Name: Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin fare beyninden floresan etiketli GABAerjik nöronları manuel sıralama ile izole etme ve DIVA-Seq kullanarak yüksek derinlikli tek hücreli RNA dizileme yapma yöntemini. Bu teknik hassas nöron tipleri için nazik izolasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH (5R01MH094705-04 ve R01MH109665-01 Z.J.H. için) gelen hibe, CSHL Robertson Neuroscience fon (Z.J.H.) ve NARSAD bulunan Bursu (için A.P.) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının vardır bildirin.

Sıralama iletişim kuralı el ile de seyrek olan nüfus farelerin beyninde etiketli veya aksi takdirde geçerli yüksek üretilen iş hücre kullanarak çalışma mümkün değildir nadir hücre nüfusu temsil eden nöron bir denetimli RNA sıralama için uygundur sıralama ve güçlendirme yöntemleri. FACS için genellikle tabi hücreler kılıf ve örnek satır baskıların ~ 9 – 14 PSI, meme boyutuna bağlı olarak aralığında geçmesi ve olay oranları istenen. Ayrıca, meme üzerine çıkıp, hücreleri sert yüzey koleksiyonu tüp veya kuyu etkisi strese ne...

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) transcriptomic çalışmalar dönüştürdü. Büyük ölçekli tek hücreli RNAseq damlacıkları1,2, havacilik3, nanogrids4ve microwells5, gibi teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilir iken pek çok yöntem tanımlı hücre tipleri sıralama yapamazsınız genetik olarak kodlanmış fluorophores express. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama hücresini seçin popülasyon yalıtmak için sık sık etiketli hücreleri tek hücre modunda sıralama için kullanılır. Ancak, FACS bazı kısıtlamaları vardır ve titiz örnek işlem adımları gerektirir. Birincisi, genellikle çok sayıda giriş hücresi vardır (genellikle milyon başına birkaç hücreleri mL), önemli bir kısmı ile gerekli (> % 15-20) etiketli nüfus içeren. İkinci olarak, hücre hazırlıklar yoğunluk gradient Santrifüjü adımları gliyal kesir, enkaz ve aksi takdirde meme veya akış hücre yapışmasına neden hücre kümeleri kaldırmak için birden fazla mermi gerektirebilir. Üçüncü olarak, FACS genellikle boyama ve adımları Canlı/Boyama (Örneğin, ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iyodür (PI) ve Cytotracker boyalar), hangi ek sefer ölüme destaining kullanır. Dördüncü olarak, kural iki renkli sıralama (örneğin, DAPI ve yeşil/kırmızı floresan protein (GFP/RFP)), genellikle iki örnek ve bir denetim için gerekli gibi istenen fare zorlanma ek olarak işlenecek şekilde etiketlenmemiş bir örnek gerektiren. Beşinci olarak, süzme genellikle birden çok kez önce ve proaktif bir FACS makine tıkanmış örnek satırları önlemek için örnek sıralama sırasında gerçekleştirilir. Altıncı, zamanı başlatmak ve sıvı akışını dengelemek ve damlacık kalibrasyon gerçekleştirmek için en sık kullanılan FACS kurulumları ayrılmış gerekir. Yedinci, denetimi örnekleri genellikle gerçek örnek toplama kadar tazminat matrisler, kütleye ret ayarla, altı ve yedi kendilerini vaktinden adımları gates, vb kullanıcılar da ayarlama veya gerektirir için önce sırayla çalıştırma paralel bir teknisyeni yardımıyla. Son olarak, post-FACS, çoğu zaman sadece tek etiketli hücreleri her kuyuya; bulunduğundan emin olmak için adımlar Örneğin, bir yüksek-içerik tarama kurulum hızlı plaka Imager gibi örnekleri kontrol ederek.
Biz son derece hassas içinde vitro iki tur tarafından takip yordam sıralama a elle yapılan tarif yukarıda özetlenen adımları engelleyecek ve nispeten hızlı, tek fluorescently etiketli nöronlar, küçük bir nüfusa sıralama hedef kolaylaştırmak Çift In vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama adlı amplifikasyon protokolü. RNA amplifikasyon ve cDNA Kütüphanesi nesil Eberwine vd adapte olmuşlardır 6 ve Hashimshony vd. 7, küçük hücresel birimleri var fare interneurons uygun bazı değişiklikler ile; Ayrıca, aynı zamanda eşit eksitatör piramidal nöronların için yararlı olduğunu bulduk.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA Spike-In Kontrol Karışımları</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNA parçalanma tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat # E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute kiti</td><td>Qiagen</td><td>Cat # 74204</td><td></td></tr><tr><td>Antarktika fosfataz</td><td>New England Biolabs</td><td>Kedi # M0289</td><td></td></tr><tr><td>Poli nükleotid kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>Kedi # M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz2, kesik</td><td>New England Biolabs</td><td>Kedi # M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp manyetik ve nbsp boncuk</td><td>Beckman Coulter</td><td>Kedi # A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect boyut seçimi manyetik boncuklar</td><td>Thermo Fisher</td><td>Kedi # B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Kedi # 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Kedi # 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Kedi # 1078</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces griseus'tan Proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # P5147</td><td></td></tr><tr><td>Mesaj Amp II kiti</td><td>Termo Balıkçı Kedi</td><td># AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Karbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat # UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA kiti</td><td>Illumina</td><td>Cat # RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör RNA Pico çipi</td><td>Agilent</td><td>Cat # 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA çipi</td><td>Agilent</td><td>Cat # 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIC optikli floresan ve parlak alan aydınlatmalı diseksiyon mikroskobu. (Leica model MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Model MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Cam mikrokılcal damar: Borosilikat kılcal borular 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, duvar= 0.21 mm, Uzunluk= 150 mm.</td><td>Warner aletleri</td><td>Model GC100-15, Sipariş # 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal pipet çektirme</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom doku soğutma ünitesi</td><td>Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücreli rna sıralama fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift vitro transkripsiyon mutlak sayar (diva-seq) sıralama kullanarak

