Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.

Herkese merhaba, benim adım Dr.Bipasha Bose. Ben bir doçent olarak çalışmak ve Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Merkezi, Yenepoya Araştırma Merkezi, Yenepoya Üniversitesi, Mangalore, Hindistan sorumlu. Şimdi, çeşitli dozlarda ultraviyole-C radyasyonuna maruz kalan fare oküler yüzeylerinden canlı kültürlerde reaktif oksijen türlerinin ROS'un varlığını nasıl tespit edebileceğimizi göstereceğiz.

Bu tekniğin avantajı, burada aynı anda reaktif oksijen türlerinin varlığı için tespit edebilirsiniz, canlı ve ölü hücreler, Vester hücreleri gerek kalmadan. Bu tekniğin prensibi esas olarak boya DCFDA canlı hücre geçirgenliği yatıyor. DCFDA canlı hücre permeant renksiz boya, oksidatif stres sırasında hücre içi oksidazlar tarafından üzerine hareket alır ve yeşil floresan DCF dönüştürülür alır.

Bu nedenle, yeşil floresans bize canlı hücrelerde reaktif oksijen türlerinin varlığı için tespit sağlar. Öte yandan, propidium iyodür sadece ölü bir hücre permeant boya olan floresan kırmızı. Bu bir rDNA çift iplikçikli intercalating boya.

Ancak, boya Hoechst hem canlı hem de ölü hücreler için perkasted olduğunu. Mavi renkli bir nükleer leke. Bu nedenle, bu ölü hücrelerin değerlendirilmesi ile birlikte bir zaman bağımlı bir şekilde uzun vadeli kültürlerde reaktif oksijen türlerinin varlığı için tespit edebilirsiniz çok basit bir yöntemdir.

Plaka noktası 35 milimetrelik kültür yemekleri başına iki milyon hücre. Uyguladığımız hücreler fare oküler yüzeyindeki hücreler. Hücre kültürü yemeklerinin her birinden maksimum ortam hacmini çıkarın.

Hücrelerle yakın temas halinde hücre kültürü ortamının yaklaşık 500 mikrolitresini geride bırakın. En az miktarda ortam hücrelerin kurumasını önleyecektir. Ancak, ortam en az miktarda amacı UVC maruz maksimum penetrasyon sağlamaktır.

Bir UV kaynağı altında hücreleri alın, ya bir UV Crosslinker olabilir, ya da başka bir ultraviyole-C kaynağı olabilir. Bir, 10, 100, 1, 000 ve metre kare başına 10, 000 joule gibi UVC radyasyon farklı dozaj hücreleri maruz. Hücreler ultraviyole-C radyasyonuna maruz kaldığında, kapaklar açık pozisyonda olmalıdır.

Bu hücrelere ultraviyole-C maksimum penetrasyon sağlayacak ve dolayısıyla ultraviyole-C radyasyon hücrelerinin optimal doz-yanıt göstermek. Hücreleri laminar hava akışı başlığına getirin ve iki mililitre tam ortamla her yemeği yenile. Bu tam medya Içerir 20%fetal sığır serumU DMEM, gibi takviyeleri ile takviyeler 1%minimum esansiyel olmayan amino asitler, ve ayrıca% 1 penisilin ve streptomisin antibiyotik.

Daha sonra, maksimum hacim ile yenilenme sonra, tam medya iki mililitre, ultraviyole-C radyasyonun erken etkilerini görmek için üç saatlik bir süre için kuvöz ve kuluçka plakaları iade. UvC hücre kuluçka sonrası üç saat son 15 dakika içinde canlı hücre boyama ortamı hazırlayın. Boyama ortamı 37 dereceye kadar önceden ısıtılmış DMEM içeren %10 FBS'de hazırlanır.

Boyama medya 10 mililitre yapmak için, ilk dcfda beş mikrolitre eklemek 10 milimolar bir stok böylece beş mikromolar son konsantrasyon elde etmek için. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. İkinci olarak, mL başına beş mikrogram lık son konsantrasyonelde etmek için mL başına 10 miligramlık bir stoktan beş mikrolitre Hoechst çözeltisi ekleyin.

