Name: Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin mikroakışkan platform kullanarak yüksek verimli protein ekspresyonu yöntemini. Bu teknik, arındırma adımı gerektirmeden modüler protein dizileri oluşturur ve çeşitli protein kütüphaneleriyle uyumludur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Marie Curie Uluslararası Yeniden entegrasyon hibesi ile desteklenmiştir.

1. Cihaz İmalatı <ol><li> Stanford Mikroakiskan Döküm (den DTPA-D SU-8 kontrol kalıp ve SPR220-7 akış kalıp Satın <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / grup / döküm</a> ). </li><li> Pişirme adımları sonra 9 elastomer salınımını teşvik etmek 10 dakika chlorotrimethylsilane (TMCS) buharı silikon kalıplar Açığa. </li><li> İki farklı oranlar sırasıyla 5:1 vermekte kontrolü ve akış kalıpları için 20:1, silikon bazlı elastomer ve sertleştirici (iyice karıştırın) karışımı hazırlayın. Farklı oranlarda çoklu katmanlar için uygun bağların gereklidir. </li><li> Kontrol tabakası (yaklaşık 5 mm yükseklik) 05:01 PDMS dökün. 80 kontrol tabakası ve 30 dakika için fırına Degas ° C. Sonra, Sıkma kat (Laurell, USA) 60 saniye için 2.600 rpm&#39;de akış tabaka üzerinde 20:01 PDMS ve karışım 30 dakika için 80 ° C &#39;de fırında. Spin lak hızı bir basınçta valf harekete için optimize edilmiştir15 psi. Daha hızlı dönen bir alt basınç aktivasyonu ve bunun tersi olan bir ince tabaka ile sonuçlanacaktır. Kullandığımız cihazlar substrattan dekolmanı meydana gelebilecek Yukarıda, akış kontrolü 25 psi ve 10 psi bir sınırı vardır. </li><li> Kalıptan kontrol tabakası ayırın. Yavaş yavaş ve değil SU8 desen soyma dikkat etmeyin. Sonra kontrol kanalları erişmek için kendi çevre ve zımba delikleri çevresinde cihaz kesti. </li><li> Elle stereoskop altında akış ve kontrol tabakaları hizalayın. Sol üst köşesine hizalayarak başlayın; düğmesine vana (kontrol tabakası) reaksiyon odası (akış tabakası) ortasında olmalıdır. Ardından, ilk satır hizalayın ve yavaşça satır tarafından kontrol katmanı satır bırakın. Her düğme valfleri reaksiyon odaları ortasında ve adres ve giriş vanaları doğru konumda akış kanalları çapraz ki olduğundan emin olun. Tüm satırlar hizalanır kadar işlem lokal tekrar edilebilir. Sonunda, PDMS b herhangi bir gerilim serbesty kenar ve köşeler dikkatlice kaldırarak. Çok fazla kaldırmayın veya kayma meydana gelebilir. </li><li> 80 de 2 saat için fırına ° C. </li><li> Cihazın dış kenarı boyunca ve akım kalıp iki tabaka cihaz (çip) soyma kesin. Akış kanalları (Şekil 1) erişmek için delikler. </li></ol> 2. DNA Arraying ve Aygıt Yerleşimi <ol><li> Montaj PCR ile sentetik gen üretin. Sentetik genler T7 promotor, ribozom bağlanma yeri (RBS), iki epitop etiketleri ile ORF (her iki ucunda) ve T7 terminatör 4 beste vardır. Genleri, en azından, en fazla 100 bp uzunluğunda 5000 bp değişebilir. </li><li> Arraying için sentetik genler hazırlayın: poli etilen glikol (% 1.25) ve D-trehaloz dihidrat (125 mg / ml) bir karışımı hazırlandı ve 384 kuyu plakası reaksiyon başına 2 ul dağıtın. Bu çözelti hizalama 10 boyunca görselleştirme için hem de cam DNA tersinmez bağlayıcı azaltacaktır. </li&gt; <li> 384 kuyu plaka sentetik gen aktarın. Genellikle DNA konsantrasyonları 10 ul / ng 100 ng / ul nihai konsantrasyonu değişir. 