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) şimdi gen ekspresyonu raporlaması için yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Piyasada bulunan tek hücreli RNA-sıralama platformlar ayrım gözetmeksizin tüm giriş hücresi işlemek. Bazen, floresans aktif hücre (FACS) sıralama akıntıya karşı faiz özel olarak etiketlenmiş bir nüfusa izole etmek için kullanılır. Bir FACS önemli ölçüde etiketli kesirli sayıları, giriş hücresi sayısının fazlalığı için ihtiyaç hangi toplamak ve nadir veya seyrek etiketli nöron popülasyonları--dan fare beyin profil oluşturma zordur kısıtlamasıdır. Burada, el ile fluorescently tek neurons taze etiketli seyrek toplama fare beyin dokusu ayrışmış için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlem için esir alma tek etiketli nöronlar yüksek saflıkta ve endojen transkript oranları korur bir vitro amplifikasyon transkripsiyon tabanlı iletişim kuralı ile sonraki entegrasyon sağlar. Biz bireysel mRNA sayar oluşturmak için benzersiz molekül tanımlayıcıları (UMIs) kullanan bir çift doğrusal amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Yüksek derecede gen algılama tek hücre başına amplifikasyon sonuçlarında iki mermi.

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, GABAergic nöronlar el ile edildi (Şekil 1) sıralanmış ve RNA güçlendirilmiş sonra cDNA Kütüphanesi (Şekil 2) yaptım.. yüksek derinliği8' de sıralı. Güçlendirilmiş RNA (aRNA) ürünleri değişmekteydi arasında 200 – 4000 bp boyutunda bir tepe dağıtım biraz üzerinde 500 ile bp (Şekil 3A). Boncuk saf cDNA Kütüphanesi daha fazla boyutu...

Bu iletişim kuralı vitro transkripsiyon tabanlı mRNA amplifikasyon yüksek-derinlik tek hücreli RNA sıralama için ardından tek fluorescently etiketli nöronların izole etmek için yordam sıralama kılavuzu açıklanır.

