Name: Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Keşfedin GABA A reseptör ligandlarının keşfi için radyoligand bağlanma ve elektrofizyolojik kayıt yöntemlerini. Xenopus oositleri ve kemirgen beyin dilimleri kullanılarak selektif bileşiklerin tanımlanması sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab ve Marie Claire Pflimlin Roche üzerinden ve Tifany Schaer ve Deborah Paolucci HiQScreen dan onların mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

Xenopus laevis yer alan ve Cenevre Kanton hayvan kurallarına göre ele.
1. Radioligand bağlama
<ol><li>
Tahlil plaka hazırlanması
	<ol>
<li>1, 5 L 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl ve 15 mM Tris ile tahlil tamponunun hazırlamak; HCl ile pH 7.4 için ayarlayın.</li>
		<li>50.76 µM (Örneğin, 5 µL bileşik 980 µL tahlil arabellekte bir microcentrifuge tüp içine 10 mm), test edilecek bileşikler hazırlayın. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.</li>
		<li>Başvuru bileşik flumazenil öncesi bir seyreltme bileşik (10 mM) pipetting 1 µL tarafından tahlil arabellek 1.970 µL için hazır olun. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.</li>
		<li>[3H] flumazenil hisse senedi çözüm 4 4 ° C'de tahlil arabelleği ile seyreltik nM 50 mL polipropilen tüp içinde.</li>
		<li>Pipet 50 µL/iyi tahlil arabelleği sütun 1 ve 3 – 11 / 96-şey Mikroplaka Şekil 2' de gösterilen plaka düzeninde gösterildiği gibi içine.</li>
		<li>50.76 µM seyreltilmiş bileşiklerin 73.2 µL pipet (bkz. Adım 1.1.2) plaka 12 sütuna.</li>
		<li>Geometrik bir ilerleme üzerinde 9 adımları kullanarak her bileşim, seyreltik (1E-10 -1E-06 M), bir 23.12 µL transfer hacmi ve dolgu sütun 3 – 11. Seyreltme iyice karıştırın. İpucu her seyreltme sonra değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre zarları sulandırmak
	<ol>
<li>Daha önce bir HEK293 overexpressing insan GABAA reseptör izole hücre zarlarında çözülme (0,025-0,15 mg/mL), oda sıcaklığında (RT) 80 mL elde edilir ve süspansiyon tahlil arabellek 4 ° C'de transfer</li>
		<li>Membran çözüm hala 4 ° C'de 30-40 s 10.000-12.000 rpm'de için bir doku homogenizer ile resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diazepam non-spesifik bağlantısını (NSB) denetimi için sulandırmak
	<ol>
<li>4 mM diazepam hisse senedi çözüm ile 5 ml 40 µM bir konsantrasyon için tahlil arabelleği sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaksiyonu başlatmak
	<ol>
<li>4 nM [3H] flumazenil 50 µL 96-şey plaka her kuyuya pipet ve bir buzlu su kabında tutun.</li>
		<li>GABAA reseptör alt türü membranlar hazırlık 0,5 mg/mL bir protein konsantrasyonu için 100 µL ekleyin.</li>
		<li>50 µL 40 µM diazepam 2 sütuna pipet.</li>
		<li>Buz üzerinde 1 h plaka kuluçkaya.</li>
		<li>Her şey bir 96-iyi filtre plaka sonraki membran ayırma ve radyoaktivite ölçümü için tahlil arabelleği 50 µL ekleyin ve reaksiyon sonra durdurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tepki bırak
	<ol>
<li>50 mM Tris-HCl, pH 7.4 ile çamaşır tampon hazırlayın.</li>
		<li>96-şey hücre hasat kullanarak çözüm filtre. 3 tabak yıkama x 300 µL buz gibi çamaşır arabelleği iyi ücret ile.</li>
		<li>Alt kısmında bir plastik film ile plaka mühür ve mercek sıvı için kokteyl 40 µL eklemek her sayma mercek iyi ve % 70 etanol ile silin.</li>
		<li>En az 1 h plaka RT. yavaşça salla RT, en az bir saat için stand izin</li>
		<li>(BGBM) radyoaktivite plaka bir mercek tezgahın üzerine yerleştirerek ölçmek. Bir şey başına 3 min için ölçme izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Non-spesifik bağlama (NSB) ve toplam bağlama (TB) de çoğaltır veya örneklerin triplicates gelince 8 için Ortalama çoğaltır belirlemek. % Özel bağlayıcı (SB) aşağıdaki denklemi göre her örnek ortalamasını hesaplamak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Burada, Toplam SB NSB demekeksi demek TB =.</li>
		<li>Apsis % SB karşı koordine içinde içinde inhibitör konsantrasyonlarının arsa. Tek site Yarışması analiz denklemi kullanarak verileri sığdırmak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Burada, y = SB, % A = y, minimum B y, maksimum = C = IC50, X = rakip bileşim, konsantrasyon günlük10 D eğri (Hill katsayısı) eğimi =.</li>
		<li>Yarım maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50), kullanarak bağlama benzeşim (Ki) hesaplamak ilgili membranlar9ve konsantrasyon [3H] [3H] flumazenil ayrışma sabiti (Kd) Flumazenil tahlil göre aşağıdaki verileri kullanarak denklemi: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reseptör ifade ve kayıtları Xenopus yumurta içinde
<ol><li>Hasat yumurtalık ve oosit hazırlanması
	<ol>
<li>88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O ve 0,41 mM CaCl2.6H2O, pH 7.4 ile steril Barth çözüm hazırlamak , 100 birim/mL ile penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL amfoterisin b desteklenmiş</li>
		<li>1 x OR2 orta boy (hiçbir CaCl2) hazırlamak 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH 7.4 ile.</li>
		<li>Kurban bir Xenopus Laevis soğutmalı (150 mg/L, pH 7.4 ayarlanmış bir konsantrasyon), Tricaine methanesulfonate ve sodyum bikarbonat (300 mg/L) 20 dk için derin anestezi tarafından kadın işten çıkarma tarafından takip.</li>
		<li>Yumurtalıklar temiz makas ve forseps ile hızla hasat ve 40 mL 1 x Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotic ile dolu 2 Petri yemekler (10 cm) koyun.</li>