20 ul (microarrayer ve pin tipi bağlıdır) bir son hacim dH 2 O ekleyin. </li><li> Bir microarrayer kullanılarak epoksi kaplı cam tabanlar üzerinde sentetik bir seri gen Nokta. Biz SMT-S75 silikon işaretçilerine (Paralel Sentez, ABD) ile MicroGrid 610 (Bio Robotik) kullanın. Bu özel pimleri ile, DNA baskı İletişim, cam yüzey üzerinde yaklaşık 100 um çaplı noktalar ile sonuçlanır. Her pim yükü yaklaşık 100 lekeler için yeterlidir. Sütun ve satır sahalar kullanılan belirli bir cihaza uygun olduğundan emin olun. Kullandığımız cihaz 16 sütun ve sırasıyla 320 mikron ile 680 mikron arasında bir adım ile 40 satır içerir. </li><li> Elle stereoskop altında gen dizisine mikroakışkan cihaz hizalayın. DNA nokta DNA odaları ortasında olmalıdır. Noktalar b ilk satırı bularak uyum başlayınDNA odalarının ilk satırı elow. Ardından, satır kalanı tüm cihaz ince ayar ile bitiş çizgisine getirmek. Dizi hizalanmış sonra bakım yerel kaldırarak, PDMS herhangi stresi hafifletmek için alınmalıdır. Bu mikroarray iyi bağ olmayabilir PDMS kalan gerginlik varsa. </li><li> Nihayet, 80 bir sıcak plaka üzerinde gecelik inkübasyon tarafından cam slayt bağ cihaz ° C. </li></ol> 3. Hazırlama ve Cihaz etkinleştirme <ol><li> Kontrol tabakası olarak valf LabVIEW kullanarak bilgisayar kumanda edilir. LabVIEW komut dosyası bir elektronik kontrol kutusu (Stanford Mikroakiskan Döküm satın) ile selenoid mikro vana bir dizi kontrol eder. Solenoid valf manifoldu cihaz üzerinde kontrol valfleri içine hava akımı ve basıncı kontrol basınçlı hava, bağlanır. </li><li> (Tygon &quot;0.02 iç çapı ile esnek plastik boru kullanarak solenoid valfler manifolduna bağlayın) Ve paslanmaz çelik pim (New England Küçük Tüpler Corporation). </li><li> DDW ile tüpler doldurun ve kontrol katmanı erişim deliklere pimi takın. Her bir tüp karşılık gelen kumanda kanalına bağlı olduğundan emin olun. </li><li> Kontrol kanalları etkinleştirmek için bilgisayarda LabVIEW uygulamasını çalıştırın. LabVIEW script valfi devreye sokarak, biz sırayla PDMS kontrol kanalları içine su itecektir hava basıncı, uygulayın. Hava basıncı 5 psi ayarlayın. Bu arızalı cihazların kontrol kanalları arasındaki çapraz-görüşmeler tespit etmek için, ilk olarak &quot;sandviç&quot; ve adres valfleri doldurmak için tavsiye edilir. Çapraz görüşmeler durumunda, &#39;sandviç&#39; kontrol çizgisinin harekete boyun veya düğme kontrol hatları birinin harekete yol açacaktır. Bu, bir elektrik devresi içinde bir kısa benzer. Diyafoniyi olan bir cihaz arızalı ve kullanılamaz. </li><li> Tüm kontrol kanalları ve vanalar DDW dolu sonra, vanalar astarlanmış ve rea vardırAltlarında akış kanalları engellemek için dy. Hava basıncı 15 psi artırın. Valf Etkinleştirme bireysel selenoid vana bağlı kapalı / anahtarları bir dizi aracılığıyla LabVIEW programı tarafından kontrol edilir. Her anahtar karşılık gelen selenoid vana aracılığıyla belirli bir kontrol hattı kontrol eder. Düğmesi (komut) Açma gelen tüp hava basıncı uygulanır. Hava basıncı kontrol hattı içinde DDW itmek ve alt kanal bloke edici, mikroakışkan valf genişlemesi ile sonuçlanır. Bir kontrol vanası kapatılması, hava basıncı serbest bırakmak ve daha sonra ilgili akış kanal engelleme yayınlayacak. </li><li> Tüm valf açık olduğundan emin olmak için, akım girişleri ve 4-5 psi cihaz içine hava akış birine göre bir tüp bağlanır. Bu cam slayt herhangi bir yapışkan vanalar yayınlayacak. </li><li> Son olarak, cihaz, astar ve hazır edilir. Yüzey kimyası başlatmak için tüm giriş ve &#39;boyun&#39; valfleri kapatın. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Yüzey Kimyası <ol><li> Yüzey üzerinde bir protein dizinin kendi montaj kolaylaştırmak ve mikroakışkan cihaz içinde spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için, yüzeyin kimyasal olarak modifiye edilir: </li><li> Aygıt aracılığıyla bir bileşen akıtmak için, cihaz içinde akış kanallarından biri için gerekli çözelti ile yeni bir tüp bağlanır. Kılavuz manifolduna tüpün serbest yan bağlayın ve hava basıncı akımı (5 psi) açın. </li><li> Cihazından 20 dk için yaklaşık yarım yeni bir tüp içinde ve akış biyotinile-BSA (1 ug / ul), 40 ul yerleştirin BSA epoksi yüzeyine bağlanır. </li><li> Farklı yüzey kimyası adımların her biri arasında reaksiyona girmeyen yüzey yıkama için HEPES (50 mM) kullanın. </li><li> Biyotinile-BSA üzerine, 20 dakika boyunca 25 ul akış Strepavidin (0.5 ug / ul). </li><li> 5 dk Hepes ile yıkayın. </li><li> &#39;Butonu&#39; vanasını kapatın ve biyotin-BSA kalanı (anlatıldığı şekilde akardüğme çevreleyen yüzey pasifleştirici yukarıda yatak). </li><li> 5 dk Hepes ile yıkayın. </li><li> 20 dakika penta-His-biotin &#39;düğme&#39; vana ve akış 30 ul (0.16 mikrogram / ul) bırakın. Antikor maruz strepavidin bağlanacaktır; özel bir anti His-etiketi dizi oluşturma &#39;düğme&#39; altındaki alana. </li></ol> 5. Protein Ekspresyonu <ol><li> Tavşan retikülosit hızlı birleştiğinde transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu kullanılarak cihaz üzerinde proteinlerin ifade eder. Cihaz üzerinde benekli sentetik genlerden protein ekspresyonu kullanıma hazır proteinler bir dizi oluşturur. Örneğin, böyle bir kullanımı bir protein bağlama ekran içindir. </li><li> &#39;Boyun&#39; valfleri ve akış tavşan retikülosit pratik birleştiğinde transkripsiyon ve DNA odasına cihaz aracılığıyla çeviri reaksiyonu açın. Sonra, &#39;sandviç&#39; vanalarını kapatın ve çevresinin her gen ayırın. 30. az 2.5 saat için bir sıcak levha üzerinde inkübe cihaz ° C. Ifade proteins, C-terminali etiket aracılığıyla protein hareketsizleştirici &quot;butonunu&quot; kapağın altında anti-His antikor için DNA odasından gelen reaksiyon oda kendiliğinden (boyun valf açıktır) ve bağlama için dağılacaktır. </li><li> C-myc antikoru ile Cy3 proteinleri etiketleyin. Antikor proteini N-ucu bulunan karşılık gelen bir epitopa bağlanır. </li><li> Bir 532 nm lazer ve 575 nm emisyon filtresi kullanarak bir mikroarray tarayıcı (LS Reloaded, Tecan) ile protein ekspresyon düzeyleri belirleyin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar 1. Cihaz İmalatı Cihaz için bir grafik tasarım bizim deneysel gereksinimlerine dayalı AutoCAD tarafından oluşturuldu. Tasarım, yüksek çözünürlüklü görüntü ayarlayıcı bir asetata basılmış. Bu şeffaflık temas fotolitografi bir Fotoşablonlarda olarak hizmet vermektedir. Bir yüzey mikroişleme tekniği t üzerinde yazılı desenleri tarafından belirlenen bir silikon yonga üzerine 3-D şablonları oluşturmak için kullanılanO maske kullanılmalıdır. Mikroakışkan cihaz silikon elastomer polidimetilsiloksan (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, ABD) (Şekil 1) döküm silikon kalıp üzerinde imal edilmiştir. Her cihaz, iki hizalanmış PDMS katmanları, ve akış kontrol tabakasını içermektedir. Kalıp ilk pişirme adımlardan sonra elastomer salınımını teşvik etmek 10 dakika chlorotrimethylsilane (TMCS, Aldrich) buhar maruz kalmıştır. Silikon bazlı elastomer ve sertleştirici bir karışım, iki farklı oranı ise 5:01 ve kontrol ve akış kalıpları için 20:1 içinde hazırlanmıştır. Kontrol tabakası 80 ° C&#39;de gazdan arındırıldı ve 30 dakika süre ile pişmiş Akış tabakası başlangıçta 60 saniye 2,600 rpm&#39;de (Laurell, ABD) kaplamalı spin ° C 30 dakika 80 pişmiş. Kontrol katmanı kendi kalıp ayrıldı ve kontrol kanal erişimi delikler vardı. Daha sonra, akış kontrol tabakaları ve bir stereoskop altında el ile hizalanır ve 80 de 2 saat boyunca pişirilmiştir ° C. İki katman cihazın f soyuldurom akışı kalıp ve akış kanallarına erişim delikler vardı. 