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Bu yöntem, tek nöron izolasyon u ve sıralama alanında önemli bir engeli çözmeye yardımcı olabilir. Örneğin, kullanıcı tanımlı beyin bölgesinden belirli bir popülasyon veya floresan olarak etiketlenmiş nöron alt popülasyonu toplamak gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek bir nöronun enkazları kirletmeden yakalanmasını sağlamasıdır.Aynı zamanda nispeten nazik, hangi hızlı bir şekilde geleneksel FACS sıralama sıvı basınçlarına tabi ölmek kırılgan nöron tipleri için önemlidir. Kılcal bir çekmece kullanarak 10 ila 15 mikron çıkış çapı ile çekilmiş cam mikrokapiller hazırlayarak başlayın. İstenilen tahta çapı elde etmek için kılcal ucu kesmek için ince makas kullanın.Daha sonra 0,8 milimetre iç çapı 0,8 milimetre lik esnek silikon borunun 120 ila 150 santimetre uzunluğundaki kısmını 0,2 mikron PVDF membran şırınga filtresine ve iki yönlü boru vanasına takmak için boru konektörlerini kullanın. 500 mililitre soğutulmuş yapay serebral spinal sıvı veya ACSF hazırlayın ve bir Airstone ile %5 karbondioksit dengeli oksijen köpürerek 15 dakika veya çözelti tamamen temizlenene kadar oksijen. Her biri 100 mililitre ACSF içeren üç adet 150 mililitrelik gaga hazırlayın.Bir, aktivite engelleyicileri bir kokteyl ekleyin. Başka bir, mililitre başına bir miligram son konsantrasyonproteaz için Streptococcus fraksiyonu ekleyin. Son kabın için, % 1'lik son konsantrasyona FBS ekleyin ve bir Hava Taşı aracılığıyla %5 karbondioksit dengeli oksijenle oksijenlendirin.Son olarak, üç uzun saplı Pasteur pipetler azalan çıkış çapları ile açık bir alev üzerinde haddeleme olun. Kafatasını küçük bir makasla açarak ve kortekse zarar vermeden ince keler kullanarak taze beyni çıkararak ötenazili bir fareden beyni ayırın. Kesit boyunca %5 karbondioksit dengeli oksijene bağlı bir Hava Taşı bırakarak beyni soğutulmuş ve oksijenli ACSF'ye yerleştirin.Vibratom chuck beyin konumlandırın ve 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal kesitler kesti. En az 10 ila 50 etiketli hücre elde etmek için gerektiği kadar kesit toplayın. Bir kabın içine yerleştirilen pamuklu dilim tutucuya dilimler koyun, böylece oksijenli ACSF ile yıkanabilirler.Bir Hava Taşı kullanarak oksijen köpürtme sırasında aktivite engelleyicileri ile ACSF içeren beher içine dilimleri taşıyın ve oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika blok. Oda sıcaklığında hafif sindirim gerçekleştirmek için proteaz çözeltisi ile ACSF içeren beher için dilimleri taşıyın. Sindirimi takiben, oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika boyunca aktivite engelleyici çözeltisi ile ACSF içeren kabına geri dilimler taşıyarak proteaz yıkayın.Oksijen köpürmeye devam et. Daha sonra, oda sıcaklığında %1 FBS ile ACSF içeren 100 milimetrelik bir Petri kabı hazırlayın ve mikrodiseksiyon için tek tek bölümleri diske taşıyın. Floresan diseksiyonlar kapsamında, en az 10 ila 50 hücreye sahip alanları ve ilgi katmanlarını mikro parçalara ayırmak için bir çift ince çiş kullanın.Pasteur pipeti kullanarak, mikro-diseksiyon lu parçaları ACSF çözeltisinde yaklaşık 0,8 mililitre lik 1 FBS içeren 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Oda sıcaklığında mikro-fuge tüpünde parçalanmış dokuyu titre. En büyük ve en küçük çıkış çapı ile biten yanan Pasteur pipetlerin her biri ile yaklaşık 10 vuruş gerçekleştirin.Ayrık hücreleri oksijenli ACSF içeren 100 milimetrelik petri kabına dağıtın ve hücrelerin yavaş yavaş yerleşmesi için beş ila yedi dakika bekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında GFP ve RFP sinyalini gözlemleyin. Parlak alan aydınlatması altında morfolojiince enkaz tanımlayın.Az enkaz ile hücrelerin bir alan tespit edildikten sonra, kılcal kullanın ve dil ile tüp vana sının ucunu engelleyerek hücreleri almak için tüp eklemek. Daha sonra kılcal damarı hücrelere yakın konumlandırın. Kılcal damar üzerindeki bloğu serbest bırakın ve kılcal etki kullanarak hücreyi yakalamak için hızlı bir şekilde tekrar bloke edin.Taze oksijenli ACSF ile 100 milimetrelik Petri kabına kılcal damarı taşıyın ve hücreleri çanağa dağıtmak için floresan optik altında kılcal ucu gözlemlerken yavaşça tüpiçine üfler. Toplama işlemini 100 ila 150 hücre toplanana kadar tekrarlayın ve enkaz gibi kirleticimaddelerin parlak alan diferansiyel girişim kontrast optiklerinde minimum olduğundan emin olun. Son olarak, her seferinde taze bir mikro kılcal pipet kullanarak, tek bir hücre seçin ve en fazla 0,5 mikrolitre içinde bir mikrolitre örnek toplama tampon bir mikrolitre içeren bir mikrolitre astar içeren mikro-fuge tüp içine dışarı.Hücrenin toplama tamponunda kaldığından emin olmak için pipet ucunu mikro-fuge tüpünde kırın. Tüpleri kuru buzüzerine koyarak hücreleri dondurun. RNA amplifikasyon için işleme kadar eksi 80 derece santigrat derecelik dondurucuda saklayın.GABAerjik nöronlar fare beyninin cingulet korteksinden izole edildi. Elle sıralanmış nöronlardan güçlendirilen RNA, 200 ile 4 arasında değişmekteve 500 baz çiftinin biraz üzerinde bir tepe dağılımı ile boyut olarak 000 baz çifti olarak değişmektedir. Boncuk arınması ndan sonra, cDNA kütüphanesi, 200 baz çiftinden daha az olan parçaları ortadan kaldırmak için boncuklar kullanılarak ikinci bir arınma turu ile ve yaklaşık 350 baz çiftinin zirvesine kadar sınırlandırılmıştır.Sıralama, hücre başına ortalama haritalanmış okumasayısının ortalamasıolan 5'e 4,8 çarpı 10 veya 5'inci ortancaya 6,9 çarpı 10 gösterdi. UMI'ler kullanılarak yinelenen RNA kaldırma işleminden sonra, her bir hücrede 1,0 çarpı 10 ile 5.ortanca veya 1.4 çarpı 10 hücre başına ortalama benzersiz okuma vardı. Her bir hücre dış RNA kontrol konsorsiyumunda, numuneye eklenen moleküllerin mutlak sayısını hesaplamak için RNA'daki ani artış iç kontrol olarak kullanılmıştır.0.92 eğimi ve 0.94'lük ayarlanmış R karesi ile gözlemlenen sayımlarla doğrusal bir girdi ilişkisi vardı. Tek bir nöron başına ortalama 10.000 gen, 6.000'den fazla geni tespit eden tek hücrelerin %95'inden fazlası ile bu prosedür kullanılarak tespit edildi. Bu teknik, geliştirildikten sonra moleküler biyologların farklı iyi karakterize li fare kortikal internöronlarının transkripsiyonu keşfetmelerinin önünü açmış ve hücresel kimliğin kodlanmasından sorumlu belirli gen kategorilerini belirlemİştir.