		<li>2 hafta 4 ° C'de Barth çözümde Disosiye olmayan yumurtalık saklamak</li>
		<li>Ayrılma için temiz bir tıraş bıçağı ile Yumurtalık küçük kesirler (1-2 cm3) kesme ve onları CaCl2 (OR2-noCaCl2) olmadan OR2 orta 50 ml % 0,2 collagenase içeren kuluçkaya (tip ı) 100 mL spinner 17-19 ° c şişesi 4 – 5 h. manyetik Bar doğrula için yavaş bir ajitasyon ile yaklaşık 3-5 cm yukarısında yumurta kırma önlemek için spinner balonun altındaki yer.</li>
		<li>4 – 5 h sonra yumurtalar çoğunu kendi folikül serbest doğrulayın (yani, onlar yüzmek çevresinde tek tek). Onları yıkamak 5 x 1.8 mM CaCl2ile desteklenmiş OR2 200 mL ile.</li>
		<li>Yumurta Petri-yemekleri (10 cm) Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotics dolu ve en az bir gecede 17 ° c cDNA veya mRNA enjeksiyon önce tutmak defolliculated aktarın.</li>
		<li>Ertesi gün, bir dürbün, bir açık ve farklı hayvan karşı bitkisel pole (hayvan pole karşı açık sarı için bitkisel pole için koyu kahverengi) sunan bir sağlıklı yumurta altında seçin. Temiz Pasteur pipetler kullanın ve yumurtalar teker teker steril konik 96-enjeksiyon iyi tabak atın. Not: Özel bir bakıma mRNA enjeksiyonlar için yumurta yerleşimini gereklidir; Oysa cDNA enjeksiyonlar için yumurta ile hayvan yukarı bakacak şekilde Kutbu yönlendirmek için vazgeçilmezdir.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA veya cDNA otomatik enjeksiyon
	<ol>
<li>Önerilen yönergeleri izleyerek bir ticari olarak mevcut kit kullanarak mRNA'ların sentez. Aletleri ve tablo RNase ile temiz ve uygun koruyucu eldiven giymek. Not: İyi bir ifade vermeye belirleyici kalitesidir mRNA ve enjeksiyon işlemi sırasında mRNA yıkımı önlemek için vazgeçilmezdir.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNAs hazırlamak ve istediğiniz miktarı 0,2 µg/µL bir konsantrasyon, bidistilled suda çözülür.</li>
		<li>10-50 nL 0.2 µg/µL veya 10 nL cDNA çözüm 0,02 – 0,2 değişen bir konsantrasyon, konsantrasyon, mRNA çözümün enjekte µg/µL, tercihen 95 yumurta gruplar halinde.</li>
		<li>Membran için gerektiren birden çok alt birimleri (yani, heteromeric α1β2γ2 GABAA reseptörleri), protein karışımı karşılık gelen mRNA'ların veya istenen oranında cDNAs (yani, 1:1:1 veya 1:10:1).</li>
		<li>Oosit 17 ° c Isı şok proteinleri ifade tarafından yumurta önlemek için tutmak; Mikroplaka ısı kontrollü depolama alanında depolar.</li>
		<li>0.1-1000 adlı OR2 bağlama tahlil pozitif test edildi test bileşikleri dağıtılması µM elektrofizyolojik kayıtlar için ve onları bir 96-şey düz dipli Polipropilen tabak içinde atmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazmid ifade için
	<ol>
<li>Kılavuzlarına bakteriyel T7 veya T6 promotors ile mRNA sentezi için piyasada kitleri izleyin ve bir çözüm 20 µL 0,2 µg/RNase free suda µL olun.</li>
		<li>En az 20 µL cDNA ifade 0.2 µg/µL bidistilled suda, genellikle ökaryot ifade vektör içeren bir çözüm hazırlamak.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroenjeksiyon oosit ve görsel kalite olarak
	<ol>
<li>10-50 nL plazmid içeren çözüm enjekte (bkz. Adım 2.3.1 veya 2.3.2) cam mikro-enjeksiyon iğne 100 µm arasında değişen bir uç çapı ile oluşturulmuş bir basınç Fırlatma sistemi ya bir otomatik enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir micromanipulator üzerinde. Not: burada açıklanan örnekte, toplu halde 95 cDNA veya mRNA ile kullanıma uygun otomatik bir sistem ile yumurtalar enjekte edilir.</li>
		<li>Enjeksiyon iğne 1 µL % 1 metilen mavisi gibi bir boya ile doldurun ve standart prosedür (cDNA için çekirdek veya mRNA için sitoplazmada) kullanarak yumurta enjekte.</li>
		<li>Yaklaşık 1 dakika kaynar suda için enjekte yumurta atın. Yumurtalar bir dürbün altında bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm. Not: Boya Şekil 3'Eenjeksiyon hassas bir gözlem izin, gösterildiği gibi lokalize kalır.</li>
	</ol></li>
	<li>İki elektrot gerilimi kelepçe kayıtları
	<ol>
<li>Şekil 4' te gösterilen prensibi kullanır otomatik sistem üzerinde yumurta içeren iyi tabak koyun. Not: Şekil 5' te gösterilen yama kelepçe sistemi aksine, hücre gerçek membran potansiyelini gerilim elektrot tarafından okunur.</li>
		<li>Örneğin, Şekil 6 ' da konsantrasyon etkinlik ilişkisi tayini için resimli düzenine sahip simge tabanlı arabirimi kullanılarak otomatik kayıt sistemi programınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Eğri uydurma
	<ol>
<li>Resimli konsantrasyon harekete geçirmek eğrisi kullanarak uygun yazılımı kullanarak sonuçları analiz, geçerli genlik agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak arsa.</li>
		<li>Daha sonra formu ampirik Hill denklemde ile donatılmış olabilir sigmoidal eğri uyun: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Burada, Yuyarılmış akım, kısmını = EC P 50 harekete geçirmek için konsantrasyon = x = bileşik toplama nH = Hill katsayısı veya belirgin cooperativity.</li>
		<li>Bir birlik akımları hücreler bir dizi elde edilen verileri çözümlemek için en yüksek konsantrasyonu, değeri kaydedilen her yanıt karşı genliği bölerek normalize.</li>
		<li>Ortalama ve standart hataları belirlemek ve size mevcut yazılım kullanarak eğri uydurma farkındayız.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofizyolojik kayıtlar Beyin dilimleri
Not: Hipokampal sıçan dilimleri ulusal ve kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak hazırlanır.