2. Aygıt Tanımı Cihaz kapasitesi 500 ila 10,000 birim hücreler (Şekil 2) olabilir. Cihaz iki katmandan oluşur; akım tabakası (gri) ve kontrol katmanı (renk). Kontrol katmanı farklı fonksiyonu ile vanalar çeşitli içerir. Akış tabaka içinde her bir birim hücre, bir DNA ve bir reaksiyon odasına oluşur ve mikro vana üç tipleri tarafından kontrol edilir; &quot;boyun&quot;, &quot;düğme&quot;, ve &quot;sandviç&quot; (Şekil 2A). DNA odasının içindeki yatırılan bir benekli &#39;sentetik gen&#39; &#39;Boyun&#39; vana (yeşil) ile reaksiyon odası engellenir. Reaksiyon oda yüzey bağlı proteinler sıkışması ve mekanik yıkama &quot;butonunu&quot; kapağın (mavi) tarafından gerçekleştirilir. &quot;Sandviç&quot; valf kendi başına birim hücre (kırmızı) meydana geldiği her bir tepki verir. Adresi vanalar differe için, 8 bağımsız bölüm için Aygıtı bölebilirsiniznt durumu tahlil. Buna ek olarak, kontrol tabakası akış tabakası içine seçilmiş akışkan akışını sağlamak giriş valf içerir. PDMS kontrol kanalları DDW ile dolu. PDMS genişleme bir valf basınç artışı devreye girer (15 psi) sonuçları. Membran yeterince ince olduğu yerlerde (örneğin, kontrol ve akış hatlarının kapısı) bu tamamen akış hattı engellemek için yeterlidir. Ortalama birim hücre yüksekliği 10 mikron ve ortalama birim hücre hacmi az 1 nl olduğunu. 3. Proteinler İfade ve Algılama Proteinler tavşan retikülosit pratik birleştiğinde transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu (Promega) kullanarak cihaz üzerinde ifade edildi. Proteinlerin ekspresyonu, bir bağlayıcı ekran içinde kullanım için hazır protein (Şekil 3) arasında bir dizi oluşturulur. Bir ifade karışımı (12.5 ul) cihazın içine yüklenen ve daha sonra &#39;Boyun&#39; valfleri açarak DNA odalarına akınına uğradı. Sonra, &#39;sandviç&#39; vanalar vardıkomşu hücreler ve cihazı ayrılmış her bir birim hücrenin 30 2.5 saat için bir sıcak levha üzerinde inkübe edildi bırakarak ° C&#39;de kapatılmış Kendi C-terminali His etiketi anti-His antikoru (Qiagen) yüzeyine protein hareketsizleştirici &#39;düğme&#39; valf altında yer bağlamak olabilir reaksiyon odasına, içine bölme gen tarafından yayılır proteinler. Proteinler protein N-ucu bulunan karşılık gelen bir epitopa bağlanır ve bir etiketli c-myc Cy3 (Sigma) ile işaretlendi. Protein ekspresyon düzeyleri bir 532 nm lazer ve 575 nm filtresini kullanarak bir mikroarray tarayıcı (LS Reloaded, Tecan) ile belirlenmiştir. Elde edilen protein dizisinin proteini ekspresyonu, değişen oluşur. Genellikle, bir gen kütüphanesi yaklaşık% 20, tespit edilebilir seviyelerde ifade etmek başarısız olmaktadır. Protein boyutu ile korelasyon 3 gözlenmiştir. Arka plan seviyeleri DNA ile tespit edilmemiştir odası kullanılarak belirlenmiştir. Böylece, ilgili protein odalarından sinyalleri n ya nedeniyleoise ya da etiketleme antikorların spesifik olmayan adsorpsiyon. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Chip Fabrikasyon. (A) kalıplar 10 dakika TMCS buharlar ile tedavi edildi. (B) PDMS kontrolü ve akış silikon kalıplar üzerine dökülmektedir. (C) her ikisi de kontrol ve akış kalıplar 80 ° C&#39;de 30 dakika boyunca pişirilir. (D) kalıp soyulmuş kontrol katmanı, ebatlarına göre kesilmiş ve kontrol girişlerine açılmıştır. (E) kontrol tabakası bir stereoskop altında akış tabaka ile hizalanır ve daha sonra 80 pişirilir 2 saat ° C. PDMS aygıt yapılmasına paralel olarak, sentetik bir seri gen epoksi kaplı cam yüzeyler (CEL Associates) üzerine microarrayed edilir. (F) aygıtı sonra DNA odaları içinde &#39;Sentetik genler&#39; yakalama DNA mikroarray hizalanır. