Name: Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Keşfedin, ökaryotlarda transkripsiyon hatalarını ölçmek için C-seq yöntemini ve biyoinformatik analizleri kullanarak transkripsiyonel mutagenez araştırmalarında yeni bilgiler elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayın (C. Fritsch) hibe T32ES019851 fon tarafından mümkün yapıldı, R01AG054641 ve AFAR genç araştırmacı (M. Vermulst) verin.

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, transkripsiyon hataları Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis eleganstespiti için C-seq kitaplıkları hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının varolan iletişim kuralları, aynı zamanda alternatif teknikleri üzerinde çok sayıda avantajı vardır.
Son 15 yılda çok sayıda gazeteci sistemleri bu luciferase7,8 veya transkripsiyon algı...

Genom kesin bir biyolojik plan yaşam sağlar. Bu plan doğru çözümü için büyük bir kesinlikle transkripsiyonu genom önemlidir. Ancak, transkripsiyon hatasız olması pek mümkün değildir. Örneğin, RNA polimeraz hataya vitro1,2olmak uzun bilinmektedir ve son zamanlarda onlar3,5,6yanı sıra hataları vivo içinde işlemek gösterildi, zaman özellikle DNA hasar7,8,9,10ile karşı karşıya. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler transkripsiyon hataları sürekli onlar mutasyona uğramış proteinlerin güçlü bir kaynak olabilir düşündüren tüm canlı hücrelerde meydana gösterir.
Transkripsiyon mutagenesis olarak adlandırılan bu işlem iki yolla klasik mutagenesis farklı. İlk olarak, DNA ikileşmesi üzerinde bağımlı oldukları değil gibi genetik mutasyonlar aksine mitotik ve sonrası Mitotik hücre, transkripsiyon hataları etkiler. Transkripsiyon kalitesini etki mekanizmaları eğitim bu nedenle, mitotik ve sonrası Mitotik hücre mutasyon yük içine değerli bilgiler sağlar. İlginçtir, transkripsiyon hataları son zamanlarda protein toplama11,12,13 promosyona karıştığı olmuştur ve her iki karsinojenezis10 ' a katkıda onaylanmadığına karar ve antibiyotik direnci bakteriler14geliştirilmesi.
İkinci olarak, genetik mutasyonlar aksine transkripsiyon doğada geçici hatalardır. Geçici varlıklarını özellikle zor çünkü transkripsiyon hataları tespit etmek son derece zor hale getirir. Birkaç labs değerli muhabir deneyleri transkripsiyon mutagenesis incelenmesi için tasarladılar, örneğin, bu deneyleri sadece sınırlı sayıda bağlamları ve model organizmalar4,15transkripsiyon hataları ölçmek mümkün iken. Bu sınırlamalarını aşmak için birçok araştırmacılar RNA sıralama teknolojisi (RNA-seq) teorik olarak herhangi bir tür transcriptome kaydedilecek transkripsiyon hataları sağlar için döndü. Ancak, bu çalışmalar kolayca Ters transkripsiyon hataları, PCR güçlendirme hataları ve kendisi sıralama hataya doğası gibi Kütüphane İnşaat yapılar tarafından şaşırmış. Örneğin, RNA polimeraz (RNAPs) her 300.000 bazlar5,6yalnızca bir hata yapmak için beklenen süre ters transcriptases her ~ 20.000 bazlar, yaklaşık bir hata işlemek. Hata oranı Ters transkripsiyon yalnız RNA polimeraz hücreleri içinde hata oranı cüceler çünkü geleneksel RNA-Seq veri ( Kütüphane hazırlanmasında neden eserler gerçek transkripsiyon hataları ayırmak neredeyse imkansız olduğunu Şekil 1a).
Bu sorunu çözmek için tahlil5,16daire sıralama (Cirseq veya C-seq bundan sonra) en iyi duruma getirilmiş bir sürümünü geliştirdik. Bu tahlil transkripsiyon hataları ve diğer nadir türevleri RNA transcriptome5algılamak Kullanıcı sağlar. Bu tahlil önemli bir adım RNA daireselleşmesi döner çünkü daire-sıralama tahlil bu adı taşır. RNA hedefler circularized sonra onlar çok sayıda aynı RNA şablonu kopyalarını içeren doğrusal cDNA molekülleri üretmek için bir haddeleme daire moda, transkripsiyonu ters gelir. Bir hata bu şablonlardan biri varsa, bu hata ayrıca cDNA molekül içinde yer alan her tek tekrar mevcut olacaktır. Buna ek olarak, Ters transkripsiyon, PCR güçlendirme veya sıralama tarafından tanıtılan hataları rastgele ortaya çıkan eğilimindedir ve bu nedenle yalnızca bir veya iki tekrarlar içinde mevcut olacaktır. Böylece, her cDNA molekül için bir fikir birliği sıra oluşturma ve rasgele hatalar tüm tekrarlar içinde oluşan hatalar dan ayırt etme, Kütüphane inşaat yapıları etkili gerçek transkripsiyon hataları (Şekil 1b) ayrılabilir.
Uygun bir şekilde kullanıldığında, C-seq tahlil doğru RNA içinde herhangi bir tür transcriptome temel oyuncu değişikliği, eklemeler ve silmeler oranı tespit etmek için kullanılabilir (örneğin, çapraz ve Ochman17bakınız). Örneğin, bir tek temel çözünürlükte5 genom çapında ölçümleri ve transkripsiyon Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis elegans hata hızı sağlamak için C-seq tahlil kullandık (yayınlanmamış gözlemler). Başlangıçta doğru RNA virüsü nüfus sıralamak için kullanılan, bu en iyi duruma getirilmiş sürümü, C-seq tahlil Kütüphane inşaat yapıları için katkıda sert koşullarına Kütüphane hazırlık sırasında en aza indirmek için düzenlenmiştir. Buna ek olarak, bir dizi ticari olarak mevcut kitleri kullanarak, tahlil-den geçerek büyük ölçüde, yanı sıra kendi user-friendliness artırıldı. Uygun bir şekilde kullanıldığında, bu tahlil doğru bir şekilde yapar, böylece önemli ölçüde önceki çalışmalar6tarihinde iyileştirilmesi başına transkripsiyon hataları binlerce algılayabilir. Genel olarak, bu yöntem transkripsiyon mutagenesis çalışmak için güçlü bir araç sağlar ve transkripsiyon organizmalar geniş bir alanda kalitesini kontrol mekanizmaları yeni anlayışlar kazanmak kullanıcının izin verir.