<ol><li>
Hippocampus dilimleri hazırlanması
	<ol>
<li>Diseksiyon yapay beyin-omurilik sıvısı (dACSF) 124 mM NaCl 124, 2.5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glikoz ve 4 mM ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe benzin saccharose.</li>
		<li>Kayıt yapay beyin-omurilik sıvısı (rACSF) 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3ve 10 mM glikoz ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe zehirledi.</li>
		<li>% 2.5 isoflurane ve saf oksijen karışımı kullanarak fareler anestezi ve onları başını kesmek.</li>
		<li>Orta hat makas güzel bir ikili ile takip kafa derisi kesilmiş. Kafatasının orta çizgi boyunca temel doku zarar vermeden kes. Cımbızla kafatasını ve beyin kepçe için iyi bir spatula kullanın.</li>
		<li>Gazla dACSF çözüm RT, beyin koyun ve sol hipokampal oluşumu iyi bir spatula ile incelemek.</li>
		<li>Enine dilimler (400 µm kalınlığında) hipokampüs orta kısmından bir doku helikopter ile kesin ve kayıt odasına bir boyama fırça kullanımı ile aktarabilirsiniz. RT, dilimler için 45 dk korumak.</li>
		<li>Dilimleri ile 35 ° c gassed rACSF sıvı ve 1,5 mL/dk. hızında % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile çözüm kabarcık. Not: Bu adımdan sonra dilimler elektrofizyolojik deneyler için hazır olur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tek nüfus spike kayıt
	<ol>
<li>Bir beyin dilim mikroskop monte edilmiş odanın içine yerleştirin.</li>
		<li>3 mL/dk ile rACSF oranında dilim sıvı.</li>
		<li>Borosilikat cam micropipette direnci ~ 2 MΩ sahip pipet çektirme ile çek. Not: Bu micropipette kayıt elektrot kullanılır ve elektrikle amplifikatör için bağlı.</li>
		<li>Micropipette 2 M NaCl içeren bir çözüm ile doldurun ve amplifikatör pipet yuvasına yerleştirin.</li>
		<li>Kayıt micropipette doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki stratum pyramidale yerleştirin. Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir.</li>
		<li>Bir yalıtılmış bipolar platin/iridyum Elektrot tutucu sol micromanipulator üzerine yerleştirin. Not: Bu elektrot uyarılması elektrot kullanılır ve uyarıcı jeneratörü elektrikle bağlı.</li>
		<li>Stimülasyon elektrot Schaffer de¤erler doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki yerleştirin. Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir.</li>
		<li>Geçerli nabzı uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı stimülasyon elektrot her 30 teslim s (100 µs süreleri 10 µA başlayarak) ve bir nüfus artışı (PS) görünene kadar yavaş yavaş stimülasyon gücünü artırmak.</li>
		<li>Elde edilebilir en yüksek genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın. PSs 2.4 KHz filtre ve 20 KHz sinyal amplifikatör kullanarak sayısallaştırılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çifte darbe inhibisyon
	<ol>
<li>Beyin dilimleri (adım 3.1) hazırlamak ve daha önce açıklandığı gibi devam edin (adımları 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>İki geçerli bakliyat (100 µs süreleri 20 ms aralığında) stimülasyon elektrot için her 30 teslim uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı s. Maksimum genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test bileşik
	<ol>
<li>Dilutions benzin ACSF test edilecek bileşiklerin yapmak böylece DMSO değil 0,1 daha yüksek son konsantrasyonu.</li>
		<li>DMSO bileşik çözüm daha aynı konsantrasyonu, kontrol çözümü ekleyin.</li>
		<li>(Adım 3.2) tek bir kayıt veya eşleştirilmiş-darbe (adım 3.3) PS Schaffer teminat elektrodlar tarafından uyarılmış her 30 s en az 30 dk için. PS şekli bu temel dönemde kararlı olmalıdır.</li>
		<li>Bir ölçek ile benzin rACSF test edilmesi için bahçedeki sabit bir konsantrasyon içeren hazır olun.</li>
		<li>Bu çözümle hipokampal dilim hala tek veya eşleştirilmiş-nabız PS kaydederken sıvı</li>
		<li>Bileşik etkisi kurtarma gazla rACSF bileşik olmadan dilimle ventriküler tarafından değerlendirmek. Not: geri dönüşümlü etkileri için PS bileşik uygulamadan temel dönemde gözlenen ilk şekli döner.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Ortalama PS izlemeler sırasında 4 veri analiz yazılımı kullanarak bloklarını deneyde kaydetti.</li>
		<li>Ortalama izlemeler PS genlikleri ölçmek.</li>
		<li>10 dk bir bileşik ventriküler daha önce kaydedilen temel değerler yüzdesi olarak genlikleri normalleştirmek.</li>
		<li>± Sem demek gibi verileri hızlı</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7568326">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19090692">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li>
<li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7516126">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li>
<li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinities%2C+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists%2C+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li>
<li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li>
<li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18936916">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li>
<li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor-mediated+neurotransmission%3A+Not+so+simple+after+all%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li>
<li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li>
<li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23308109">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323(2013).</li>
<li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li>
<li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11282419">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li>
<li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+channels%3A+from+subunits+to+functional+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li>
<li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li>
<li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).</li>
<li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li>
<li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="https://dokupdf.com/download/isoflurane-slows-inactivation-kinetics-of-rat-recombinant-122l-gabaa-receptors-enhancement-of-gabaergic-transmission-despite-an-open-channel-block-_5a034a51d64ab2b9bdf8bbd0_pdf">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li>
<li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17(2004).</li>
</ol>

Yazarlar Frédéric Knoflach ve Maria-Clemencia Hernandez, F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, İsviçre, bir ilaç şirketi çalışanlardır. Yazar Daniel Bertrand HiQScreen Sàrl 6, rte bir çalışandır de ilaç firmaları için tarama imkanları sağlayan Compois, 1222 Vésenaz Cenevre, İsviçre,.

Geliştirme roman bileşiklerin etkin bir ligand kapılı iyon kanalA GABA reseptörleri gibi birden fazla yaklaşımları kullanımını gerektirir. Genellikle, ilk adım genellikle bağlama deneyleri kullanarak yapılır; Ancak, bu tür ölçümleri bileşik veya onun hassas Farmakoloji fizyolojik etkinlik derecesinin yetersizdir. Özellikle, bir takımı bağlar bir bileşik geliştirmek veya işlevi inhibe veya bile (sessiz olmak) fonksiyonel etkisi üretmek (yani, onun işlevini değiştirme olmadan reseptör bağlamak). Böylece, fonksiyonel test tam bileşik bir karakterizasyonu için gereklidir.
