Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, açık kaynaklı yazılımlar ve temel enstrümantasyon kullanarak, otomatik bir çok kuyucuklu plaka iş akışında zaman kapılı floresan ömür görüntüleme mikroskobisinin veya FLIM'in nasıl uygulanacağını göstermektir. Bu metodoloji, bir dizi tespit edilmiş veya canlı hücredeki FLIM tabanlı okumalara uygulanabilir. Özellikle hücre sinyal işlemesini veya protein etkileşimlerini okumak için yararlıdır.

Bu tekniğin temel avantajları, FLIM'in güçlü kantitatif okumalar sağlaması ve tek bir ölçümde etkileşim popülasyonu fraksiyonunu verebilmesidir. Yüzlerce görüş alanı boyunca binlerce hücreye global analiz tekniklerinin uygulanması, Förster rezonans enerji transferi veya FRET okumalarından yararlanmamıza olanak tanır. Ayrıca, örneğin, yaklaşık 20 pikosaniyeye kadar olan ömür değişimlerinden faydalanılabilir.

Frederik Gorlitz ile prosedürü uygulamayı gösterecek kişiler, araştırma görevlimiz Sunil Kumar ve yazılım geliştiricimiz Ian Munro olacaktır. Öncelikle micromanager'ı başlatın ve openFLIM-HCA eklentisini açın. FLIM kontrol sekmesi altında, "delay box calibration file" (gecikme kutusu kalibrasyon dosyası) seçeneğini belirleyin ve kalibrasyon dosyalarını açın.

Geciktirme jeneratörü ünitesi ve ilgilenilen lazer tekrarlama hızının spesifik kombinasyonu için uygun kalibrasyon dosyasını seçin. Dosya menüsü altından temel klasörü ayarla seçeneğini seçin ve verilerin kaydedileceği klasörü belirleyin. Tüm uygun parametrelerin ayarlandığını onayladıktan sonra, tüm deney boyunca kapılı optik yoğunlaştırıcı kontrol kutusundan manuel olarak dört nanosaniyelik bir kapı genişliği ayarlayın.

Enstrüman yanıt fonksiyonu görüntü verilerini elde etmek için, herhangi bir lazer ışığının dışarı çıkmasını önlemek amacıyla objektiften önce filtre küp kasedine manuel olarak bir ışın bloğu yerleştirin ve mikroskop gövdesine geri yansımayı minimize etmek için ışın bloğunu uygun açıyla konumlandırın. Işık yolu kontrol sekmesi altında; dönen Nipkow diskinden saçılan eksitasyon ışığı fraksiyonunun, en az 200 milisaniye kamera entegrasyon süresinde sistemi doyurmadan görüntülenebileceği şekilde, dönen disk ünitesindeki eksitasyon, dikroik ve emisyon filtrelerini ayarlayın. FLIM kontrol sekmesi altında, programlanabilir hızlı geciktirme kutusu tarafından kapsanan gecikme aralıklarının tamamı üzerinde maksimum nokta bulma (find max point) fonksiyonunu kullanın.

Ardından görüntülenen çıktı izini kontrol edin. Tam cihaz yanıt fonksiyonu profilinin, hızlı geciktirme kutusunun tarama aralığı içerisinde olması için kurs gecikme sürelerini ayarlayın. Nötr yoğunluk ve pozlama süresi parametrelerini düzenleyin.

Kamera, parlaklık zaman kapısında doygunluğa ulaşmasın ve etkin entegrasyon süresi 200 milisaniyeden az olmasın diye kare birikimini ayarlayın. FLIM kontrol menüsü altında, hızlı geciktirme kutusunu seçin ve tüm geciktirme aralığı boyunca 25 pikosaniyelik geciktirme adımları belirleyin. Ardından, geciktirmeleri doldur seçeneğini seçin ve bir cihaz yanıt fonksiyonu görüntüsü elde etmek için FLIM görüntüsü al düğmesine tıklayın.

Ve görüntüleme tamamlanana kadar bekleyin. Işık yolu kontrol menüsü altından nötr yoğunluğu seçin ve lazeri engellemek için engellendiye (blocked) tıklayın. FLIM kontrol menüsünü açın ve artış kutusundaki değeri yükselterek gecikme adımlarının sayısını azaltmak için hızlı gecikme kutusunu seçin.

Ardından, bir arka plan kamera görüntüsü almak için snap FLIM image seçeneğine tıklayın. Referans boya verilerini elde etmek için XYZ kontrol sekmesine gidin ve go to well iletişim kutusuna H4 kuyusunu girin. Daha sonra, ışık yolu kontrol sekmesine gidin ve fast delay kutusunun tüm aralığı boyunca find max point işlevini kullanarak, M turquoise floresan proteinini görüntülemek için uygun eksitasyon, dikroik ve emisyon filtrelerini seçin.

Ardından, az önce gösterildiği gibi referans boy verilerini ve buna karşılık gelen bir arka plan görüntüsünü elde etmek için uygun parametreleri ayarlayın. Çok kuyucuklu bir plaka örneğinden FLIM verileri elde etmek için HCA sıralı veri toplama kurulum menüsüne gidin. XYZ konumları sekmesini seçin ve hangi kuyucukların görüntüleneceğini ve kuyucuk başına elde edilecek görüş alanı sayısını belirleyin.

