Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Bu yöntem, hangi RNA polimeraz alt birimlerinin veya biyolojik süreçlerin transkripsiyonun doğruluğunu kontrol ettiği gibi transkripsiyonel mutajenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ökaryotik organizmaların transkriptomlarındaki endojen transkripsiyon hatalarının ölçülmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu protokole yeni başlayan kişiler, testin uzunluğu ve karmaşıklığı ve verileri yorumlamak için gelişmiş biyoinformatiklere ihtiyaç duyulması nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış numunenin 20 mikrolitresini bir dakika boyunca 65 santigrat derecede ısı denatüre ederek RNA parçalarını dairesel hale getirin. Bir dakika sonra, numuneyi hemen iki dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, dört mikrolitre 10x T4 RNA ligaz tamponu, dört mikrolitre 10 miliMolar ATP, bir mikrolitre RNaz inhibitörü, bir mikrolitre nükleaz içermeyen su ve sekiz mikrolitre %50 polietilen glikol veya PEG ekleyin.

Daha sonra numuneyi girdap yaparak iyice karıştırın. Daha sonra bir mikrolitre T4 RNA ligaz başına 10 birimlik iki mikrolitre ekleyin. Numuneyi pipetleyerek tekrar karıştırın ve kapak sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlanmış bir termodöngüleyicide iki saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

İki saatlik inkübasyondan sonra, numuneye 10 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve numuneyi bir oligo temizleme ve konsantrasyon kiti ile temizleyin. Numuneyi 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda süzün. Dairesel RNA moleküllerini tersine çevirmek için, dört mikrolitre 10 miliMolar dNTP, mikrolitre rastgele heksamer başına dört mikrolitre 50 nanogram ve dokuz mikrolitre RNA'ya dokuz mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin.

Pipetleyerek iyice karıştırın ve numuneyi 65 santigrat derecede bir dakika boyunca denatüre edin. Numuneyi denatüre ettikten sonra, iki dakika boyunca buzun üzerine koyun. Numuneye sekiz mikrolitre 5x birinci iplikli sentez tamponu, iki mikrolitre 0.1 miliMolar DTT ve mikrolitre ters transkriptaz başına dört mikrolitre 200 birim ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.

Numuneyi 25 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, kapak inkübasyon sıcaklığından beş santigrat derece daha yüksek olacak şekilde ayarlanmıştır. Daha sonra numuneyi, kapak 47 santigrat dereceye ayarlanmış olarak 42 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti ile temizledikten sonra numuneyi 42 mikrolitre elüsyon solüsyonunda elute edin.

Çift sarmallı bir cDNA kütüphanesi oluşturmak için ikinci iplikçik sentez kitini kullanın. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin ve numunenizin 38 mikrolitresine 30 mikrolitre NF suyu ekleyin. Daha sonra, sekiz mikrolitre 10x ikinci iplikçik tamponu ve dört mikrolitre ikinci iplikçik enzimi ekleyin ve numuneyi 16 santigrat derecede iki buçuk saat inkübe etmeden önce hafif pipetleme ile karıştırın.

Numuneleri 100 mikrolitrelik reaksiyonlar için oligo temizleme ve konsantrasyon kiti ile temizleyin ve numuneleri 38 mikrolitre nükleaz içermeyen suda elüte edin. Son onarım reaksiyonunu pipetleyerek karıştırın ve 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 20 santigrat derece inkübasyonu 65 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon ile takip edin.

İlk olarak, yeni nesil dizileme için adaptörleri 10 miliMolar tris HCl'de on kat seyrelterek 1.5 mikroMolar'lık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Daha sonra her numuneye 2,5 mikrolitre seyreltilmiş adaptör ve bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. Ardından, 15 mikrolitre künt TA ligaz ana karışımı ekleyin.

Karıştırmak için numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyin ve 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, üç mikrolitre urasil spesifik eksizyon reaktif enzimi ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ligasyon tamamlandıktan sonra, toplam 100 mikrolitre hacim için numuneye 13,5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve boyut seçimine devam edin.