single-cell-rna-sequencing-fluorescently-labeled-mouse-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, floresan olarak işaretlenmiş nöronları bir fare beyninden izole etmek için bir yöntem gösterilmektedir.

Murin Beyninden Floresan Etiketli Nöronların İzole Edilmesi

Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Nöral kök hücreleri (NSC'ler) ve soylarını yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izole etmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tabanlı bir yöntem bildiriyoruz. Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) transgenik farelere uygulandığında, canlı görüntüleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Burada, floresan ile aktive olmuş çekirdekler (FAN) sıralama yoluyla çoğu nöronu dışlayan fare dentat girusundan izole edilen tek çekirdekleri sıralamak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli ekspresyon profilleri oluşturur ve nöral kök hücreler gibi kıt popülasyonlar da dahil olmak üzere niş içinde temsil edilen diğer hücre tiplerinin çoğunun incelenmesini kolaylaştırır.

Hipokampal Nörojenik Nişi İncelemek için Tek Çekirdekli RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Negatif Nöronik Sıralama

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Öğrenin fare beyninden floresan etiketli GABAerjik nöronları manuel sıralama ile izole etme ve DIVA-Seq kullanarak yüksek derinlikli tek hücreli RNA dizileme yapma yöntemini. Bu teknik hassas nöron tipleri için nazik izolasyon sağlar.

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak (Video) | JoVE Journal

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Daha fazla video keşfet