Görüntülenecek örneği içeren temsili bir görüş alanı seçin ve okuma kamerasının dinamik aralığının %75'ine ulaşmak için kameranın entegrasyon süresindeki optimal nötr yoğunluk filtresini ayarlayın. XYZ kontrol sekmesi altında, otomatik odaklama iletişim kutusunda odak kontrolünü geri getir seçeneğini belirleyin ve mikroskobu ilgilenilen hücrelere veya yapılara manuel olarak odaklayın. Otomatik odaklama arama aralığını 2000 micrometers olarak ayarlayın ve enter tuşuna basın.

Ardından, otomatik odaklama işlemini başlatmak için AF now seçeneğine tıklayın. Focus offset auto focus alanında bir ofset değeri görünecektir. Bu ofset değerini AF offset penceresine girin ve otomatik odaklama işlemini tekrarlamak için AF now seçeneğine iki kez tıklayın.

Ofset değerleri artık sıfıra ayarlanmış olmalıdır; bu durum, oto odaklama sisteminin doğru çalıştığını gösterir. Ardından, FLIM kontrol sekmesi altında, gecikme noktalarının logaritmik örneklemesini sağlamak için autogating fonksiyonunu seçin. Birikimli kare sayısını (accumulate frames), istenen toplam veri toplama süresini sağlayacak bir değere ayarlayın.

Ardından, FLIM edinme iletişim kutusunda, FLIM çoklu kuyucuklu plaka edinimini gerçekleştirmek ve az önce gösterildiği gibi bir arka plan kamera görüntüsü almak için HCA sekansını başlat düğmesine tıklayın. Burada, co-hücrelerde eksprese edilen model fret sistemi ve çoklu kuyucuklu plaka kullanılarak gerçekleştirilen temsili bir FLIM fret analizi, her kuyucukta görülen tipik görüş alanlarının otomatik olarak edinilmiş floresan ömür görüntüleri örnekleriyle birlikte gösterilmektedir. Bu deneyde, negatif kontrol kuyucukları en uzun ömürleri sergilemiş ve donör ömürleri, en kısa linker uzunluklarına sahip fret konstrüktlarında en düşük değerleri göstermiştir.

Genel olarak, her kuyucuktaki tüm görüş alanları üzerinden ortalaması alınan ortalama ömür, çok kuyucuklu plakalar genelinde farklılık göstermiştir. A1 kuyucuğunda görüntülenen tüm hücreler üzerinden donör floresan yoğunluk azalma profilinin ortalamasının alınması, tek eksponansiyel azalma modeli ve cihaz yanıt fonksiyonu ile yapılan uyumla birlikte, uyum modelinin geçerli olduğunu göstermektedir. Çok kuyucuklu plakanın her bir sütunu için piksel bazlı tek eksponansiyel uyumdan elde edilen ortalama floresan ömrünün daha detaylı analizi, farklı FRET verimlilikleri içeren bir deneyi simüle ederek, daha kısa linker uzunluğuna sahip FRET konstrüktlarında ömrün azaldığını kanıtlamaktadır.

Bu deneyde, farklı inhibitörlerin protein oligomerizasyonu üzerindeki etkisine yönelik bir FRET analizinden elde edilen FLIM verileri, tekil eksponansiyel sönümlenme modeli ile uydurulmuştur. Floresans ömür plaka haritası, sekiz görüş alanı boyunca ortalaması alınan kuyu başına ortalama ömrü göstermektedir. Kuyu başına dört görüş alanının görüntülendiği küçük bir set ile, cihaz yanıt fonksiyonunun ve referans boya verilerinin elde edilme süresi ile FLIM fit üzerinde analizlerin yürütülme süresi dahil olmak üzere FLIM analizimiz yaklaşık iki buçuk saatte tamamlanabilmektedir.

Bir FLIM analizi gerçekleştirirken, FLIM verilerini analiz etmek için gerekli tüm bilgilere sahip olmak adına, cihaz tepki fonksiyonu ve referans boya verilerini arka plan görüntüleriyle birlikte elde etmeyi hatırlamak önemlidir. Açık kaynaklı yazılımımız FLIM fit kullanılarak, bu verilerin daha karmaşık sönümlenme modellerine uydurulması da mümkündür. Bu durum, örneğin, FRET popülasyon fraksiyonunun belirlenmesine olanak tanır.

FLIM HCA teknolojimiz, ilaç keşfi topluluğundaki araştırmacıların fret ölçümlerini güvenilir bir şekilde yapmalarına yardımcı olmaktadır. Gelecekte bu teknolojinin, hücre tabanlı deneylerde disosiyasyon sabitlerinin ölçülmesine olanak sağlamasını umuyoruz. Bu video makalesinin ve Wiki sayfamızdaki bilgilerin, diğer araştırmacıların kendi FLIM HCA cihazlarını kurmalarına ve bunu fret ile diğer deneylere uygulamalarına yardımcı olmasını temenni ediyoruz.

Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu tür cihazlar kullanılırken tüm lazer ışınlarının muhafaza altına alınması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.