<table><tbody><tr><td>RiboPure RNA saflaştırma kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Toplam RNA saflaştırma</td></tr><tr><td>Genelute mRNA saflaştırma</td><td>kiti Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>mRNA saflaştırma</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen Su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Elüsyon ve seyreltme</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>RNA parçalanması</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 1 (ssRNA Ligaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>RNA daireselleştirme</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>RNaz inhibitörü</td></tr><tr><td>SuperScript III Ters Transkriptaz</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Yuvarlanan daire ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>10 mM dNTP karışımı</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Yuvarlanan daire ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>Rastgele heksamerler (50 ng/&mikro; L)</td> <td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Yuvarlanan daire ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>NEB İkinci İplik Sentez Modülü</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>İkinci İplik Sentezi</td></tr><tr>Illumina <td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>cDNA kütüphanesi hazırlığı</td><td>için NEBNext Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti</td></tr><tr><td>NEB Next indeks primerleri</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>Multipleks PCR primerleri</td></tr><tr><td>Oligo Temiz & Yoğunlaştırıcı</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>RNA ve DNA örneklerinin temizlenmesi</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıs</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Manyetik boncuk saflaştırma</td></tr><tr><td>AMPure XP boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Manyetik boncuk saflaştırma</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 Mikrosantrifüj</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>santrifüjleme</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Bilimsel</td><td>H1010</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>Orta ila Yüksek sıcaklık döngü koşulları</td></tr><tr><td>PTC-200 Termal Döngüleyici</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001 ve nbsp;</td><td>Düşük sıcaklıkta çevrim koşulları</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Moleküler Biyoürünler</td><td>700S-11</td><td>Sterilizasyon</td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpü</td><td>Corning</td><td>430290</td><td>Nükleaz İçermeyen</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpü</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>Nükleaz İçermeyen</td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Nükleaz İçermeyen</td></tr><tr><td>4200 Tapestation Sistemi</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü için nükleotid analiz cihazı</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli RNA Ekran Bandı</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Numune Tamponu</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör Cihazı</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Çift sarmallı DNA kalite kontrolü</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Çift sarmallı cDNA örnekleri için kalite kontrol</td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>İnkübasyon</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Spektrofotometre</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>RNA konsantrasyonunun belirlenmesi</td></tr></tbody></table>

