Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak ¹⁵ N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Bu prosedürün genel amacı, farklı koşullar altında tal kord zarlarındaki MultiPro komplekslerinin bileşimini karşılaştırmalı olarak analiz etmektir. Bu, ilk olarak anaerobik koşullara maruz kalan lamona hücrelerinden tal zarların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, kord zarları çözündürülür ve bir sakaroz yoğunluk gradyanı üzerinde fraksiyonlanır.

Daha sonra istenilen fraksiyonların eşit hacimleri karıştırılır ve SDS sayfasında ayrılır. Son olarak kumasi lekeli bantlar tripsin ile sindirilir. Sonuç olarak, numuneler, incelenen fraksiyonlar arasındaki protein bolluğundaki değişiklikleri gözlemlemek için kantitatif kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Bu tekniğin, belirli bir protein miktarını karşılaştıran kantitatif proteomik çalışmalar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yaklaşımımızda eşit hacimlerde fraksiyone edilmiş numunelerin birleştirilmesi ve analiz edilmesidir. Bu, gradyan içindeki proteinlerin göç davranışının incelenmesine ve ayrıca üçüncü grup zarındaki farklı protein olmayan komplekslerin bileşiminin analiz edilmesine izin verir. Uygulanan suşlarla ilgili olarak, klamidomalar kültürlendikten sonra, metin protokolüne göre dayanıklı suşları dizginledikten sonra, iki molar sakaroz, suda% 10 beta DM ve 0.5 molar trik pH 8.0 stok çözeltilerini kullanın.

Sükroz yoğunluk gradyanları için aşağıdaki çözeltileri hazırlamak için, 14 x 89 milimetre santrifüj tüpleri kullanarak gradyanları ayarlamak için, bir mililitre 1.3 molar çözeltiyi yavaşça dökerek başlayın, ardından bir mililitre 1.0 molar çözelti ile başlayın. Daha sonra 0.85, 0.7, 0.65 ve son olarak 0.4 molar çözeltilerin her birine iki mililitre dökün. Anaerobik koşulları indüklemek için gradyanları gece boyunca soğuk odada saklayın.

Chlamydomonas kültürlerinde, kültür şişelerine bir cam pipet yerleştirin ve tal kord zarlarını izole etmek için sürekli karıştırma ve aydınlatma ile dört saat boyunca Argonne ile köpürtün. İnkübasyondan sonra, hücreleri 2.500 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca peletleyerek başlayın. Daha sonra hücre peletlerini 30 mililitre H bir tampon içinde tekrar askıya alın.

Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve tekrar canlandırın. Hücreleri kırmak için hücreleri H bir tamponda askıya alın, bunları 1.500 Paskal nitrojen basıncına sahip bir nebülizörden geçirin. Seramik top ile metal arasındaki mesafenin hücrelerin kırılması için yeterince küçük olduğundan emin olun.

Daha sonra hücreleri 2.500 kat yerçekimi ve dört santigrat derecede yedi dakika boyunca döndürün. Süpernatant açık yeşil renkte olmalıdır. Hücre kırılması başarılı olduysa, hücreleri 50 mililitre H iki tamponunda askıya alın ve 32, 800 kat yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca peletleyin.

Daha sonra Resus, hücreleri 10 mililitre H üç tamponunda süspanse ettikten sonra, yeniden askıya alınan damağı homojenize etmek için bir çömlekçi kullanın. Yanında thal kordon sükroz yoğunluk gradyanlarını hazırlamak için. H üç tamponunda 12 mililitre hücre ile başlayın.

Daha sonra yavaşça 12 mililitre H dört tampon tabakası dökün ve 12 mililitre H beş tampon ile bitirin. Rotoru dengelemek için H beşi kullanın ve gradyanları 70, 700 kat yerçekiminde bir saat boyunca santrifüjleyin. TH bantlarını gradyanlardan çıkarın ve seyreltmek için uygun bir hacimde H altı tampon kullanın.

Hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekiminin 37.900 katında döndürün. Pelet sıkı değilse, santrifüjleme adımına daha fazla H altı tamponu ekleyin. Sonra diriltmek.

Bir fotoğraf sistemi sükroz yoğunluk gradyanı yüklemek için thal kordonlarını küçük bir hacimde H altı tamponunda askıya alın. İlk olarak, her gradyan için gereken thal kordonları, beta DM ve H altı tampon miktarlarını hesaplayın. Bu yönergeleri izleyerek, her gradyan% 0.9 beta DM'de mililitre başına 0.8 miligram klorofil içerecek ve H altı Tampon nihai hacmi 700 mikrolitreye getirecektir.

Thys'i çözündürmek için, her gradyan için Thylakoids beta DM ve H altı tamponu ile ayrı Eloqua hazırlayın. Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin ve karıştırmak için birkaç dakikada bir ters çevirin. Numuneleri 10 dakika ve dört santigrat derece boyunca yerçekiminin 14.000 katında santrifüjledikten sonra.

Pelet küçük ve beyazımsı olmalı ve süpernatan koyu yeşil olacaktır. Süpernatanı, 14 saat ve dört santigrat derece boyunca yerçekiminin 134, 470 katı yükseklikte H altı tampon ve ultra santrifüj ile gradyan dengesine yükleyin. Döndürme işleminden sonra, gradyanların fotoğraflarını çekin ve ardından parçalara ayırmak için.

Tüpün dibinde bir delik açmak için bir iğne kullanın ve fraksiyonları 500 mikrolitrelik tüplerde toplayın. Veya 96 kuyulu bir plaka işlemi. Jel sindirimi ve kütle spektrometresinde SDS sayfası için numuneler, burada gösterildiği gibi metin protokolüne göre, vahşi tipten fraksiyon altı ve delta PS one'dan fraksiyon 13 immünokan analizinden elde edilen sonuçlar kullanılarak.

Bu şekilde, döngüsel elektron akışı süper karmaşık bileşenlerinin analizi için A ve R bir'in tepe fraksiyonları seçilmiştir. Bağıl protein oranları, delta PS one üzerinde vahşi tip olarak gösterildi, birkaç PS one çekirdek üzerinde 14 N üzerinde 15 N üzerinde ve ayrıca PS one'ın hafif hasat proteinleri için ve ayrıca döngüsel elektron akışı süper kompleksi ile atanan proteinler için, vahşi tip ve delta PS birin altıncı ve 13 fraksiyonundaki bir NR ve CAS'ın bolluğundaki farklılıklar gösterildi, bunların bu kompleksin yeni bileşenleri olduğunu düşündürmektedir vahşi tip ile bir PG L tek nakavt suşu arasındaki bu döngüsel elektron akışı süper kompleksinin kantitatif karşılaştırması için sonuçlar burada. İlginç bir şekilde, HCF 1 36, sitokrom B altı, sitokrom B altı F alt birimi dört ve PET C vahşi tipte zenginleştirilmiş gibi görünürken, FTSH iki, sitokrom F ve PET O, PG L birde zenginleştirilmiş gibi görünmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, farklı koşullar altında di sıvı membranlardaki MultiPro komplekslerinin bileşimini nasıl karşılaştıracağınızı iyi bir şekilde anlayacaksınız. Sıvı zarların başarılı bir şekilde hazırlanması ve döngüsel elektron akışının izolasyonu için süper karmaşık hücre bozulması, hücrelerin çömlekçiliği ve sıvı zarların izasyonunun kritik adımlar olduğunu unutmayın. Ayrıca, fotosentetik komplekslerin tam olarak ayrılmasını sağlamak için sükroz yoğunluk gradyanlarının en az 12 saat santrifüjlenmesi gerekir.