Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör
August 23rd, 2012
Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.
Bu prosedürün genel amacı, saflaştırma adımı gerektirmeyen modüler bir protein dizisi oluşturmak ve onu herhangi bir protein kütüphanesi ile uyumlu hale getirmektir. Bu, ilk olarak montaj PCR yoluyla sentetik genlerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, sentetik genler epoksi slaytlar üzerine dizilir.
Mikroakışkan cihazı imal etmek için silikon kontrollü ve akış kalıplı PDMS kullanın. Daha sonra mikroakışkan cihaz, benekli DNA dizisine hizalanır. Son olarak, tavşan retikülosit lizatı mikroakışkan cihaza akar ve proteinler eksprese edilir.
Sonuçta, floresan antikor etiketlemesi yoluyla binlerce proteinin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Mikroakışkan tabanlı tekniği kullanmanın protein mikrodizileri gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. DNA'yı mikrodiziliyoruz ve daha sonra cihazda protein yapmak için cellis kullanıyoruz.
Bu nedenle, protein saflaştırmasına ihtiyaç duymayız ve proteinler asla kurumaz. Deney boyunca taze kalırlar. Mikroakışkan teknik ayrıca daha yüksek hassasiyet sağlar Mikroakışkan cihazı imal etmek için, elastomer salınımını teşvik etmek için silikon kontrolünü ve akış kalıplarını 10 dakika boyunca kloro trimetil silen buharına maruz bırakın.
Pişirme adımlarından sonra, kontrol ve akış kalıpları için sırasıyla beşe bir ve 20'ye bir olmak üzere iki farklı oranda silikon bazlı elastomer ve kürleme maddesi karışımı hazırlayın. Beşe bir PDMS'yi kontrol katmanına dökün. Kontrol katmanının gazını alın ve 80 santigrat derecede 30 dakika pişirin.
Daha sonra, akış tabakası üzerinde 2.600 RPM'de 60 saniye boyunca 20'ye bir PDMS karışımını kaplayın ve ardından 80 santigrat derecede 30 dakika pişirin. SU sekiz desenini soymamaya dikkat ederek kontrol katmanını kalıptan yavaşça ayırın. Daha sonra bir neşter kullanarak, cihazı çevresinden kesin ve mikroskop altında kontrol kanallarına erişmek için delikler açmak için kör bir iğne kullanın.
Sol üst köşeden başlayarak akış ve kontrol katmanlarını manuel olarak hizalayın ve düğme valfini reaksiyon odasının ortasındaki kontrol katmanına yerleştirin. Ardından, ilk satırı hizalayın ve kontrol katmanını satır satır yavaşça serbest bırakın. Tüm düğme vanalarının reaksiyon odalarının ortasında olduğundan ve adres ve giriş vanalarının akış kanallarını doğru konumda geçtiğinden emin olun.
Tüm satırlar hizalanana kadar işlemi yerel olarak tekrarlayın. Tam olarak hizalandığında, PDMS'yi yanlardan ve köşelerden dikkatlice kaldırarak içindeki gerilimi serbest bırakın. Daha sonra cihazı pişirdikten sonra 80 santigrat derecede iki saat pişirin.
Cihaz için DNA yapıları oluşturmak üzere akış kanallarına erişmek için çevrenin etrafını kesin ve iki katmanlı cihazı akış kalıbı delme deliklerinden soyun. Bir T yedi promotörü, bir ribozom bağlanma bölgesi, her iki ucunda farklı epitop etiketlerine sahip açık bir okuma çerçevesi ve bir T yedi sonlandırıcıdan oluşan sentetik genler üretmek için PCR gerçekleştirin. Sentetik genleri dizileme için hazırlamak için, bir polietilen glikol ve D trioz dihidrat karışımı yapın Reaksiyon başına iki mikrolitreyi bir 384'ün kuyularına dağıtın.
