik fraksiyonları seçilmiştir. Birkaç PS I çekirdek ve PS I ışık hasat proteinlerinin yanı sıra döngüsel elektron akışı süper kompleksine atanmış proteinler için vahşi tipin delta PS I 14 N üzerinden 15 N'ye göre nispi protein oranları gösterilmektedir; vahşi tip ve delta PS I'in altıncı ve on üçüncü fraksiyonlarındaki a NR bir ve CAS bolluğundaki farklılıklar, bunların bu kompleksin yeni bileşenleri olduğunu göstermektedir. Burada, vahşi tip ile a PG L bir nakavt suşu arasındaki bu döngüsel elektron akışı süper kompleksinin kantitatif karşılaştırma sonuçları yer almaktadır. İlginç bir şekilde; HCF 1 36, sitokrom B6, sitokrom B6 f alt birim dört ve PET C vahşi tipte zenginleşmiş görünürken, FTSH iki, sitokrom F ve PET O, PG L bir'de zenginleşmiş görünmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, farklı koşullar altında di sıvı membranlardaki MultiPro komplekslerinin bileşiminin nasıl karşılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olacaksınız. Sıvı membranların başarılı bir şekilde hazırlanması ve döngüsel elektron akışının izolasyonu için süper kompleks hücre parçalanması, hücrelerin poterylemesi ve sıvı membranların izolasyonunun kritik adımlar olduğunu unutmayın. Ayrıca, fotosentetik komplekslerin tam ayrışmasını sağlamak için sükroz yoğunluk gradyanlarının en az 12 saat boyunca santrifüj edilmesi gerekmektedir.