Manyetik boncukları oda sıcaklığına alıştırın. Her numuneye 30 mikrolitre iklimlendirilmiş, yeniden süspanse edilmiş manyetik boncuk ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Numuneyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Boncukları süpernatanttan ayırmak için numuneyi beş dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve manyetik boncukları atın. Her numuneye 15 mikrolitre manyetik boncuktan oluşan taze bir alikot ekleyin.

Pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Numuneleri manyetik bir rafa yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, boncukları rahatsız etmediğinizden emin olarak süpernatanları dikkatlice çıkarın ve atın.

Peletlenmiş manyetik boncukları bozmadan numunelerin her birine 200 mikrolitre %80 taze hazırlanmış etanol ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. Ardından, numunelerdeki etanol kalıntılarını tamamen çıkarın ve boncukları beş dakika havayla kurutun, ancak boncukları aşırı kurutmamaya dikkat edin. Numuneleri boncuklardan çıkarmak için tüpleri manyetik standdan çıkarın.

19 mikrolitre 10 miliMolar tris HCl ekleyin. Boncukları yeniden süspanse etmek için karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Numuneleri manyetik standa geri yerleştirin ve boncukları süpernatanttan ayırmak için beş dakika inkübe edin.

Saflaştırılmış, boyutu seçilmiş cDNA kütüphanelerini içeren süpernatantın 15 mikrolitresini tüplerden dikkatlice çıkarın ve 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Her saflaştırılmış cDNA kitaplığına beş mikrolitre üniversal astar ve beş mikrolitre benzersiz bir indeks astar ekleyin ve bunları pipetleyerek iyice karıştırın. Polimeraz ana karışımını kristaller ve diğer çökeltiler için dikkatlice kontrol edin ve çökeltiler çözülene kadar ana karışımı elle ısıtın.

Numuneye 25 mikrolitre polimeraz ana karışımı ekleyin. Numuneyi pipetleme ile karıştırın ve PCR amplifikasyonu için ekteki metin protokolünde listelenen döngü koşullarını izleyin. Doğrudan PCR reaksiyonuna 45 mikrolitre yeniden askıya alınmış manyetik boncuk ekleyerek son kitaplıkları temizleyin.

Bunları pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Numuneyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. İnkübasyondan sonra, süpernatanı atın ve 30 saniye boyunca taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, etanolü numuneden tamamen çıkarın ve boncuk peletini beş dakika havayla kurutun. Daha sonra 35 mikrolitre 0.1x TE içinde elüte edin. Boncukları pipetleyerek yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Tüp beş dakika boyunca manyetik stand üzerinde kaldıktan sonra, süpernatanın 30 mikrolitresini 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Kitaplıkları eksi 80 santigrat derecede saklayın. RNA'nın izolasyonundan sonra, elektroforetogramda iki farklı rRNA zirvesi görülebilir. RNA'nın parçalanması, 50 ila 70 baz çifti RNA fragmanı ile sonuçlanacaktır.

Dairesel RNA şablonlarının en az üç tandem tekrarından oluşan cDNA moleküllerini oluşturmak için yuvarlanan daire ters transkripsiyonu kullanıldı. Manyetik boncuklar ile boyut seçimi, uygun büyüklükteki kütüphanelerin saflaştırılmasını sağlar. Tek bir C-seq kütüphanesinin sıralama bilgileri, çoğu tekrarın 45 ila 80 baz uzunluğunda olma eğiliminde olduğunu gösterir.

Sıralanan bazların yaklaşık% 50'si bu tekrarların bir parçasıdır. Bu bazların çoğu, üç veya daha fazla tekrar içeren oranlarda mevcut olduğundan, sıralanan benzersiz bazların sayısı, sıralanan toplam baz sayısının yaklaşık üçte biridir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila üç gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, işinize müdahale edebilecek RNA'lardan arınmış, steril bir çalışma ortamını her zaman sürdürmek önemlidir. İşlem sırasında herhangi bir hata yapılmadığından emin olmak için her adımı dikkatlice takip etmek de önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, C-seq testini kullanarak ökaryotlarda transkripsiyon hatalarını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.