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. PING Cihaz bir Fotoğraf. (A) Cihaz consiiki bağlantısız PDMS katmanları (kontrol ve akış) st. Akış katman kontrol tabakası olarak mikromekanik valfler (&quot;ayarlamak&quot;, &quot;sandviç&quot; ve &quot;boyun&quot;) tarafından kontrol edilen paralel DNA ve reaksiyon odaları (gri) içerir. (B) katmanları basılı mikroarray, tek bir nokta ile her DNA odasına programlarına hizalanır. Bu herhangi bir potansiyel kontaminasyonu ortadan kaldırır. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. Bir Mikroakışkan Chip ile düzenlendi Bir ​​Protein Array Floresan Görüntüleri. Yazdırılan spot genler cihazın içindeki proteinler (DNA odasında) dile getirilmiştir ve onların aracılığıyla (reaksiyon odasında &quot;düğmesi&quot; kapak altında) yüzeye yıktırılmıştır C-terminali Onun etiketi. Protein ifade onların c-myc N-terminali, etiket ve belirli bir floresan antikor kullanılarak tespit edildi. Farklı sinyal şiddetleri farklı protein ekspresyon düzeyleri göstermektedir. Un-benekli odaları arka le için kontrol grubu olarakVELS.

<ol><li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+Microfluidic+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li>
<li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanoliter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li>
<li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li>
<li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li>
<li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li>
<li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li>
<li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li>
<li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supports+for+microarray+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+recognition+JMR%22%5BJournal%5D)">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li>
<li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428(2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda, bir mikroakışkan platformu kullanarak yüksek throughput nesil protein dizileri için bir yöntem mevcut. Dizi nesil DNA şablonları mikroarray baskı ve mikroakışkan cihaz içinde DNA&#39;nın in vitro protein ekspresyonu dayanır. Bizim roman mikroakışkan platform proteomik için umut verici ve genel bir araç haline anda kullanılan yöntemler üzerinde birçok önemli avantajlara sahiptir. Bir avantaj zar-bağlı proteinler ile. Mikrozomal membran 11 mevcudiyetinde...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PDMS-Sylgard 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Chlorotrimethylsilane (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Epoksi kaplı cam yüzeyler </td><td> CEL Associates ABD </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poli etilen glikol (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-trehaloz dihidrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinlenmiş-BSA </td><td> Delmek </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidin </td><td> Delmek </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> Penta-His-biotin </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Biyolojik Sanayi</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc Cy3 antikor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Kontrol kutusu </td><td> Stanford Mikroakiskan Döküm </td><td></td></tr><tr><td> Kalıp </td><td> Stanford Mikroakiskan Döküm </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> New England Küçük Tüpler Corporation&#39;ın </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore boru </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> Bio Robotik </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Silikon işaretçilerine </td><td> Paralel Syntez </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