Şimdi yukarı ve aşağı borular yaparak iyice karıştırın. Son olarak mL başına 20 mikrogram lık son konsantrasyonelde etmek için mL başına bir miligramlık bir stoktan 200 mikrolitre propidium iyodür ekleyin. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.

Şimdi boyama çözeltisi kullanıma hazırdır. UVC'ye maruz kaldıktan sonra üç saatlik kuluçka dan sonra, plakaları CO2 kuluçka makinesinden çıkarın. Bir, 10, 100, 1, 000 ve metre kare başına 10,000 joule gibi UVC çeşitli dozda maruz kalmış yemeklerin her birinden medya aspire.

Şimdi yemeklerin kenarlarından hafifçe her tabak için taze hazırlanmış canlı hücre boyama medya iki mililitre ekleyin. Plakaları tekrar CO2 kuluçka makinesine geri verin ve canlı hücre boyama için 15 dakika kuluçkaya yatırın. Canlı hücre boyama ortamlarında 15 dakikalık kuluçkadan sonra, farklı dozlarda ultraviyole-C radyasyonuna maruz kalan hücreleri içeren her bir yemekten boyama ortamını çıkarın.

Hücreleri iki mililitre tam ortamla doldurun. Artık hücreler görüntülemeye hazır. Şimdi kontrol hücrelerini floresan görüntüleyicinin parlak alanının altına yerleştirin.

Kontrol hücreleri oldukları için hücreler normal görünüyor. Mavi alanın altında toplam hücreleri floresan olabilir. Yeşil alanın altında ROS nesil gösterir.

Bunlar kontrol hücreleri olduğundan, üretilen ROS yoktur. Kırmızı alanın altında, propidium iyodür lekeli ölü hücreler görülebilir. Sonra UV parlak alan altında metre kare başına 100 joule maruz tutun.

Mavi alanın altında, ve ayrıca mavi alanın altındaki toplam hücre numarasını görebiliriz. Ancak, yeşil alana maruz kaldığımız zaman DCFDA pozitif hücreler görülür ve ayrıca PI pozitif ölü hücreler görülür. Son olarak, maksimum UV dozu yerleştirin, yani 10, 000 joule metre kare maruz hücreleri başına, parlak alan altında.

Anormal hücre morfolojisini görebiliyoruz. Ancak, mavi alanın altında toplam mavi hücreleri görebilirsiniz. Yeşil alanın altında, yeşil floresan DCFDA pozitif hücreler ROS kuşağını gösterir.

Hücreler kırmızı alana maruz kaldığında, tüm hücreler, hücreler UV dozunun metre karebaşına 10,000 joule ile tedavi edildiğinde hücre ölümü çok sayıda gösteren kırmızı floresan edildi. Şimdi ultraviyole-C dozları ve maruz kalan kontroller karşılık gelen tek bir kompozit görüntü paneli içine çeşitli kanallarda yakalanan görüntüleri düzenlemek. Görüntüler grup halinde tek bir panel halinde düzenlenmiştir.

İlk olarak, parlak alan. İkincisi, Hoechst mavi nükleer lekesi. Üçüncüsü, ölü çekirdekler için propidium iyodür boyama.

Dördüncü, ROS pozitif hücreler için DCFDA. Ve beşincisi, birleştirilmiş görüntü. Görüntülerin birinci ve ikinci satırına baktığımızda, maruz kalmamış kontrol ve UVC dozuna maruz kalan hücreler metre kare başına bir joule, biz ışıklı vardı ne PI ne de ROS pozitif hücreler olduğunu gözlemledik, bu nedenle maruz kalmamış kontrollerde ROS ve hücre ölümü tam bir yokluğu gösteren ve metre kare başına bir joule gibi düşük UVC dozu.

Şimdi metre kare başına 100 joule maruz kalan hücrelerin kompozit görüntülerin üçüncü satırı geliyor. Hücrelerin çok düşük bir yüzdesi, yaklaşık 10% bu dozda hem PI ve DCFDA için pozitif, böylece ROS üretimi ve hücre ölümü düşük miktarda gösteren. Şimdi uvc radyasyona maruz kalma daha yüksek bir doz için hareket, kompozit görüntünün dördüncü satırında belirtildiği gibi metre kare başına 1.000 joule.

