Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Konformasyonel esneklik, protein fonksiyonunda kritik bir rol oynar ve Zaman Çözümlü ElektroSprey İyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometresinin genel amacı, sıralı ve düzensiz proteinlerde işlevi yönlendiren hızlı yapısal değişiklikleri araştırmaktır. Bu yöntem, elektrosistografi ve NMR gibi klasik yüksek çözünürlüklü teknikler için minimal olmayan, geçici protein onaylarının kraterizasyonu gibi yapısal biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, reaksiyonların, döngü sırtlarını, Moltinglobyalleri ve içsel olarak düzensiz proteinleri karakterize etmek için önemli olan milisaniye zaman ölçeğinde izlenebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, nörodejeneratif bozuklukların tedavisine kadar uzanır. Sıklıkla içsel olarak düzensiz protein bölgelerinin yanlış katlanmasını veya toplanmasını içerdiğinden. Bu yöntem haftalık yapılandırılmış proteinler hakkında bilgi sağlayabilse de, katalitik devir geçiren enzimler veya protein, protein ve protein, ligan etkileşimlerinin karakterizasyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu prosedüre başlamak için, bir lazer kazıyıcı kullanarak standart bir PMM8 bloğu üzerinde reaktifleri, bir pro diyaliz odasını ve bir çıkış kanalını tanıtmak için bir giriş kanalından bir plakayı lazerleyin. Bunu takiben, 30 gauge paslanmaz çelik metal kılcal damarı, 164. inç kalınlığındaki kesme diski için döner bir alet kullanarak 10 santimetrelik iki parçaya kesin. Kılcal damarların ucunu düzleştirmek için zımpara kağıdı kullanın, bu da ışık mikroskobu altında görüntülenerek kolaylaştırılabilir.

Şimdi, bu kılcal damarları bir gezinme demiri kullanarak kazınmış PMM8 bloğuna eritin. Sürekli bir akış oluşturmak için, zamanla çözülen kinetik karıştırıcı, yaklaşık 15 santimetrelik 28 gauge, çelik, metal bir kılcal damara 40 santimetre kaynaşmış cilica cam kılcal yerleştirin. Ardından, iç cam kılcalın bir ucunda düşük güçlü lazer kazıma makinesi ayarlarını kullanarak iki milimetrelik bir çentik oluşturun ve iç cam kılcalın bu ucunu kapatın.

Bu, çentikten çıkan proteinin ortogonal ve verimli bir şekilde karıştırılmasını sağlayan kritik bir adımdır. Çentik ile kılcal damarın ucu arasındaki iki milimetrelik kılcal damarlar arası boşluk, karışım ve hacimdir. Uygun boyutta bağlantı parçaları ve boru manşonlarını takın ve deterjan sağlamak için kullanılacak bir T konektörü ekleyin.

Daha sonra, iç cam kılcalayı, ışık mikroskobu altında görüntülenerek kolaylaştırılabilen metal kılcal damarın ucuyla hizalayın. Bunu sıfır milimetre konumu olarak işaretleyin. Daha sonra, karıştırma T'deki kinetik karıştırıcının karşı ucuna 40 santimetrelik bir erimiş silika cam kılcal takın.Pepsin aktivasyonu için, bir mililitre birleştirme tamponunda Porsena gaz mukozasından 20 miligram pepsin süspansiyonu yapın.

Yeniden askıya alınan proteinlere 50 miligram NHS aktif agro hızı ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede hafifçe döndürün. Ertesi gün, reçineyi toplamak için karışımı oda sıcaklığında iki dakika boyunca bin kez G döndürün. Sonra bağlanmamış proteinleri aspire edin.

Bunu takiben, agroları bir mililitre bloke edici tampon içinde inkübe edin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe döndürün. Reçineyi topladıktan ve bloke edici tamponu aspire ettikten sonra, pepsin aggurosunu bir mililitre yüzde beş asedik asit ile beş dakika boyunca inkübe edin. Reçineyi toplamak için karışımı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1.000 kez G'de döndürün, ardından süper natenti aspire edin.

Önceki adımları tekrarladıktan sonra, toplam üç yıkama için, uzun süreli kullanım için boncukları bir mililitre asedik asit içinde dört santigrat derecede saklayın. Cihazı monte etmek için, steril bir spatula kullanarak yüzde beş asedik asit içinde bir bulamaç aktif pepsin agguros boncukları ile bir protializ odasını doldurun. PMMA mikro falitik platformu, sıvı geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için silikon kauçukla kaplanmış, cihazı kapatmak için bir kapak olarak iki boş PMMA bloğu arasına yerleştirin.

