Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi
October 25th, 2019
Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.
Hücre içi bakteriler, patojen sağkalımını teşvik etmek için biyolojik yolları manipüle edebilen konak içine efektör proteinlersalgılar. Chlamydia trachomatis gibi hücre içi patojenlerin anlaşılması için etki cisim hedeflerinin ortaya çıkması esastır. Maya toksisitesi ve bastırıcı ekranlar bakteriyel efektör proteinlerin doğal biyolojik hedefi ile ilgili anahtar fikir sağlayabilir ve bağlayıcı bir ortak bilinmiyor sayılsa da özellikle yararlı olabilir.
Biz klamidya trachomatis efektör proteinler için tarama için burada maya toksisitesi ve bastırıcı tahliller göstermek, ama bu teknik de Legionella pnömofili ve Coxiella burnetii etkileri karakterize etmek için kullanılmıştır. Plazmid içeren efektör proteinile dönüştürülmüş tek bir maya kolonisi ile tek damla suyu beş mililitre aşılayarak başlayın. Negatif kontrol olarak tek başına vektör ile dönüştürülmüş maya kullanın ve sallayarak 30 derece santigrat gecede incubate.
Ertesi gün, 96 kuyulu bir plakanın A6 kuyuları aracılığıyla A2'ye 180 mikrolitre steril su ekleyin. Vortex gecede kültür ve iyi A1 maya 180 mikrolitre ekleyin. Sonra seri su ile kuyularda maya seyreltin. Tek damla glikoz ve tek drop-out galaktoz agar plakaları üzerine her seyreltme beş mikrolitre nokta ve 48 saat boyunca 30 santigrat derece plakaları kuluçka için çok kanallı pipet kullanın.
Kuluçkadan sonra, galaktoz içeren ortam üzerinde yetişen efektör proteini ifade eden mayanın büyümesini, vektörü tek başına ifade eden mayanın büyümesi ile karşılaştırarak toksisiteyi görsel olarak değerlendirin. 100 mililitrelik tek damla suyu, önceden hazırlanmış maya stokunun bir mililitresi ile aşıla ve 150 RPM'de sallayarak 30 santigrat derecede 16 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, gece kültürünün tüm 100 mililitre sini 900 mililitre önceden ısıtılmış tek bırakma suyu ekleyin ve şişeyi 30 santigrat derecede 4-5 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 6,000 kez g'de kültürü peletleyin. Supernatant atın ve steril su 250 mililitre pelet resuspend. Santrifüjtekrar layın ve supernatant atın.
Sonra bir milimolar lityum asetat 250 mililitre pelet resuspend. Santrifüj ile kültür pelet, lityum asetat kaldırmak ve% 50 PEG 3350 9,6 mililitre pelet resuspend. Daha sonra el yazmasında açıklandığı gibi dönüşüm reaktifleri ekleyin ve hacmi 15 mililitreye ayarlayın ve steril su yavaşça karıştırarak ters çevirin.
Karışımı 30 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra dmso 750 mikrolitre ekleyin ve başka bir 30 dakika için 42 santigrat derece bir su banyosu nda kuluçka. Yüksek dönüşüm verimliliği elde etmek için DMSO'nun ısı şokundan önce eklenmesi çok önemlidir.
Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 3,000 kez g santrifüj ederek maya pelet. Supernatant atın ve steril su 10 mililitre ile pelet yıkayın sonra maya pelet için santrifüj tekrarlayın. Peleti sekiz mililitre suda tekrar askıya alın.
Numuneyi 1'den 10'a kadar seyrelterek dönüşüm verimliliğini belirleyin ve her seyreltmenin 100 mikrolitresini çift damla-out agar üzerine kaplama. Daha sonra numunenin 200 mikrolitresini çift açılır galaktoz agar plakasına koyun ve plakaları 48 ila 96 saat veya koloniler ortaya çıkana kadar 30 derecede kuluçkaya yatırın. Koloniler ortaya çıktıktan sonra, onları çift açılır galaktoz agar'a yamalayın ve 24 ila 48 saat daha kuluçkaya yatırın.
Beş mililitre çift açılır et suyu aşılamak ve inoculumu bir gecede 26 santigrat derecede 150 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırmak için yamanın bir kısmını kullanın. Ertesi gün, iyi A2 ile başlayan 96 kuyulu bir plaka beş kuyuya steril su 180 mikrolitre ekleyin. Girdap gece kültür karışımı. Iyi A1 maya 180 mikrolitre ekleyin ve seri a2 ile A6 kuyularında su kullanarak seyreltin. Tek damla glikoz ve tek drop-out galaktoz agar plakaları üzerinde her seyreltme Nokta beş mikrolitre tek başına bir kontrol olarak toksik efektör dahil emin olun.