Deneyleri bağlama: Bağlama tahlil büyük avantajı bu verimli bir şekilde örnekleri birkaç bin kadar değişen sayıda yapılabilir olduğunu ve etkin moleküller için bağlama affinities sağlar olduğunu. Burada açıklandığı gibi ilk adım bir yöntem istenen reseptör alt türlerinden değerlendirmesi için oluşturma oluşur. Yani, bağlama kesirleri veya tüm beyin yerli reseptörleri üzerinde yapılan iken, böyle bir yöntem belirli reseptör alt türlerinden, benzeşim belirlenmesi engeller. Bu, bu nedenle, ekran moleküllere rekombinant sistemleri istenen hedef kullanmak gereklidir. Günümüzde, istenen reseptör alt birim cDNAs hücre hatlarında, geçici veya sabit transfection reseptör alt türleri (Örneğin, GABAA α5β3γ2) ilgi ifade etmek için verimli ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Geleneksel bağlama deneyleri yapmak kullanmak teknikleridir radioligands, ama günümüzde mevcut radyoaktivite (Örneğin, kantitatif floresan tabanlı-ligand taşıması) işleme rahatsızlık kaçının.
Bir ana bilgisayar sistemi işlevsel ifadede: Bir ana bilgisayar sistemindeki genlerin ifade etmek için kodlama dizisi ilgi yeterli promotors içeren bir plazmid eklenmesi gerekir. Genellikle, vitro mRNA sentezi için bakteriyel T7 veya T6 promotors kullanılır. CMV (sitomegalovirüs) veya eşdeğeri gibi ökaryot promotor tarafından cDNA ifade için faiz Gen transkripsiyonu düzenlenmiş olması gerekir. Günümüzde, birkaç plazmid (yani, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, PCI-neo, pcDNA), iki promotors de dahil olmak üzere, kullanılabilir bir vitro sentezi mRNA ya da Şekil 15' te gösterildiği gibi bir cDNA ifade izin vardır. Bir ifade GABAA reseptörlerinin sadakatle hücre hatları veya Xenopus yumurta elde edilebilir. İkinci en önemli avantajları bir endojen reseptör ifade, manipülasyonlar sadeliği ve mikro-enjeksiyon ve kayıtları için otomatik bir sistem kullanılabilirliğini eksikliği vardır. Bu protokol için açıklanan yordamları yaklaşık 7 dakika içinde 96 yumurta enjeksiyon sağlar ve hiçbir embriyolardan beceri gerektirir otomatik sistem etkinliğini göstermektedir. Xenopus tek yumurtalıktan 10.000 – 30.000 yumurtalar arasında içerir hatırlayarak, bu hücre ölçümleri, çok sayıda tek bir hazırlık yapılabilir açıktır. Bir ifade kullanarak cDNA enjeksiyonları yapılabilir gibi Ayrıca, bağlama deneyler için geliştirilen genleri ilgi içeren aynı plazmid ezelî belgili tanımlık lüzum daha da moleküler biyoloji işlevsel bir karakterizasyonu için kullanılabilir manipülasyonlar.
Onun büyüklüğü ve yüksek yüzey anlatım göz önüne alındığında, bir tek yumurta yaklaşık 35 mm Petri kabına konfluent hücrelere eşdeğerdir reseptörleri sayısını verir. Ancak, bir yumurta hazırlık ve enjeksiyon gösteren bir hücre kültürünü maliyetinin bir kısmını deneyler özel bir kültür ortam ve steril manipülasyonlar gerekmez. Bir kaç picoamperes (10-12) tek bir GABAA kanal aktivasyonu verimleri ve ilâ microampere (10-6) onlarca arasında değişen akımlar kolayca birkaç milyonlarca eşlik eden etkinliğini doğruladı bir tek yumurta içinde kaydedilir reseptörleri sırasında tek bir yanıt.
İlk adımda ligand kapılı iyon kanalları karakterizasyonu kez reseptörlerinin belirgin benzeşme belirlenmesidir. Tarihte gerek deneyler bir dizi kısa agonist testi uygulayarak ve genliği uyarılmış geçerli veya belirli durumlarda, agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak (AUC) eğri altındaki alan komplo oluşur. Farklı plazmid konsantrasyonları ve yumurtalar aynı toplu oranı microinject kolayca mümkün olduğu gibi bu sistem ifade böyle bir karakterizasyonu için özellikle uygundur. Ayrıca, bir toplu iş toplu iş karşılaştırma istikrar için farklı EC50s yüksek derecede ortaya koydu. Alt birim kompozisyon reseptör'ın belirgin benzeşme hakkında etkisi kolayca Şekil 10örneği olarak bir örümcek arsa kullanarak görüntülenir.
Xenopus yumurta elde iki elektrot gerilimi kelepçe sonuçlarını sık sık düzeltme eki EKG mandalları kullanılarak yapılan kayıtları ile karşılaştırılır. Bu iki sistem arasında detaylı bir karşılaştırma gitmek bu işin kapsamı ötesinde gitti ise bir kaç puan incelenebilir. Hücrelerde bir yama kelepçe hızlı ilaç uygulaması ile biyofiziksel bir karakterizasyonu için avantajları sunarken, gereksinimleri daha bu iki elektrot kayıtları Xenopus yumurta daha karmaşıktır. Zorluk ilk ve önemsiz olmayan bir hücre kültürü, bir geçici veya sabit transfection gerekliliği ve istenen yapı ifade eden hücreler tanımlaması ile verilen bir protein ifadesidir. Buna ek olarak, kabul hücre endojen ifadede mümkün katkısını incelemek için vazgeçilmezdir. Ayrıca, bir yama kelepçe kayıt o kişi de, örneğin, mühür kalitesini değerlendirmek için deneme sırasında yeterli bir analiz yapmak gerekir iken yüksek büyütme mikroskop altında embriyolardan yapmak yetenekli bir kişi gerektirir, erişim direnç vb aksine, kayıt, özellikle bir elektrofizyolojik otomatik bir sistem kullanarak bir iki elektrot gerilimi kelepçe herhangi bir özel beceri gerektirmez ve Laboratuvar teknisyenleri tarafından yapılabilir.