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Doğru transkripsiyon genetik bilgi sadık ifade için gereklidir. Rağmen şaşırtıcı derecede az transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları hakkında bilinir. Bilimsel bilgi bu boşluğu doldurmak için biz son zamanlarda daire-sıralama tahlil Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis transcriptome boyunca transkripsiyon hataları tespit etmek için en iyi duruma getirilmiş elegans. Bu iletişim kuralı böylece transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları benzersiz detay aydınlatılmamıştır ökaryotik hücrelerde transkripsiyon hataları peyzaj eşlemek için araştırmacılar ile yeni ve güçlü bir araç sağlar.

Gibi tüm kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar, her C-seq deney bir hantal, büyük veri kümesi oluşturur. İlk kez kullananlar için bu veri kümeleri ele almak zor olabilir; Böylece, tüm kullanıcılar deneme önce deneyimli bir biyo-informatician başvurun salık vermek. Ortalama olarak, beklenti kullanıcıların yaklaşık 55-70 Giga baz (Gbases) çoğu kitlesel paralel sıralama platformlarda başına oluşturur olduğunu. Böylece her örnek için yaklaşık 2-6 Gbases satın alınan bu iletişim kuralı için ge...

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Bu yöntem, hangi RNA polimeraz alt birimlerinin veya biyolojik süreçlerin transkripsiyonun doğruluğunu kontrol ettiği gibi transkripsiyonel mutajenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ökaryotik organizmaların transkriptomlarındaki endojen transkripsiyon hatalarının ölçülmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu protokole yeni başlayan kişiler, testin uzunluğu ve karmaşıklığı ve verileri yorumlamak için gelişmiş biyoinformatiklere ihtiyaç duyulması nedeniyle mücadele edeceklerdir.Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış numunenin 20 mikrolitresini bir dakika boyunca 65 santigrat derecede ısı denatüre ederek RNA parçalarını dairesel hale getirin. Bir dakika sonra, numuneyi hemen iki dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, dört mikrolitre 10x T4 RNA ligaz tamponu, dört mikrolitre 10 miliMolar ATP, bir mikrolitre RNaz inhibitörü, bir mikrolitre nükleaz içermeyen su ve sekiz mikrolitre %50 polietilen glikol veya PEG ekleyin.Daha sonra numuneyi girdap yaparak iyice karıştırın. Daha sonra bir mikrolitre T4 RNA ligaz başına 10 birimlik iki mikrolitre ekleyin. Numuneyi pipetleyerek tekrar karıştırın ve kapak sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlanmış bir termodöngüleyicide iki saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.İki saatlik inkübasyondan sonra, numuneye 10 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve numuneyi bir oligo temizleme ve konsantrasyon kiti ile temizleyin. Numuneyi 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda süzün. Dairesel RNA moleküllerini tersine çevirmek için, dört mikrolitre 10 miliMolar dNTP, mikrolitre rastgele heksamer başına dört mikrolitre 50 nanogram ve dokuz mikrolitre RNA'ya dokuz mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin.Pipetleyerek iyice karıştırın ve numuneyi 65 santigrat derecede bir dakika boyunca denatüre edin. Numuneyi denatüre ettikten sonra, iki dakika boyunca buzun üzerine koyun. Numuneye sekiz mikrolitre 5x birinci iplikli sentez tamponu, iki mikrolitre 0.1 miliMolar DTT ve mikrolitre ters transkriptaz başına dört mikrolitre 200 birim ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.Numuneyi 25 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, kapak inkübasyon sıcaklığından beş santigrat derece daha yüksek olacak şekilde ayarlanmıştır. Daha sonra numuneyi, kapak 47 santigrat dereceye ayarlanmış olarak 42 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti ile temizledikten sonra numuneyi 42 mikrolitre elüsyon solüsyonunda elute edin.Çift sarmallı bir cDNA kütüphanesi oluşturmak için ikinci iplikçik sentez kitini kullanın. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin ve numunenizin 38 mikrolitresine 30 mikrolitre NF suyu ekleyin. Daha sonra, sekiz mikrolitre 10x ikinci iplikçik tamponu ve dört mikrolitre ikinci iplikçik enzimi ekleyin ve numuneyi 16 santigrat derecede iki buçuk saat inkübe etmeden önce hafif pipetleme ile karıştırın.Numuneleri 100 mikrolitrelik reaksiyonlar için oligo temizleme ve konsantrasyon kiti ile temizleyin ve numuneleri 38 mikrolitre nükleaz içermeyen suda elüte edin. Son onarım reaksiyonunu pipetleyerek karıştırın ve 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 20 santigrat derece inkübasyonu 65 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon ile takip edin.