Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Bu yöntem, tek nöron izolasyon u ve sıralama alanında önemli bir engeli çözmeye yardımcı olabilir. Örneğin, kullanıcı tanımlı beyin bölgesinden belirli bir popülasyon veya floresan olarak etiketlenmiş nöron alt popülasyonu toplamak gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek bir nöronun enkazları kirletmeden yakalanmasını sağlamasıdır.

Aynı zamanda nispeten nazik, hangi hızlı bir şekilde geleneksel FACS sıralama sıvı basınçlarına tabi ölmek kırılgan nöron tipleri için önemlidir. Kılcal bir çekmece kullanarak 10 ila 15 mikron çıkış çapı ile çekilmiş cam mikrokapiller hazırlayarak başlayın. İstenilen tahta çapı elde etmek için kılcal ucu kesmek için ince makas kullanın.

Daha sonra 0,8 milimetre iç çapı 0,8 milimetre lik esnek silikon borunun 120 ila 150 santimetre uzunluğundaki kısmını 0,2 mikron PVDF membran şırınga filtresine ve iki yönlü boru vanasına takmak için boru konektörlerini kullanın. 500 mililitre soğutulmuş yapay serebral spinal sıvı veya ACSF hazırlayın ve bir Airstone ile %5 karbondioksit dengeli oksijen köpürerek 15 dakika veya çözelti tamamen temizlenene kadar oksijen. Her biri 100 mililitre ACSF içeren üç adet 150 mililitrelik gaga hazırlayın.

Bir, aktivite engelleyicileri bir kokteyl ekleyin. Başka bir, mililitre başına bir miligram son konsantrasyonproteaz için Streptococcus fraksiyonu ekleyin. Son kabın için, % 1'lik son konsantrasyona FBS ekleyin ve bir Hava Taşı aracılığıyla %5 karbondioksit dengeli oksijenle oksijenlendirin.

Son olarak, üç uzun saplı Pasteur pipetler azalan çıkış çapları ile açık bir alev üzerinde haddeleme olun. Kafatasını küçük bir makasla açarak ve kortekse zarar vermeden ince keler kullanarak taze beyni çıkararak ötenazili bir fareden beyni ayırın. Kesit boyunca %5 karbondioksit dengeli oksijene bağlı bir Hava Taşı bırakarak beyni soğutulmuş ve oksijenli ACSF'ye yerleştirin.

Vibratom chuck beyin konumlandırın ve 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal kesitler kesti. En az 10 ila 50 etiketli hücre elde etmek için gerektiği kadar kesit toplayın. Bir kabın içine yerleştirilen pamuklu dilim tutucuya dilimler koyun, böylece oksijenli ACSF ile yıkanabilirler.

Bir Hava Taşı kullanarak oksijen köpürtme sırasında aktivite engelleyicileri ile ACSF içeren beher içine dilimleri taşıyın ve oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika blok. Oda sıcaklığında hafif sindirim gerçekleştirmek için proteaz çözeltisi ile ACSF içeren beher için dilimleri taşıyın. Sindirimi takiben, oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika boyunca aktivite engelleyici çözeltisi ile ACSF içeren kabına geri dilimler taşıyarak proteaz yıkayın.

Oksijen köpürmeye devam et. Daha sonra, oda sıcaklığında %1 FBS ile ACSF içeren 100 milimetrelik bir Petri kabı hazırlayın ve mikrodiseksiyon için tek tek bölümleri diske taşıyın. Floresan diseksiyonlar kapsamında, en az 10 ila 50 hücreye sahip alanları ve ilgi katmanlarını mikro parçalara ayırmak için bir çift ince çiş kullanın.

Pasteur pipeti kullanarak, mikro-diseksiyon lu parçaları ACSF çözeltisinde yaklaşık 0,8 mililitre lik 1 FBS içeren 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Oda sıcaklığında mikro-fuge tüpünde parçalanmış dokuyu titre. En büyük ve en küçük çıkış çapı ile biten yanan Pasteur pipetlerin her biri ile yaklaşık 10 vuruş gerçekleştirin.