Elektrofizyolojik bir set-up edinme zaman maliyet dikkate kesinlikle dikkatli bir şekilde çözümlenmesi gereken önemli bir faktördür. Otomatik bir sistem maliyeti nispeten yüksek olmakla birlikte, örneğin, daha yakın bir karşılaştırma yükleme tam elektrofizyolojik teçhizat gibi iyi micromanipulators, bir dürbün lens, bir amplifikatör, bir perfüzyon donanımları satın içerir ortaya çıkarır Sistem ve ayrıca veri alınıyor ve bir çözümlemesini süre bir anti-titreşim tablo. Bir iki elektrot gerilimi kelepçe koymak-yukarıya karşı bir yama kelepçe koymak-yukarıya arasında bir maliyet karşılaştırma daha da farklılıklar ortaya koymaktadır. Ayrıca, otomatik bir sistem tam otomatik ekipman avantajı sunuyor ve gece gündüz katılımsız çalışır.
Bir bileşik farmakolojik özelliklerini yazam├╜yor reseptör, eylem tarafından belirlenir. Örneğin, rekabetçi inhibitörleri aynı bağlama cebinizde veya orthosteric sitesi, girebilirsiniz molekülleri şunlardır agonist kendisi bir yarışma neden olur. Sigara rekabetçi inhibitörleri, girebilir ve iyonik gözenek örneğin engellemek, başka bir sitede ve bir ligand kapılı iyon kanalı durumunda etkileşerek reseptörleri inhibe bileşiklerdir. Etkileşim farklı mekanizmaları incelemek için bu işin kapsamı gitmek istiyorum, ama daha fazla bilgi farmakolojik bir ders kitabından ve/veya Bertrand ve Bertrand'ın22gibi diğer işten elde edilebilir.
Allosteric modülatörler söz konusu olduğunda, orthosteric sitesi, ama durum molekülün farklı bir sitede bileşik bağlar enerji bariyeri aktif ve diğer devletler arasında değiştirir. Pozitif allosteric modülatörler (PAMs) enerji bariyeri etkin duruma dinlenme--dan azaltmak bileşiklerdir ve bu nedenle, agonist etkisini artırmak. Olası PAM etkileri tanımlamak için bu, bu nedenle, Eğer bileşik bir maruz agonist yanıtı geliştirir ve eğer öyleyse, hangi konsantrasyon de belirlemek gereklidir. Şekil 11 ve Şekil 14 sunulan deneyler başarıyla GABAA reseptörleri, PAMs karakterizasyonu için kullanılabilir protokolleri göstermektedir.
Bazı durumlarda, tek başına PAM maruz reseptörleri etkinleştirmek yeterli olabilir. Bu tür etkinlikler burada sunulan Deneysel protokol hafif bir değişiklik tarafından belirlenebilir. Yani, modülatör ortak bir uygulama GABA maruz sırasında kullanmak yerine, protokol ilk uygulama için tek başına ve sonra huzurunda GABA bileşik değiştirilebilir. Doğrudan agonist etkinlik karakterizasyonu bileşik tarafından uyarılmış ve GABA uyarılmış geçerli karşılaştırıldığında yanıt genliği tespiti yapılacak.
Şekil 7' de gösterildiği gibi beyin dilimler halinde yapılan deneylerde daha fazla hayvan modellerinde ve klinik karşı yol boyunca gitmeden önce kesin bir inhibitör devre yerel reseptörleri, bileşik faaliyet onaylamak için kullanılır. Nispeten basit veri kayıt ve analiz Protokolü PS genlik fark düzenleyici etkileri değerlendirilerek birden çok bileşikleri sıralamasını sağlar. GABA sisteme ilgili olmayan bileşikler spesifik olmayan etkileri (PS şekil değişiklikleri gözlendiğinde algılananÖrneğin) de kullanabilirsiniz. Doğrudan, GABAergic neurotransmission bu gibi durumlarda bütün hücreli yama klemp tekniği8kullanarak inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir.

Burada, aktif bileşikler keşfi için protokolleri GABAA reseptörleri Fizyoloji ve farmakoloji bağlama mevcut. Ara roman molekülleri GABAA reseptörleri için belirli, burası tanımlamak için çok önemli, kesin olarak mümkün, alt türü faiz ve özgüllük yeni tanımlanan bileşiklerin değerlendirilmesi (Örneğin, incelenmek üzere, Rudolph görmek ve Knoflach1veya Sieghart2). İlaç keşif ve ulaşılması gereken adımları tipik bir yoldaki Şekil 1' de gösterilmiştir.
Bağlama deneyleri olmuştur ve hala büyük ölçüde ilaç keşfi ilk aşama olarak kullanılır. GABAA reseptörleri söz konusu olduğunda, onlar nerede uyuşturucu tedavi amaçlı yararlı ve güvenli bağlamak benzodiazepin bağlama siteye reseptör bağlamak bileşenleri tanımlamak için optimize edilmiştir. Fluorometrik görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) membran potansiyeli kırmızı boya tabanlı deneyleri3, kullanarak diğer teknikleri, bileşiklerin onların istenmeyen yan etki profili nedeniyle daha az tercih başka sitelere bağlamak barbitüratlar gibi algılamak. Buna ek olarak, kullanılan boyar maddeler doğrudan GABAA reseptörleri, böylece bu deneyleri ilaç bulma4için yarar sorgulama etkinleştirebilirsiniz. Deneyleri bağlama yalnızca belirli bir bileşik belirli reseptör sınıfbağlayabilirsiniz kanıt sağlayabilir. İn vitro deneyleri ile hücre zarlarında seçici insan GABAA α5β3γ2 reseptör ligandlar tanımlamak için kullanılır. İnsan GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ve α3β3γ2 reseptörleri ifade geçici transfected HEK293 hücre zarlarında bu deneyleri için hazırlamak için kullanılır. Ligandlar etkisini membran reseptörleri ([3H] flumazenil bağlama bir inhibisyonu) bağlı [3H] flumazenil mercek ölçerek algılanır. Bu teknik büyük avantajı bileşik bağlama benzeşme reseptör ilgi, hızlı ve verimli belirlenmesi faiz reseptör sağlanan olduğunu.