Kuyu plakası. Sentetik genleri 384 oyuklu bir plakaya ekleyin. Daha sonra 20 mikrolitrelik son hacme damıtılmış su ekleyin.
Daha sonra, bir mikrodizi noktası kullanarak, epoksi kaplı cam yüzeyler üzerine bir dizi sentetik gen. Bir stereoskop altında, mikroakışkan cihazı, DNA odalarının ortasına yerleştirilmiş DNA noktası ile gen dizisine manuel olarak hizalayın. Ardından sıraların geri kalanını hizaya getirin.
PDMS üzerindeki herhangi bir stresi hafifletmek ve mikrodiziye iyi bir şekilde yapışmasını sağlamak için tüm cihazın ince ayarıyla bitirme. Yerel olarak kaldırın. Son olarak, cihazı gece boyunca 80 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde inkübe ederek cam slayta bağlayın.
Gıda boyaları bu bölümde görselleştirme amaçlı kullanılmaktadır. Kontrol katmanındaki vanalar, laboratuvar görünümü kullanılarak bilgisayardan çalıştırılır. Laboratuvar görünümü komut dosyası, bir elektronik kontrol kutusu aracılığıyla bir dizi solenoid mikro valfi kontrol eder.
Solenoid valf manifoldu, cihazdaki kontrol valflerine hava akışını ve basıncını kontrol eden basınçlı havaya bağlıdır. İç çapı 0,02 inç olan esnek bir plastik boru ve paslanmaz çelik bir pim kullanarak, cihazı solenoid valf manifolduna bağlayın. Tüpleri çift damıtılmış suyla doldurun ve pimi kontrol katmanının erişim deliklerine yerleştirin.
Her tüpün ilgili kontrol kanalına bağlı olduğundan emin olun. Kontrol kanallarını etkinleştirmek için laboratuvar görünümü uygulamasını çalıştırın, hava basıncını beş PS'ye ayarlayın. Daha sonra laboratuvar görünümü komut dosyasından valfi etkinleştirerek hava basıncı uyguluyorum. Bu, arızalı cihazların kontrol kanalları arasındaki olası karışmayı belirlemek için suyu PDMS kontrol kanallarına itecektir.
Önce sandviçi ve adres vanalarını doldurun. Sonuçta, kontrol kanalları ve vanalar su ile doludur, altlarındaki akış kanallarını tıkamak için vanaları doldurun. Önce hava basıncını 15 PSI'ye çıkararak, ardından laboratuvar görünümünde, ayrı solenoid valflere bağlı bir dizi açma kapama anahtarı aracılığıyla program.
Tüm vanaların açık olduğundan emin olmak için tüm anahtar düğmelerini açarak tüm vanaları etkinleştirin. Akış girişlerinden birine bir tüp bağlayın ve cihaza dört ila beş PSI akışında hava verin. Bu, cam slayttaki yapışkan valfleri serbest bırakacaktır.
Cihaz artık hazırlanmıştır ve görselleştirme amaçları için hazırdır. Bu bölümdeki reaktifleri görselleştirmek için sarı gıda boyası kullanılır ve renksiz çözelti, yüzeyde bir protein dizisinin kendi kendine montajını kolaylaştırmak ve mikroakışkan cihaz içinde spesifik olmayan emilimi önlemek için hippileri temsil eder, önce cihazdaki akış kanallarından birine gerekli çözelti ile yeni bir tüp bağlayarak yüzeyi kimyasal olarak değiştirir. Ardından borunun serbest tarafını manuel manifolda bağlayın ve hava basıncı akışını açın.
40 mikrolitre biotin katkılı BSA'yı yeni bir tüpe yükleyin ve yaklaşık yarısını 20 dakika boyunca cihazdan geçirin. Her adım arasında reaktif olmayan alt tabakayı yıkamak için 50 milimolar hippi kullanın. Daha sonra, 20 dakika boyunca 25 mikrolitre streptavidin akıtın.