Cihazı basınçlı sızdırmaz hale getirmek için metalik sıkıştırma plakaları kullanın. Ardından karıştırma T'yi uygun bağlantı parçaları kullanarak cihazın girişine takın. Şimdi yüzde beş asedik asit aktığını düşündüm, asit hattı dakikada on mikrolitre hızında.

Daha sonra 50 milimetre amonyak asidi tamponunu protein hattından dakikada bir mikrolitre hızında akıtın. Cihazı, optimum elektro püskürtme koşullarını elde etmek için ayarlanabilir yalıtımlı aşama kullanarak değiştirilmiş, dörtlü bir uçuş süresinin veya Qtof kütle spektrometresinin ön ucuna bağlayın. ESI-MS koşullarını ayarladıktan sonra, yalnızca bir pepsin spektrumu edinin.

Daha sonra, 50 milimetre amonyum asitat tamponunun daha önce aktığı dakikada bir mikrolitre oranında 50 ila 100 mikromoler tau veya fosfo-tau proteini ekleyin. Sistemin en az 10 dakika dengelenmesine izin verdikten sonra, edinimden önce, sadece protein spektrumu elde edin. Tao veya fosfo tao proteini akarken, T konektörü aracılığıyla dakikada üç mikrolitre hızında duteryumoksit ekleyin ve kinetik karıştırıcıda reaksiyona girmesine izin verin.

Etiketleme süresini artırmak için, 42 milisaniye ila sekiz saniye arasında karıştırma süreleri elde etmek için iç cam kılcalın konumunu manuel olarak geri çekin ve sistemin her geri çekme arasında en az 10 saniye dengelenmesine izin verin. Bu animasyon, tipik bir denemenin iş akışını gösterir. Protein çentikten çıkar ve yaklaşmakta olan duteryum ile karışır.

Omurga M8 hidrojenleri, protein kılcal damarının geri çekilmesiyle değiştirilebilen, tahsis edilen reaksiyon süresi boyunca değiştirilir. Reaksiyon daha sonra söndürülür ve daha sonra bir çıkış ESI iğnesi içeren bir mikro akışkan platform üzerinde sindirilir. Elde edilen spektrum sindirilmiş protein içerir.

Döteryum alımının yüzdesi, tek tek peptitler için hesaplanır ve daha sonra 3D protein yapısına eşlenir. Doğal ve fosfo-tau'nun sindirim profilleri benzerdi, sırasıyla yüzde 77.1 ve 71.7'lik bir dizi kapsamı sağladı, en uygun izotopik dağılımlar ve dört basit peptit için ilişkili döteryum alım değerleri burada gösterilmiştir. Her bir peptit için zamana karşı döteryum alımına göre yüzde olarak gözlemlenen kinetik grafik, gözlemlenen deneysel oranı çıkarmak için kullanılır.

Hesaplanan rastgele kalite profilleri karşılaştırma için gösterilir ve teorik içsel notu çıkarmak için kullanılır. Beklendiği gibi, normalde ikincil yapı elemanlarıyla ilişkili olan aralıkta hiçbir koruma faktörü gözlenmedi ve bu da doğal tau'nun zayıf iç hidrojen bağı sergilediğini doğruladı. N ve C terminallerinde, merkezi alanda ve toplanma proned bölgelerinde önemli koruma gözlenir.

Hiperfosfo ile ilişkili tau'da, protein boyunca döteryum alımında genel bir artış gözlendi. N ve C terminallerinde ve hekzapeptid iki bölgesinde önemli artışlar vardır. Koruma faktörlerinin derecesi, burada gösterildiği gibi bir gökkuşağı şeması olarak renklendirilmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, analize müdahale edebilecekleri için kirleticileri en aza indirmek için HPC sınıfı veya daha yüksek bölgeler kullanmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, üç boyutlu protein yapılarını eşleştirmek veya protein proteini ve protein legin etkileşimi alanlarını doğrulamak için kovalent etiketleme, kimyasal çapraz bağlama, hesaplamalı modelleme ve belgesel çalışmaları gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların, nuerodejeneratif hastalıklarda en yaygın olan, içsel olarak düzensiz proteinleri ve alanları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, protein yapısı ve dinamiğinin incelenmesi için zamana bağlı elektro sprey iyonizasyonu, hidrojen döteryum değişimi, kütle spektometrisinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.