Fonksiyonel çalışmalar bileşiklerin fonksiyonel etkinlik değerlendirmek ve fizyolojik ve farmakolojik bir açıklama reseptörleri bileşiklerin bağlama neden mekanizmaları teklif etmek gereklidir. Bugün, fonksiyonelA GABA reseptörleri pseudosymmetry iyonik gözenek ve derlemesinden sonucu beş özdeş alt birimleri tarafından kurulmuş bir eksen çevresinde beş alt birimleri Meclisi sonucu İyi tanınan biridir. GABAA reseptörleri çoğu iki veya daha fazla farklı alt birimleri oluşur. Büyük beyin GABAA reseptör, örneğin, bir stoichiometry 2, 2 ve 1 α1, B2 ve γ2 altbirimden sırasıyla oluşan5,6. Xenopus yumurta veya HEK293 hücreleri gibi bir ana bilgisayar sistemi rekonstitüsyon hızla reseptörlerinin farmakolojik özellikleri keşfetme imkanı sunuyor.
Bileşiklerin farmakolojik özellikleri sonra beyin dilimleri7ekstraselüler kayıtları ile incelenmiştir. Bu yöntem bileşikleri etkisi neurotransmission bir keşif ve kapaklı ifade sistemlerinde yerel reseptörleri genel düzeyde belirlenen bileşikler fonksiyonel etkileri onaylamak için etkili bir yol sağlar nöronal ortamı. GABAergic neurotransmission Ayrıca moleküler düzeyde inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs)8bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir. Ama burada kullanılan ve bütün hücreli yama kelepçe kayıtları Beyin dilimleri içinde temel protokolü daha ayrıntılı ve daha düşük işlem hacmi verim.
Son olarak, güçlü ve zayıf yönlerini α5β3γ2 seçici ligandlar tanımlanması için kullanılan cascade eleme vitro farklı teknikleri ve içsel sınırlamaları perspektif içinde ele alınmıştır. Bu eser uzman ve farklı vitro yaklaşımlar ile birlikte yararlı bir daha gözden geçirme bu ligand kapılı iyon kanalları yeni modülatörler keşfi mücadele için kullanılanA GABA reseptörlerinin alanında uzman sağlamalıdır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Genel ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu hücre biçerdöver -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>Bağlı radyoligand ile membranları filtrelemek için Mikrotitre</td></tr><tr><td>plakası sıvı sintilasyon sayacı (Top Count NXT)</td><td>Packard</td><td></td><td>Microplate Sintilasyon ve Lüminesans sayacı</td></tr><tr><td>Flakon sıvı sintilasyon sayacı (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>Flakon Sintilasyon ve Lüminesans sayacı</td></tr><tr><td>Sıvı&nbsp; işleyici (Biomek 2000)</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>Bileşik dilüsyonları hazırlamak için</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>Bileşik stok çözeltilerini karıştırmak için</td></tr><tr><td>Doku homojenizatörü (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>Membran preparatlarını yeniden süspanse etmek için</td></tr><tr><td>XLfit5 yazılımı</td><td>Microsoft Excel &nbsp; IDBS</td><td></td> eklentisi <td>Eğri uydurma yazılımı</td></tr><tr><td>Akıllı Çekme</td><td>UniPix-Elektrot</td><td></td> <td>Çektirme</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>Çok Kanallı</td> <td>Sistemler-Otomatik</td> <td>Enjeksiyon (Xenopus Oositler)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>Çok Kanallı</td> <td>Sistemler-Otomatik</td> <td>Voltaj Kelepçesi (Xenopus Ooositler)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>Çok Kanallı</td> <td>Sistemler-Veri</td> Madenciliği <td> Analiz Yazılımı</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>Çok Kanallı</td> <td>Sistemler-Veri</td> <td>İşleme Yazılımı</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Düşük gürültülü veri toplama sistemi</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 veya eşdeğeri</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programlanabilir Sinyal Düzenleyici</td></tr><tr><td>pClamp program paketi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Veri toplama ve analizi için yazılım Yazılım</td></tr><tr><td>Antivibrasyon masası&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>Mikroelektrot titreşimlerini önlemek için&nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Mikromanipülatörleri</td><td>Scientifica</td><td></td><td>Mikroelektrotları beyin dilimlerine doğru bir şekilde yerleştirmek için</td></tr><tr><td>Faraday Kafesi&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Kayıtları gürültüden izole etmek için</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp;</td><td></td><td>Beyin dilimleri hazırlamak için</td></tr><tr><td>Borosilikat cam mikropipet&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>Beyin dilimlerinde hücre dışı potansiyelleri kaydetmek için</td></tr><tr><td>Bükümlü çift, platin iridyum teller stimülasyon elektrodu</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td></td><td>Beyin dilimlerini akımla uyarmak</td></tr><tr><td>için Akım ve voltaj tahrikli stimülasyon için uyaran üreteci</td><td>Çok Kanallı Sistemler</td><td>STG4000</td><td>Akımı stimülasyon elektroduna iletir</td></tr><tr><td>< güçlü > Plasticware< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikrotitre plakası yuvarlak alt</td><td>Corning</td> <td># 3365</td><td>Bağlama tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>GF / C cam elyaf filtre tabanı 1.2 & mikro ile 96 oyuklu mikroplaka; m gözenek, vakum manifoldu kullanarak hücre toplama tahlilleri içinkuyu filtresi&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td># 6005174</td> bağlama <td>testi için kullanılan</td></tr><tr><td>50 mL Tüpler</td><td>Falcon&nbsp;</td><td># 352070</td><td>bağlama testi için kullanılır</td></tr><tr><td>Güvenli kilitli tüpler 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td> <td># 0030 120086</td><td>bağlama testi için kullanılır</td></tr><tr><td>Güvenli kilitleme tüpleri 2 mL</td><td>Eppendorf</td> <td># 0030 120094</td><td>bağlama testi için kullanılır</td></tr><tr><td>Nakliye tüpleri 180 mL & nbsp;</td><td>Semadeni Avrupa AG&nbsp;</td><td># 3722</td><td>bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>Midilli şişesi Polietilen 6 mL&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td># 6013329</td><td>bağlama testi için kullanılır</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td># 