Biyotin ellenmiş BSA'nın üstünde, düğmeyi çevreleyen yüzeyi yemek için beş dakika boyunca hees ile yıkayın, düğme valfini kapatın ve biyotinile BSA'nın geri kalanını akıtın ve ardından beş dakika boyunca bezelye ile tekrar yıkayın. Son olarak, düğmenin altında bir anti tıslama etiketi dizisi oluşturmak için, düğme valfini serbest bırakın ve cihazda bir dizi protein oluşturmak için 30 mikrolitre Penta hiss biotin'i 20 dakika boyunca akıtın. Boyun valflerini açın ve tavşan retikülositini akıtın.
Cihaz aracılığıyla DNA odasına hızlı birleştirilmiş transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu çözeltisi. Daha sonra, her bir geni ortamından ayırmak için sandviç vanaları kapatın ve cihazı 30 santigrat derecede 2,5 saat boyunca sıcak bir plaka üzerinde inkübe edin. Daha sonra proteinlerin uç ucunu C karışımı SI üç antikoru ile etiketleyin.
Son olarak, 532 nanometre lazer ve 575 nanometre emisyon filtreli bir mikrodizi tarayıcı kullanarak. Protein seviyelerini belirleyin. Bu şekil, bir protein dizisi üzerindeki değişen protein ekspresyon seviyelerini göstermektedir.
Genellikle bir gen kütüphanesinin %20'si tespit edilebilir seviyelerde ifade sağlayamaz. Arka plan seviyeleri, DNA ile lekelenmemiş odacıklar kullanılarak belirlendi. Bu nedenle, karşılık gelen protein odalarından gelen sinyaller, etiketleme antikorlarının gürültüsünden veya spesifik olmayan absorpsiyonundan kaynaklanmaktadır.
Düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, bu cihaz doğrulaması dört saat sürer ve çip deneyi beş saat sürer.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, binlerce reaksiyon odasının mikro-mekanik vanalar tarafından kontrol edildiği bir cihaz kullanarak protein dizilerinin ekspresyonu için mikroakışkan bir yaklaşım sunar. Mikrodizi baskılı gen kütüphanesinin entegrasyonu, yongada transkripsiyon ve translasyona izin vererek, kullanıma hazır bir protein dizisi elde edilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlık
- Protein Ekspresyonu
- Gen Kütüphaneleri
Arka Plan
- Protein dizileri çeşitli biyolojik analizleri için esastır.
- Geleneksel yöntemler genellikle saflaştırma adımları gerektirir ve uyumluluğu sınırlar.
- Mikroakışkan cihazlar protein ekspresyon sürecini hızlandırabilir.
- Sentetik genlerin dizi halinde düzenlenmesi için montaj PCR kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Saflaştırma adımları olmadan modüler bir protein dizisi oluşturmak.
- Herhangi bir protein kütüphanesi ile uyumluluğu artırmak.
- Mikroakışkan kullanarak protein ekspresyonunun verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Montaj PCR yoluyla sentetik genlerin üretilmesi.
- Sentetik genlerin epoksi slaytlar üzerinde dizilmesi.
- PDMS kullanarak mikroakışkan cihazın üretilmesi.
- Protein ekspresyonu için cihaza tavşan retikülosit lizatının akması.
Ana Sonuçlar
- İşlevsel bir mikroakışkan cihaz başarıyla oluşturuldu.
- Proteinler saflaştırma olmadan yongada eksprese edildi.
- Yöntem, çeşitli protein kütüphaneleriyle uyumluluğunu gösterdi.
- Yongada transkripsiyon ve translasyon etkili bir şekilde gerçekleştirildi.
Sonuçlar
- Bu mikroakışkan yaklaşım, protein dizilerinin oluşturulmasını basitleştirir.
- Saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanılabilirliği artırır.
- Teknik, araştırma için çeşitli protein kütüphanelerine uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
