Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi
18 Ocak 2017
Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.
Bu prosedürün genel amacı, açık kaynaklı yazılım ve temel enstrümantasyon kullanılarak otomatik çok kuyulu plaka iş akışında zaman kapılı floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunun veya FLIM'in nasıl uygulanacağını göstermektir. Bu metodoloji, bir dizi sabit veya canlı hücredeki FLIM tabanlı okumalara uygulanabilir. Ve özellikle hücre sinyal işlemesini veya protein etkileşimlerini okumak için kullanışlıdır.
Bu tekniğin temel avantajları, FLIM'in sağlam kantitatif okumalar sağlaması ve tek bir ölçümde etkileşim popülasyon fraksiyonu sağlayabilmesidir. Yüzlerce görüş alanı boyunca binlerce hücreye küresel analiz teknikleri uygulamak, foster reçine enerji transferini veya FRET okumalarını kullanmamızı sağlar. Ve örneğin, kullanım ömrü değişikliklerinden yaklaşık 20 pikosaniyeye kadar düşüyor.
Frederik Görlitz ile prosedürü göstermek, araştırma ortağımız Sunil Kumar ve yazılım geliştiricimiz Ian Munro olacak. Mikro yöneticiyi başlatarak başlayın ve openFLIM-HCA eklentisini açın. FLIM kontrol sekmesi altında, gecikme kutusu kalibrasyon dosyasını seçin ve kalibrasyon dosyalarını açın.
Gecikme jeneratörü ünitesi ve ilgilenilen lazer tekrarlama oranının belirli kombinasyonu için kalibrasyon dosyasını seçin. Dosya menüsü altında, temel klasörü ayarla'yı seçin ve verilerin kaydedileceği klasörü seçin. Tüm uygun parametrelerin ayarlandığını onayladıktan sonra, tüm deney için kapılı optik yoğunlaştırıcı kontrol kutusunda dört nanosaniyelik bir kapı genişliğini manuel olarak ayarlayın.
Cihaz tepki fonksiyonu görüntü verilerini elde etmek için, herhangi bir lazer ışığının kaçmasını önlemek için objektiften önce filtre küpü kasetine manuel olarak bir ışın bloğu yerleştirin ve mikroskop çerçevesine herhangi bir yansımayı en aza indirmek için ışın bloğunu açın. Işık yolu kontrol sekmesi altında, dönen disk ünitesindeki uyarma, dikroik ve emisyon filtrelerini, dönen Nipkow diskinden saçılan uyarma ışığı fraksiyonu, sistemi en az 200 milisaniye kamera entegrasyon süresi boyunca doyurmadan görüntülenebilecek şekilde ayarlayın. FLIM kontrol sekmesi altında, programlanabilir hızlı gecikme kutusunun kapsadığı tüm gecikmeler aralığında maksimum noktayı bul işlevini kullanın.
Ardından görüntülenen çıktı izini kontrol edin. Ve rota gecikme sürelerini, tam cihaz yanıt fonksiyonu profili, hızlı gecikme kutusunun tarama aralığı içinde olacak şekilde ayarlayın. Nötr yoğunluk ve pozlama süresi parametrelerini ayarlayın.
Çerçeve birikiminin yanı sıra, kameranın parlaklık zaman kapısına doygun olmaması ve etkili entegrasyon süresinin 200 milisaniyeden az olmaması için. FLIM kontrol menüsü altında, hızlı gecikme kutusunu seçin ve tam gecikme aralığında 25 pikosaniye gecikme adımı ayarlayın. Ardından, gecikmeleri doldur'u seçin ve bir cihaz yanıt işlevi görüntüsü elde etmek için FLIM görüntüsünü yakala'ya tıklayın.
Ve satın alma tamamlanana kadar bekleyin. Işık yolu kontrol menüsü altında, nötr yoğunluğu seçin ve lazeri engellemek için engellendi'ye tıklayın. FLIM kontrol menüsünü açın ve artış kutusundaki değeri artırarak gecikme adımlarının sayısını azaltmak için hızlı gecikme kutusunu seçin.
Ardından, bir arka plan kamerası görüntüsü elde etmek için FLIM görüntüsünü yakala'yı tıklayın. Referans kalıp verilerini almak için XYZ kontrol sekmesine gidin ve kuyuya git iletişim kutusuna H4 kuyusunu girin. Ardından, ışık yolu kontrol sekmesine gidin ve hızlı gecikme kutusunun tüm aralığı boyunca maksimum nokta bulma işlevini kullanarak M turkuaz floresan proteinini görüntülemek için uygun uyarma, dikroik ve emisyon filtrelerini seçin.