60051859</td><td>bağlama tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&nbsp; Kuyu Plakası (Konik)</td> <td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Oositler için enjeksiyon plakası</td></tr><tr><td>96&nbsp; Kuyu Plakası (Düz tabanlı)</td><td>Corning (Vitaris İsviçre)</td><td>HiClamp Cam kılcal damar için</td> <td>3364-cor</td> Bileşik Plaka</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hilgenberg (Almanya)</td><td>-</td><td>borosilikat cam 1.2 OD 0.76 ID, filament</td></tr><tr><td><güçlü>RNA hazırlığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>için in vitro sentezi için</td></tr><tr><td>Kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tahlil tamponu: KCl 5 mM; CaCl<alt>2</alt> 1.25 mM; MgCl<alt>2</alt> 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH, HCl ile 7.4'e ayarlanır; 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.</td><td></td><td></td><td>Bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>Yıkama tamponu: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; 4 ° C'de saklayın.</td><td></td><td></td><td>Bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>DMSO'da 10 mM test bileşiklerinin stok çözeltisi DMSO'da</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) DMSO'da</td><td></td><td></td> 10 mM <td>Bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>DMSO'da</td><td></td><td></td> Diazepam 4 mM <td>Bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr> <tr><td>[3H] -Flumazenil 60-85 T�/ mmol Etanolde kullanılır; -20 °C'de saklayın; C</td><td></td><td></td><td>Bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Ultima Gold bağlayıcı tahlil için kullanılır</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td># 6013329</td><td>Bağlanma testi için kullanılır</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB /</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibiyotikler / antimikotikler</td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Kollajenaz Tip I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Yapay beyin omurilik sıvısı için tuzlar (NaCl, KCl, vb.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Membranlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farklı insan GABAA reseptör alt tiplerini aşırı eksprese eden geçici veya stabil şekilde transfekte edilmiş HEK293'ten donmuş membran preparatları: &alfa; 1 ve beta; 3&gama; 2, & 2 ve beta; 3&gama; 2, & 3 ve beta; 3&gama; 2, & 5&beta; 3&gama;2. Ayrıntılı yöntemler için Ballard et al. 2009'a bakınız.</td><td></td><td></td><td>Bağlanma tahlili için kullanılır</td></tr></tbody></table>

bir neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Adım adım bir protokol filtreleme için gama-aminobütirik maddeler ve birleşimler bu el yazması hediye asit yazın (GABAA) reseptörleri ve kimliği roman moleküller preklinik deneyleri bir vitro rekombinant üzerinden aktif doğru kullanımı farmakolojik etkileri kemirgen beyin dilimleri yerel reseptörleri, takımı. Reseptör benzodiazepin sitesinde bağlayıcı bileşikler için radioligand bağlama deneyleri hücre zarlarında büyük GABAA alt türlerini ifade üzerinde geliştirme oluşur bir birincil ekranı ayarlamak için ilk adımdır. O zaman, kemirgen ve insan GABAA reseptörleri Xenopus yumurta veya HEK 293 hücreleri Contegra ifade yararlanarak, elektrofizyolojik deneyleri içinde farklı reseptör fizyolojik özelliklerini keşfetmeye mümkün mü alt türlerini ve tanımlanan bileşiklerin farmakolojik özellikleri. Xenopus oosit sistemi burada, yumurta ve onların mikroenjeksiyon ile iki elektrot gerilimi kelepçeler kullanılarak farmakolojik karakterizasyonu kadar farklı mRNA izolasyonu ile başlayan sunulacaktır. Son olarak, kemirgen beyin dilimler halinde yapılan kayıtları ikincil bir fizyolojik test etkinliği iyi tanımlanmış bir nöronal devre onların yerli reseptörleri, moleküllerin değerlendirmek için kullanılan açıklanacaktır. Hücre dışı kayıtları birden çok nöron nüfus yanıt-e doğru kullanma içinde ilaç uygulama ile birlikte gösterilen.

Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Bu videonun genel amacı, yeni GABA-A reseptör ligandlarının keşfine izin veren bir tarama kaskadını göstermektir. Ksenopus oositlerinde ve kemirgen beyin dilimlerinde radyoligand bağlanması, elektrofizyolojik kayıt yapmanın avantajı, bileşiğin profilinin iyileştirilebilmesidir. Sonuçta, güçlü alt tip, seçici ve etkili bileşikler tanımlanır.Bu gösteri Kumico Kambara ve Jenna Tognaccini'nin yanı sıra HiQScreen'den Sonia ve Daniel Bertrand ve Roche'dan Marie Claire Pflimlin tarafından gerçekleştirilecek. Bir basınç fırlatma sistemi veya otomatik bir enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş, uç çapı 100 mikrometreye kadar değişen bir cam mikroenjeksiyon iğnesi kullanarak plazmit içeren çözeltinin 10 ila 50 nanolitresini enjekte edin. Bu işleme başlamak için, ısı şoku proteinlerinin ekspresyonunu önlemek için oositleri 17 santigrat derecede tutun.Mikroplakayı termal kontrollü bir saklama alanında saklayın. Daha sonra, OR2'deki bağlanma testinde pozitif test edilen test bileşiklerini, elektrofizyolojik kayıtlar için 0.1 ve 1000 mikromolar sıcaklıkta çözün ve bunları 96 oyuklu düz tabanlı bir polipropilen plakaya atın. İki elektrot voltajı kelepçesi kaydı yapmak için, otomatik sisteme oositleri içeren bir plaka yerleştirin.Konsantrasyon aktivitesi ilişkisinin uygun şekilde belirlenmesi için bu şema ile simge tabanlı arayüzü kullanarak otomatik kayıt sistemini programlayın. Eğri uydurma için, gösterilen konsantrasyon aktivasyon eğrisini kullanarak, mevcut genliği agonist konsantrasyonunun logaritmasının bir fonksiyonu olarak çizin. Elektrofizyolojik kayıt için beyni oda sıcaklığında karbojen ile köpürtülmüş dACSF solüsyonunda tutun.Ardından, sol hipokampal oluşumu ince bir spatula ile inceleyin. Daha sonra, bir doku kıyıcı ile hipokampusun medyan kısmından 400 mikrometre kalınlığında enine kesit slaytları. Bir boyama fırçası kullanarak dilimleri kayıt odasına aktarın ve 45 dakika oda sıcaklığında tutun.Daha sonra, dilimleri 35 santigrat