bir mikroakışkan platform kullanarak yüksek throughput protein ekspresyonu jeneratör

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bu tür sistemler biyoloji gibi hızla artan alanları, büyük sistemlerde yüksek verimli ve yüksek kalitede ölçüm sağlayan yeni teknolojilerin geliştirilmesi ve uygulanması gerekmektedir. Mikroakiskan, biyokimyasal biyofiziksel ve hücre tabanlı deneyleri 1 kapsayan, bu tür on-chip yüksek çıktılı tarama deneyleri gerçekleştirmek gibi, bu gereksinimleri birçok yerine getirmek için vaat ediyor. Mikroakışkanları cihazların ilk günlerinden bu yana, bu alanda büyük ölçüde mikroakışkan büyük ölçekli entegrasyon 2,3 gelişimine öncülük etmek, gelişti. Bu teknoloji, bir pul büyüklüğünde yer kaplayan (Şekil 1) ile tek bir cihazda mikromekanik vanaları binlerce entegrasyon sağlar. Biz PING (Protein Etkileşim Ağı Generator) adlı proteini diziler (Şekil 2) in vitro ifade oluşturmak için bir high-throughput mikroakışkan platformu geliştirdi. Bu diziler birçok deneyler için bir şablon görevi görebilirgibi protein-protein 4, protein-5 RNA ya da protein-DNA 6 etkileşimleri. Cihaz tek bir microarrayer kullanılarak programlanır reaksiyon odaları binlerce oluşur. Standart mikroarray lekelenme teknikleri kullanarak mikroarrayler üreten Ayrıca potansiyel kontaminasyon veya çapraz reaktivite ortadan kaldırarak, tek bir nokta ile ve arayüz aygıtları programlar için bu baskılı microarrays her odası hizalama, proteinler 7, DNA 8, küçük moleküllerin arraying için izin de çok modüler ve hatta kolloidal süspansiyonlar. Biyolojik bilimler üzerine mikroakışkanları arasında potansiyel etkisi önemlidir. Mikroakışkanları dayalı testler bir dizi zaten biyolojik sistemlerin yapısı ve fonksiyonu yeni bakış açıları sağlamıştır ve mikroakışkanları alanında biyoloji etkilemeye devam edecek.

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Sistem biyolojisi gibi hızla gelişen alanlar, yüksek kapasiteli ve ... imkan tanıyan yeni teknolojilerin geliştirilmesini ve uygulanmasını gerektirmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, bir saflaştırma adımı gerektirmeyen ve böylece herhangi bir protein kütüphanesiyle uyumlu olan modüler bir protein dizisi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle assembly PCR aracılığıyla sentetik genlerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sentetik genler epoksi lamlar üzerine dizilir.Mikroakışkan cihazı üretmek için silikon kontrol ve akış kalıpları ile PDMS kullanın. Ardından, mikroakışkan cihazı noktalanmış DNA dizisiyle hizalayın. Son olarak, tavşan retikülosit lizatı mikroakışkan cihaza akıtılır ve proteinler eksprese edilir.Nihayetinde, floresan antikor işaretlemesi aracılığıyla binlerce proteinin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Mikroakışkan tabanlı tekniğin, protein mikro dizileri gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. DNA'yı mikro diziye yerleştiriyoruz ve ardından cihaz üzerinde proteinler üretmek için cellis kullanıyoruz.Böylece protein saflaştırmaya gerek kalmaz ve proteinler asla kurumaz. Deney boyunca taze kalırlar. Mikroakışkan teknik aynı zamanda daha yüksek hassasiyet sağlar. Mikroakışkan cihazı oluşturmak için, elastomer salınımını kolaylaştırmak amacıyla silikon kontrol ve akış kalıplarını 10 dakika b

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Öğrenin mikroakışkan platform kullanarak yüksek verimli protein ekspresyonu yöntemini. Bu teknik, arındırma adımı gerektirmeden modüler protein dizileri oluşturur ve çeşitli protein kütüphaneleriyle uyumludur.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Daha fazla video keşfet