Burada, hücrelerin yaklaşık% 70 PI ve DCFDA için pozitif. Son olarak, kompozit görüntünün beşinci satırında temsil edildiği gibi, en yüksek dozda UVC maruziyetine geçiyoruz, yani metre karebaşına 10,000 joule. Burada hücrelerin neredeyse% 100 pi ve DCFDA için pozitif olduğunu bulmak, böylece bir gösteren 100%hücre ölümü ve ROS üretimi bu özel UVC dozda.

Görüntüleri görüntüleme yazılımına aktarın. Önce Hoescht lekeli çekirdekleri gösteren mavi görüntüyü açın, bu hücrelerin toplam sayısıdır. Sayma aracını açın ve sayıya sahip olmak için hücrelerin her birini teker teker tıklatın.

Şimdi PI pozitif ölü hücreleri gösteren kırmızı kanal altında yakalanan görüntüyü açın. Sayma aracını açın ve PI pozitif ölü hücrelerin sayısını gösteren kırmızı noktaların her birini tıklatın. Ölü hücrelerin sayımı bittikten sonra, yakalanan yeşil kanala tıklayın ve sayma aracını açın ve ROS neslini gösteren hücreleri gösteren yeşil noktaların her birini tıklatın.

Yeşil kanal altında yakalanan yeşil hücrelerin sayımını tamamlayın ve formülü kullanarak UVC hasarı ve UVC hasarı ile ROS üretim yüzdesi ile hücre ölüm yüzdesi sayıştırın. Bu, 100 ile çarpılır Hoechst pozitif hücrelerin sayısına bölünen kırmızı floresan hücreleri olan PI pozitif hücrelerin basit formül numarası kullanılarak hesaplanır. UV hasarına göre ROS üretim yüzdesi formülü kullanılarak hesaplanır, DCFDA pozitif sayısı, veya yeşil floresan hücreleri, Hoechst pozitif hücrelerin sayısı 100 ile çarpılır bölünür.

Hücre ölüm yüzdesi ve ROS üretim yüzdesi olmak üzere her iki yüzdeye de sahip olduktan sonra, bir çubuk grafiği çizmek için bu değerleri kullanın. X ekseni UV dozajını, y ekseni ise hücrelerin yüzdesini gösterir. Yeşil çubuklar ROS neslinin yüzdesini gösterirken, kırmızı çubuk hücre ölüm yüzdesini gösterir.

Analiz üzerine, UVC dozu 100 joule%10 ROS üreten hücre nin yanı sıra %10 hücre ölümü olduğu açıktır. UVC dozu 10 metre kare başına üç joule yükseltilmiş ise, 70% hücreleri ROS üretimi yanı sıra hücre ölümü sergiledi. UVC en yüksek dozda iken, yani 10 metre kare başına dört joule yükseltilmiş, yaklaşık% 100 hücreleri hücre ölümü yanı sıra ROS üretimi sergiledi.

Bu nedenle, ROS üretimi ile hücre ölümü arasında güçlü bir pozitif korelasyon olduğu sonucuna varılabilir. Sonuç olarak, bu teknik reaktif oksijen türlerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için çok kullanışlıdır, canlı ve ölü hücreler canlı, normal olay kültürü. Bu teknik aynı zamanda reaktif oksijen türlerinin sınırlı değerlendirilmesi için yararlıdır, canlı ve ölü hücreler, ultraviyole radyasyon gibi çeşitli hücre zararlı ajanlar maruz kalmış uzun vadeli kültürlerde, veya kimyasal ajanlar.

Ve bu teknik aynı zamanda pcr ve Batı lekeleme qr gibi birçok downstream uygulamaları için olabilir gibi% 50 ROS, % 75 ROS, vb ve benzeri olarak hücreleri hasat için en uygun zamanı belirlemek için bir araştırmacı rehberlik edebilir.