İlk olarak, yeni nesil dizileme için adaptörleri 10 miliMolar tris HCl'de on kat seyrelterek 1.5 mikroMolar'lık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Daha sonra her numuneye 2,5 mikrolitre seyreltilmiş adaptör ve bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. Ardından, 15 mikrolitre künt TA ligaz ana karışımı ekleyin.Karıştırmak için numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyin ve 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, üç mikrolitre urasil spesifik eksizyon reaktif enzimi ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ligasyon tamamlandıktan sonra, toplam 100 mikrolitre hacim için numuneye 13,5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve boyut seçimine devam edin.Manyetik boncukları oda sıcaklığına alıştırın. Her numuneye 30 mikrolitre iklimlendirilmiş, yeniden süspanse edilmiş manyetik boncuk ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Numuneyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Boncukları süpernatanttan ayırmak için numuneyi beş dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve manyetik boncukları atın. Her numuneye 15 mikrolitre manyetik boncuktan oluşan taze bir alikot ekleyin.Pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Numuneleri manyetik bir rafa yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, boncukları rahatsız etmediğinizden emin olarak süpernatanları dikkatlice çıkarın ve atın.Peletlenmiş manyetik boncukları bozmadan numunelerin her birine 200 mikrolitre %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. Ardından, numunelerdeki etanol kalıntılarını tamamen çıkarın ve boncukları beş dakika havayla kurutun, ancak boncukları aşırı kurutmamaya dikkat edin. Numuneleri boncuklardan çıkarmak için tüpleri manyetik standdan çıkarın.19 mikrolitre 10 miliMolar tris HCl ekleyin. Boncukları yeniden süspanse etmek için karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Numuneleri manyetik standa geri yerleştirin ve boncukları süpernatanttan ayırmak için beş dakika inkübe edin.Saflaştırılmış, boyutu seçilmiş cDNA kütüphanelerini içeren süpernatantın 15 mikrolitresini tüplerden dikkatlice çıkarın ve 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Her saflaştırılmış cDNA kitaplığına beş mikrolitre üniversal astar ve beş mikrolitre benzersiz bir indeks astar ekleyin ve bunları pipetleyerek iyice karıştırın. Polimeraz ana karışımını kristaller ve diğer çökeltiler için dikkatlice kontrol edin ve çökeltiler çözülene kadar ana karışımı elle ısıtın.Numuneye 25 mikrolitre polimeraz ana karışımı ekleyin. Numuneyi pipetleme ile karıştırın ve PCR amplifikasyonu için ekteki metin protokolünde listelenen döngü koşullarını izleyin. Doğrudan PCR reaksiyonuna 45 mikrolitre yeniden askıya alınmış manyetik boncuk ekleyerek son kitaplıkları temizleyin.Bunları pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Numuneyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. İnkübasyondan sonra, süpernatanı atın ve 30 saniye boyunca taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, etanolü numuneden tamamen çıkarın ve boncuk peletini beş dakika havayla kurutun. Daha sonra 35 mikrolitre 0.1x TE içinde elüte edin. Boncukları pipetleyerek yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Tüp beş dakika boyunca manyetik stand üzerinde kaldıktan sonra, süpernatanın 30 mikrolitresini 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Kitaplıkları eksi 80 santigrat derecede saklayın. RNA'nın izolasyonundan sonra, elektroforetogramda iki farklı rRNA zirvesi görülebilir. RNA'nın parçalanması, 50 ila 70 baz çifti RNA fragmanı ile sonuçlanacaktır.Dairesel RNA şablonlarının en az üç tandem tekrarından oluşan cDNA moleküllerini oluşturmak için yuvarlanan daire ters transkripsiyonu kullanıldı. Manyetik boncuklar ile boyut seçimi, uygun büyüklükteki kütüphanelerin saflaştırılmasını sağlar. Tek bir C-seq kütüphanesinin sıralama bilgileri, çoğu tekrarın 45 ila 80 baz uzunluğunda olma eğiliminde olduğunu gösterir.Sıralanan bazların yaklaşık% 50'si bu tekrarların bir parçasıdır. Bu bazların çoğu, üç veya daha fazla tekrar içeren oranlarda mevcut olduğundan, sıralanan benzersiz bazların sayısı, sıralanan toplam baz sayısının yaklaşık üçte biridir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila üç gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, işinize müdahale edebilecek RNA'lardan arınmış, steril bir çalışma ortamını her zaman sürdürmek önemlidir. İşlem sırasında herhangi bir hata yapılmadığından emin olmak için her adımı dikkatlice takip etmek de önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, C-seq testini kullanarak ökaryotlarda transkripsiyon hatalarını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Burada, protein-DNA etkileşimlerinin baz çiftine yakın çözünürlüğünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu, kromatin immünopresipitasyonu (ChIP-exo) ile seçici olarak zenginleştirilmiş DNA fragmanlarının eksonükleaz muamelesi ve ardından yüksek verimli dizileme ile elde edilir.