Ayrık hücreleri oksijenli ACSF içeren 100 milimetrelik petri kabına dağıtın ve hücrelerin yavaş yavaş yerleşmesi için beş ila yedi dakika bekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında GFP ve RFP sinyalini gözlemleyin. Parlak alan aydınlatması altında morfolojiince enkaz tanımlayın.

Az enkaz ile hücrelerin bir alan tespit edildikten sonra, kılcal kullanın ve dil ile tüp vana sının ucunu engelleyerek hücreleri almak için tüp eklemek. Daha sonra kılcal damarı hücrelere yakın konumlandırın. Kılcal damar üzerindeki bloğu serbest bırakın ve kılcal etki kullanarak hücreyi yakalamak için hızlı bir şekilde tekrar bloke edin.

Taze oksijenli ACSF ile 100 milimetrelik Petri kabına kılcal damarı taşıyın ve hücreleri çanağa dağıtmak için floresan optik altında kılcal ucu gözlemlerken yavaşça tüpiçine üfler. Toplama işlemini 100 ila 150 hücre toplanana kadar tekrarlayın ve enkaz gibi kirleticimaddelerin parlak alan diferansiyel girişim kontrast optiklerinde minimum olduğundan emin olun. Son olarak, her seferinde taze bir mikro kılcal pipet kullanarak, tek bir hücre seçin ve en fazla 0,5 mikrolitre içinde bir mikrolitre örnek toplama tampon bir mikrolitre içeren bir mikrolitre astar içeren mikro-fuge tüp içine dışarı.

Hücrenin toplama tamponunda kaldığından emin olmak için pipet ucunu mikro-fuge tüpünde kırın. Tüpleri kuru buzüzerine koyarak hücreleri dondurun. RNA amplifikasyon için işleme kadar eksi 80 derece santigrat derecelik dondurucuda saklayın.

GABAerjik nöronlar fare beyninin cingulet korteksinden izole edildi. Elle sıralanmış nöronlardan güçlendirilen RNA, 200 ile 4 arasında değişmekteve 500 baz çiftinin biraz üzerinde bir tepe dağılımı ile boyut olarak 000 baz çifti olarak değişmektedir. Boncuk arınması ndan sonra, cDNA kütüphanesi, 200 baz çiftinden daha az olan parçaları ortadan kaldırmak için boncuklar kullanılarak ikinci bir arınma turu ile ve yaklaşık 350 baz çiftinin zirvesine kadar sınırlandırılmıştır.

Sıralama, hücre başına ortalama haritalanmış okumasayısının ortalamasıolan 5'e 4,8 çarpı 10 veya 5'inci ortancaya 6,9 çarpı 10 gösterdi. UMI'ler kullanılarak yinelenen RNA kaldırma işleminden sonra, her bir hücrede 1,0 çarpı 10 ile 5.ortanca veya 1.4 çarpı 10 hücre başına ortalama benzersiz okuma vardı. Her bir hücre dış RNA kontrol konsorsiyumunda, numuneye eklenen moleküllerin mutlak sayısını hesaplamak için RNA'daki ani artış iç kontrol olarak kullanılmıştır.

0.92 eğimi ve 0.94'lük ayarlanmış R karesi ile gözlemlenen sayımlarla doğrusal bir girdi ilişkisi vardı. Tek bir nöron başına ortalama 10.000 gen, 6.000'den fazla geni tespit eden tek hücrelerin %95'inden fazlası ile bu prosedür kullanılarak tespit edildi. Bu teknik, geliştirildikten sonra moleküler biyologların farklı iyi karakterize li fare kortikal internöronlarının transkripsiyonu keşfetmelerinin önünü açmış ve hücresel kimliğin kodlanmasından sorumlu belirli gen kategorilerini belirlemİştir.