Ardından, referans kalıp verilerini ve karşılık gelen bir arka plan görüntüsünü almak için uygun parametreleri az önce gösterildiği gibi ayarlayın. FLIM verilerini çok kuyulu bir plaka örneğinden almak için, kurulum HCA sıralı alım menüsüne gidin. XYZ konumları sekmesini seçin ve hangi kuyuların görüntülenmesi gerektiğini ve kuyu başına alınacak görüş alanı sayısını ayarlayın.
Görüntülenecek örneği içeren temsili bir görüş alanı seçin ve kameranın entegrasyon süresinde optimum nötr yoğunluk filtresini, okuma kamerasının dinamik aralığının %75'ine ulaşacak şekilde ayarlayın. XYZ kontrol sekmesi altında, otomatik netleme iletişim kutusunda odak kontrolüne geri dön'ü seçin ve mikroskobu ilgilenilen hücrelere veya yapılara manuel olarak odaklayın. Otomatik odaklama arama aralığını 2000 mikrometre olarak ayarlayın ve enter tuşuna basın.
Ardından, otomatik odaklama prosedürünü başlatmak için şimdi AF'ye tıklayın. Odak ofseti otomatik netleme alanında bir ofset değeri görünecektir. Bu ofset değerini AF ofset penceresine girin ve otomatik netleme prosedürünü tekrarlamak için AF now (Şimdi AF) öğesine iki kez tıklayın.
Ofset değerleri artık sıfıra ayarlanmalıdır, bu da otomatik odaklama sisteminin doğru çalıştığını gösterir. Ardından, FLIM kontrol sekmesi altında, gecikme noktalarının logaritmik bir örneklemesini sağlamak için otomatik geçit işlevini seçin. Biriken çerçeveleri, istenen toplam veri alma süresini veren bir değere ayarlayın.
Ardından, FLIM edinme iletişim kutusunda, FLIM çok kuyulu plaka alımını çalıştırmak ve az önce gösterildiği gibi bir arka plan kamerası görüntüsü elde etmek için HCA dizisini başlat düğmesine tıklayın. Burada, kohücrelerde ifade edilen model perde sistemini ve çok kuyulu bir plakayı kullanan temsili bir FLIM perde testi, her bir kuyucukta görünen tipik görüş alanlarının otomatik olarak elde edilen floresan ömrü görüntülerinin örnekleriyle birlikte gösterilmektedir. Bu deneyde, negatif kontrol kuyuları en uzun ömürleri sundu ve verici ömürleri, en kısa bağlayıcı uzunlukları ile en düşük perde yapılarını sergiledi.
Genel olarak, her bir kuyucuktaki tüm görüş alanlarının ortalaması alınan ortalama ömür, çok kuyulu plakalar arasında değişmiştir. A1 kuyusunda görüntülenen tüm hücreler üzerinde donör floresan yoğunluğu bozunma profilinin ortalamasının alınması, bir mono üstel bozunma modeline uyum ve alet tepki fonksiyonu ile birlikte, uydurma modelinin geçerli olduğunu gösterir. Piksel bazında mono üstel uyumdan elde edilen çok kuyulu plakanın her bir sütunu için ortalama floresan ömrünün daha fazla analizi, farklı perde verimliliklerine sahip bir deneyi simüle ederek daha kısa bağlayıcı uzunluklarına sahip perde yapılarındaki kullanım ömrü düşüşlerini gösterir.
Bu deneyde, farklı inhibitörlerin protein oligomerizasyonu üzerindeki etkisinin bir fret testinin FLIM verileri, tek bir üstel bozunma modeli ile donatıldı. Floresan ömür plakası haritası, sekiz görüş alanında ortalaması alınan kuyu başına ortalama kullanım ömrünü gösterir. Küçük bir set, kuyu başına dört görüş alanını görüntülerken, FLIM tahlilimiz, cihaz yanıt fonksiyonunu, referans kalıp verilerini elde etme ve analizi FLIM uyumunda çalıştırma süresi de dahil olmak üzere yaklaşık iki buçuk saat içinde tamamlanabilir.
Bir FLIM testi gerçekleştirirken, FLIM verilerini analiz etmek için gereken tüm bilgilere sahip olmanız için cihaz yanıt fonksiyonunu ve referans kalıp verilerini arka plan görüntüleriyle birlikte almayı unutmamak önemlidir. Açık kaynaklı yazılımımız FLIM fit'i kullanarak, bu verileri daha karmaşık bozunma modellerine sığdırmak da mümkündür. Örneğin, fret popülasyon fraksiyonunun belirlenmesine izin vermek.
FLIM HCA teknolojimiz, ilaç keşif topluluğundaki araştırmacıların sağlam fret ölçümleri yapmasına yardımcı oluyor. Gelecekte, bu teknolojinin hücre bazlı tahlillerde ayrışma sabitlerinin ölçülmesini sağlayacağını umuyoruz. Bu video kağıdının ve Wiki'mizdeki bilgilerin diğer araştırmacıların kendi FLIM HCA enstrümantasyonlarını oluşturmalarına ve bunu fret ve diğer tahlillere uygulamalarına yardımcı olacağını umuyoruz.
Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu tür enstrümantasyonları kullanırken tüm lazer ışınlarını çevrelemek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu makale, protein etkileşimlerini Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı ölçümlerle değerlendirmek için otomatik floresan ömür görüntüleme (FLIM) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunmaktadır. Metodoloji, hem sabit hem de canlı hücreler için uygulanabilir ve hücre sinyal işleme ile protein etkileşimleri üzerinde güçlü nicel veriler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan ömür görüntüleme mikroskobu (FLIM)
- Protein etkileşimleri
- Yüksek içerik analizi (HCA)
Arka Plan
- FLIM, protein etkileşimlerinin nicel ölçümlerini sağlar.
- FRET ölçümleri, etkileşim popülasyon fraksiyonlarının analizini sağlar.
- Teknik, 20 pikosekondere kadar ömür değişikliklerini ölçebilir.
- Otomatikleştirilmiş iş akışları veri toplama verimliliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- FLIM'in otomatik çok kuyulu plaka iş akışında uygulanmasını göstermek.
- FLIM verisi elde etmek için ayrıntılı bir prosedür sağlamak.
- Veri elde etme ve analizi için açık kaynak yazılım kullanmanın avantajlarını sergilemek.
Kullanılan Yöntemler
- Alet kontrolü için µManager yazılımının kullanılması.
- FLIMfit kullanılarak veri analizi yapılması.
- Gecikme kutusunun kalibasyonu ve optik parametrelerin ayarlanması.
- Çok kuyulu plakalardan floresan ömür görüntülerinin elde edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Çeşitli kuyulardan FLIM verisinin başarılı bir şekilde elde edildiği gösterildi.
- Negatif kontrol kuyuları en uzun ömürleri sergiledi.
- Ortalama ömürler çok kuyulu plakalar arasında değişti ve bu da FRET yapılarındaki farklılıkları göstermektedir.
- Mono-eksponensiel bozulma analizi yoluyla uyum modellerinin doğrulanması.
Sonuçlar
- openFLIM-HCA aleti protein etkileşimlerini etkili bir şekilde ölçer.
- Otomatikleştirilmiş iş akışları veri toplama yeteneklerini önemli ölçüde artırır.
- FLIM, hücresel süreçler ve etkileşimlere değerli içgörüler sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) in multiwell plate format enables robust, quantitative readouts of protein interactions via FRET, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The open-source workflow reduces barriers to adoption, allowing R&D teams to generate reproducible interaction data across compound libraries or genetic perturbations. This positions the method as a scalable, cost-effective tool for lead identification and portfolio triage in mechanistic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying FRET-based protein interaction dynamics in live or fixed cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through population fraction analysis of interaction states from single-exponential decay fitting.
- Predictive Value: Provides lifetime changes down to 20 picoseconds, allowing detection of subtle interaction shifts critical for lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline FRET efficiency in multiwell plate format.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs via automated acquisition of thousands of cells across hundreds of fields of view.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening oligomerization, heterodimerization, or intramolecular biosensor readouts in drug discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through live-cell FRET biosensor time courses, enabling dynamic pathway monitoring.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing consistent, quantitative interaction metrics across model systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria via FLIM-derived interaction population fractions and lifetime shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling quantitative assessment of protein interactions prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via FRET readouts of protein oligomerization or biosensor activation.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multiwell plate acquisition and global analysis of FLIM data.
- Analytics: Generates quantitative lifetime measurements and population fractions using FLIMfit for condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects to preclinical work through live-cell FRET biosensor dynamics, preserving mechanistic context.
- Enterprise Reuse: Positions the open-source FLIM-HCA platform as a reusable capability for repeated screening cycles across targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement, reduction of mechanistic ambiguity in protein interaction assays.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of FRET-based readouts across multiwell plate formats.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early interaction validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative interaction thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, FLIM principles, and open-source software (µManager, FLIMfit).
- Needs instrumentation including laser source, delay generator, gated optical intensifier, and spinning disk confocal unit.
- Demands cross-team standardization for calibration, acquisition parameters, and analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different fluorescent protein pairs, linker lengths, and cellular expression systems.
- Includes practical limitations such as laser safety protocols and the need for background and reference data acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Open Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)–High Content Analysis (HCA) Plugin Setup
1:51
Instrument Response Function (IRF) Image and Reference Dye Data Acquisition
4:32
Multiwell Plate Sample FLIM Data Acquisition
6:29
Results: Representative FLIM Analyses in Cos and HeLa Cells
8:05
Conclusion