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Tomurcuklanan mayada ipliğe özgü transkripsiyon run-on (TRO) yaklaşımı ile BrUTP kullanarak in vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun sonlandırılmasının analizi için temel bir deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu protokol, hem mayada hem de daha yüksek ökaryotlarda diğer RNA polimerazlar tarafından transkripsiyon sonlandırmasını incelemek için genişletilebilir.

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Doğal γH2A.X kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yoluyla yaygın kırılgan bölge kırılmalarını tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleriyle ilişkili hem zamanı hem de işçiliği önemli ölçüde azaltırken, sonuçların yüksek tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini korur.

Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Insersiyonel mutajenez, fonksiyonel genomik elementleri tanımlamak için ileri genetikte önemli bir araçtır. Burada, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tespit etmek için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekranı (InSET) açıklıyoruz.

Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

Bu yazıda, transkripsiyonu ve bakteriyel transkripsiyonu hedefleyen antibakteriyel ajanların inhibitör aktivitesini işlevsel olarak incelemek için bir protokol açıklıyoruz.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

Keşfedin, ökaryotlarda transkripsiyon hatalarını ölçmek için C-seq yöntemini ve biyoinformatik analizleri kullanarak transkripsiyonel mutagenez araştırmalarında yeni bilgiler elde edin.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Daha fazla video keşfet