Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

Bu videonun genel amacı, yeni GABA-A reseptör ligandlarının keşfine izin veren bir tarama kaskadını göstermektir. Ksenopus oositlerinde ve kemirgen beyin dilimlerinde radyoligand bağlanması, elektrofizyolojik kayıt yapmanın avantajı, bileşiğin profilinin iyileştirilebilmesidir. Sonuçta, güçlü alt tip, seçici ve etkili bileşikler tanımlanır.

Bu gösteri Kumico Kambara ve Jenna Tognaccini'nin yanı sıra HiQScreen'den Sonia ve Daniel Bertrand ve Roche'dan Marie Claire Pflimlin tarafından gerçekleştirilecek. Bir basınç fırlatma sistemi veya otomatik bir enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş, uç çapı 100 mikrometreye kadar değişen bir cam mikroenjeksiyon iğnesi kullanarak plazmit içeren çözeltinin 10 ila 50 nanolitresini enjekte edin. Bu işleme başlamak için, ısı şoku proteinlerinin ekspresyonunu önlemek için oositleri 17 santigrat derecede tutun.

Mikroplakayı termal kontrollü bir saklama alanında saklayın. Daha sonra, OR2'deki bağlanma testinde pozitif test edilen test bileşiklerini, elektrofizyolojik kayıtlar için 0.1 ve 1000 mikromolar sıcaklıkta çözün ve bunları 96 oyuklu düz tabanlı bir polipropilen plakaya atın. İki elektrot voltajı kelepçesi kaydı yapmak için, otomatik sisteme oositleri içeren bir plaka yerleştirin.

Konsantrasyon aktivitesi ilişkisinin uygun şekilde belirlenmesi için bu şema ile simge tabanlı arayüzü kullanarak otomatik kayıt sistemini programlayın. Eğri uydurma için, gösterilen konsantrasyon aktivasyon eğrisini kullanarak, mevcut genliği agonist konsantrasyonunun logaritmasının bir fonksiyonu olarak çizin. Elektrofizyolojik kayıt için beyni oda sıcaklığında karbojen ile köpürtülmüş dACSF solüsyonunda tutun.

Ardından, sol hipokampal oluşumu ince bir spatula ile inceleyin. Daha sonra, bir doku kıyıcı ile hipokampusun medyan kısmından 400 mikrometre kalınlığında enine kesit slaytları. Bir boyama fırçası kullanarak dilimleri kayıt odasına aktarın ve 45 dakika oda sıcaklığında tutun.

Daha sonra, dilimleri 35 santigrat derecede ve dakikada 1,5 mililitre hızında karbojen ile köpürtülmüş rACSF ile perfüze edin. Tek bir popülasyon artışını kaydetmek için, mikroskoba monte edilmiş odaya bir beyin dilimi yerleştirin. Dilimi rACSF ile dakikada üç mililitre oranında perfüze edin.

Pipet çekiciyi kullanarak, yaklaşık iki megaohm dirençli bir borosilikat cam mikropipet çekin. Mikropipeti iki molar sodyum klorür içeren bir çözelti ile doldurun ve pipet tutucusuna yerleştirin. Doğru mikromanipülatörü kullanarak kayıt mikropipetini hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki stratum pyramidale'ye yerleştirin.

Daha sonra, sol mikromanipülatördeki tutucuya yalıtılmış bir bipolar platin iridyum elektrot yerleştirin. Sol mikromanipülatörü kullanarak stimülasyon elektrodunu hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki Schaffer teminatlarına yerleştirin. Uyaran üretecini kullanarak, her 30 saniyede bir stimülasyon elektroduna bir akım darbesi verin ve bir popülasyon artışı görünene kadar stimülasyon gücünü kademeli olarak artırın.

Uyaran gücünü, elde edilebilecek maksimum genliğin %45'ine karşılık gelen bir popülasyon artışını uyandıracak şekilde ayarlayın. Eşleştirilmiş darbe inhibisyonu gerçekleştirmek için, uyaran üretecini kullanarak her 30 saniyede bir stimülasyon elektroduna iki akım darbesi verin. Uyaran gücünü, maksimum genliğin %45'ine karşılık gelen bir popülasyon artışını uyandıracak şekilde ayarlayın.

Bileşikleri test etmek için, ACSF'de test edilecek bileşiklerin seyreltmelerini yapın, böylece DMSO'nun nihai konsantrasyonu %0.1'den yüksek olmaz Kontrol çözeltisine, bileşik çözeltisindekiyle aynı konsantrasyonda DMSO ekleyin. En az 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir Schaffer kollateral stimülasyonları tarafından uyandırılan tek veya eşleştirilmiş bir nabız popülasyonu artışını kaydedin. Popülasyon ani artış şekli bu temel dönemde sabit olmalıdır.

Daha sonra, test edilecek bileşiğin sabit bir konsantrasyonunu içeren karbojene rACSF içeren bir beher hazırlayın ve tek veya eşleştirilmiş nabız popülasyonu sivri uçlarının kaydedilmesi sırasında hipokampal dilimi çözelti ile perfüze edin. Ayrıca, dilimi bileşik olmadan karbojene rACSF ile perfüze ederek bileşik etkisinden geri kazanımı değerlendirin. Burada, CA1 piramidal nöronlarının dendritik arborizasyonuna çıkıntı yapan CA3 piramidal hücre aksonlarından kaynaklanan Schaffer teminatları olan bir sıçan hipokampal diliminin şematik bir temsili gösterilmektedir.

Mikropipetler, popülasyon artışlarını kaydetmek için stratum pyramidale'ye ve alan uyarıcı postsinaptik potansiyellerin dendritik kayıtları için stratum radiatum'a yerleştirildi. Stimülasyon elektrodu Schaffer teminatlarının içine yerleştirildi. Bu şekil, 20 milisaniyelik bir aralıkta aynı uyarıcı elektrot aracılığıyla uygulanan eşleştirilmiş uyaranlar tarafından uyandırılan popülasyon artışlarını göstermektedir.

İkinci uyarana verilen popülasyon tepkisi, ilk uyarana verilen yanıttan daha küçük genliktedir. Seçici olmayan bir GABA A reseptörü NAM olan beta CCM'nin yokluğunda ve varlığında popülasyon artışları kaydedildi. Beta CCM, herhangi bir ileri beslemeli gabaerjik inhibisyonu kısmen bloke ederek ikinci popülasyon artışının genliğini arttırdı.

Bu prosedürü takiben, tanımlanan bileşiklerin klinik gelişim potansiyeli gibi ek soruları yanıtlamak için farmakokinetik, reseptör doluluğu ve etkinliği in vivo ve güvenlik farmakolojisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.