derecede ve dakikada 1,5 mililitre hızında karbojen ile köpürtülmüş rACSF ile perfüze edin. Tek bir popülasyon artışını kaydetmek için, mikroskoba monte edilmiş odaya bir beyin dilimi yerleştirin. Dilimi rACSF ile dakikada üç mililitre oranında perfüze edin.Pipet çekiciyi kullanarak, yaklaşık iki megaohm dirençli bir borosilikat cam mikropipet çekin. Mikropipeti iki molar sodyum klorür içeren bir çözelti ile doldurun ve pipet tutucusuna yerleştirin. Doğru mikromanipülatörü kullanarak kayıt mikropipetini hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki stratum pyramidale'ye yerleştirin.Daha sonra, sol mikromanipülatördeki tutucuya yalıtılmış bir bipolar platin iridyum elektrot yerleştirin. Sol mikromanipülatörü kullanarak stimülasyon elektrodunu hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki Schaffer teminatlarına yerleştirin. Uyaran üretecini kullanarak, her 30 saniyede bir stimülasyon elektroduna bir akım darbesi verin ve bir popülasyon artışı görünene kadar stimülasyon gücünü kademeli olarak artırın.Uyaran gücünü, elde edilebilecek maksimum genliğin %45'ine karşılık gelen bir popülasyon artışını uyandıracak şekilde ayarlayın. Eşleştirilmiş darbe inhibisyonu gerçekleştirmek için, uyaran üretecini kullanarak her 30 saniyede bir stimülasyon elektroduna iki akım darbesi verin. Uyaran gücünü, maksimum genliğin %45'ine karşılık gelen bir popülasyon artışını uyandıracak şekilde ayarlayın.Bileşikleri test etmek için, ACSF'de test edilecek bileşiklerin seyreltmelerini yapın, böylece DMSO'nun nihai konsantrasyonu %0.1'den yüksek olmaz Kontrol çözeltisine, bileşik çözeltisindekiyle aynı konsantrasyonda DMSO ekleyin. En az 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir Schaffer kollateral stimülasyonları tarafından uyandırılan tek veya eşleştirilmiş bir nabız popülasyonu artışını kaydedin. Popülasyon ani artış şekli bu temel dönemde sabit olmalıdır.Daha sonra, test edilecek bileşiğin sabit bir konsantrasyonunu içeren karbojene rACSF içeren bir beher hazırlayın ve tek veya eşleştirilmiş nabız popülasyonu sivri uçlarının kaydedilmesi sırasında hipokampal dilimi çözelti ile perfüze edin. Ayrıca, dilimi bileşik olmadan karbojene rACSF ile perfüze ederek bileşik etkisinden geri kazanımı değerlendirin. Burada, CA1 piramidal nöronlarının dendritik arborizasyonuna çıkıntı yapan CA3 piramidal hücre aksonlarından kaynaklanan Schaffer teminatları olan bir sıçan hipokampal diliminin şematik bir temsili gösterilmektedir.Mikropipetler, popülasyon artışlarını kaydetmek için stratum pyramidale'ye ve alan uyarıcı postsinaptik potansiyellerin dendritik kayıtları için stratum radiatum'a yerleştirildi. Stimülasyon elektrodu Schaffer teminatlarının içine yerleştirildi. Bu şekil, 20 milisaniyelik bir aralıkta aynı uyarıcı elektrot aracılığıyla uygulanan eşleştirilmiş uyaranlar tarafından uyandırılan popülasyon artışlarını göstermektedir.İkinci uyarana verilen popülasyon tepkisi, ilk uyarana verilen yanıttan daha küçük genliktedir. Seçici olmayan bir GABA A reseptörü NAM olan beta CCM'nin yokluğunda ve varlığında popülasyon artışları kaydedildi. Beta CCM, herhangi bir ileri beslemeli gabaerjik inhibisyonu kısmen bloke ederek ikinci popülasyon artışının genliğini arttırdı.Bu prosedürü takiben, tanımlanan bileşiklerin klinik gelişim potansiyeli gibi ek soruları yanıtlamak için farmakokinetik, reseptör doluluğu ve etkinliği in vivo ve güvenlik farmakolojisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

Ontojenliği sırasında inhibitör GABA'erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade A Reseptörler

NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi 'nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Bu yöntem, akut beyin dilimleri kullanılarak endojen monoamin salınımının tespiti için basit bir teknik sunar. Kurulum, monoamin salınımı için bir doku tutucu içeren 48 kuyulu bir plaka kullanır. Serbest bırakılan monoamin, elektrokimyasal algılama ile birlikte HPLC tarafından analiz edilir. Ek olarak, bu teknik ilaç keşfi için bir tarama yöntemi sağlar.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Protokol, fonksiyonel transmembran tropomiyozin kinaz reseptörü B proteinlerini içeren immobilize hücre zarı fragmanları ile hücre zarı afinite kromatografisi (CMAC) kolonlarının hazırlanmasını açıklar. CMAC kolonlarının, bu reseptörlerle etkileşime giren ve karmaşık doğal karışımlarda bulunan özel bitki metabolitlerinin tanımlanmasında kullanımı da açıklanmaktadır.

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Protokol, sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerine mikrotransplantasyonunu gerçekleştirerek, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit ve γ-aminobütirik asit reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını kaydetmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Fonksiyonel Çalışmalar için İnsan Sinaptik Reseptörlerini Yeniden Aktive Etmek için Sinaptik Membranların Mikrotransplantasyonu

BS3 kimyasal çapraz bağlama testi, kronik psikososyal stres koşulları altında fare beyinlerinde azalmış hücre yüzeyi GABAA reseptör ekspresyonunu ortaya koymaktadır.

BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABAA Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Burada, insan γ-sekretazı yeniden yapılandıran bir maya sistemini tarif ediyoruz. Bu sistem, aktiviteyi etkileyen mutasyonların tanımlanmasına ve incelenmesine ve γ-sekretaz inhibitörlerinin (GSI'ler) taranmasına izin verir. Ailesel Alzheimer hastalığı mutantlarının fonksiyon kaybı özelliklerini kullanarak, γ-sekretaz modülatörlerini (GSM'ler) taramak mümkündür.

Saccharomyces cerevisiae Amiloid Beta Üretimini Etkileyen Genleri, Mutasyonları ve Kimyasalları γ-Sekretaz ile Taramak için Alzheimer Hastalığı Modelleri

Keşfedin GABA A reseptör ligandlarının keşfi için radyoligand bağlanma ve elektrofizyolojik kayıt yöntemlerini. Xenopus oositleri ve kemirgen beyin dilimleri kullanılarak selektif bileşiklerin tanımlanması sağlanır.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

Daha fazla video keşfet