48 saat boyunca 30 santigrat derece plakaları kuluçka ya da potansiyel bastırıcı ile maya büyüme tek başına toksik efektör ile maya büyümesini karşılaştırın. Sadece toksik etki yle karşılaştırıldığında azalmış toksisite gösteren bastırıcıları doğrulamak için, plazmidi el yazması yönlere göre izole edin ve toksik mayaya yeniden dönüştürün. Dönüşüm plakasından bir koloni ile çift damla glikoz suyu aşılamak.
Bir gecede kuluçkaya yatırın ve toksisitenin bastırılmasını doğrulamak için çift damla glikoz ve galaktoz agar üzerinde nokta. Maya bastırıcı ekran gerçekleştirmeden önce, ilgi efektör proteinler maya toksisite için test edildi. İlgi proteini bir galaktoz indükleyici kontrolü altında maya ifade edildi ve galaktoz büyüme glikoz büyüme ile karşılaştırıldı.
CT229 toksisite testi yapıldığında, daha küçük koloniler ve büyüme baskılanması gözlendi. İdeal olarak, maya bastırıcı ekranlar ile devam etmek için bir iki ila üç günlük azalma gözlenmelidir. Bastırıcı ekran, maya genomik kütüphane pYAP 13 ile toksik suşun dönüştürülmesi ve galaktoz agar üzerindeki transformatörlerin boyanması ile gerçekleştirilmiştir.
Elde edilen bastırıcı klonlar toksisite bastırılması onaylamak için çift drop-out galaktoz agar tespit edildi. Bastırıcılar pSup1 ve pSup2 efektör proteinin toksisitesini bastırırken pSup3 bunu yapmadı. Bu yordamlar, denemeyi gerçekleştirmeden önce büyük miktarda ortam ve plakanın hazır olması da dahil olmak üzere kritik hazırlık çalışmalarına ek olarak ayrıntılara dikkat etmeyi gerektirir.
Bastırıcılar tanımlandıktan sonra, çekme inmeleri, immünoreskence kolokalizasyonu, efektör nakavt veya ekranlarda tanımlanan konak faktörlerinin nakavt ı dahil olmak üzere ilginin etkisiyle etkileşimleri doğrulamak için deneyler yapılabilir. Klamidya efektörleri için bu tekniğin geliştirilmesi, efektör proteinlerin ön karakterizasyonunun hızlandırılmasına olanak sağladı ve patojen etkileşimlerine aracılık eden altta yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik çabalarımızı odaklamaya yardımcı oldu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, maya toksisitesi ve baskılayıcı taramalar kullanarak toksik bakteriyel efektör proteinlerin hedef aldığı konakçı yollarını belirleme yöntemini açıklar. Bu etkileşimleri anlamak, Chlamydia trachomatis gibi hücre içi bakterilerde moleküler patogenezi ele almak için çok önemlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Patojen-konakçı etkileşimleri
- Hücre biyolojisi
Arka Plan
- Bakteriyel patojenlerken, konak biyolojik yolları manipüle eden efektör proteinler salgılar.
- Bu yolları tanımlamak, hücre içi bakterilerin neden olduğu hastalıkları anlamak için çok önemlidir.
- Maya modelleri, bu efektör proteinlerin etkilerini taramak için kullanılabilir.
- Bu yöntem, Chlamydia trachomatis dahil olmak üzere çeşitli patojenlerde uygulanmıştır.
Çalışmanın Amacı
- Toksik bakteriyel efektör proteinlerin hedef aldığı konak yollarını açıklamak.
- Patogenezin moleküler mekanizmaları hakkında bilgiler sağlamak.
- Bu araştırma alanında maya toksisitesi ve baskılayıcı taramaların faydasını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Efektör protein plazmitleri ile transforme edilmiş mayaların inokülasyonu.
- Yalnızca vektör ile transforme edilmiş mayalarla negatif kontrollerin kullanılması.
- Kültürlerin çalkalanırken 30 derece Celsius'ta inkübasyonu.
- Efektör protein etkileşimlerini tanımlamak için maya büyümesi ve toksisitesinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Chlamydia trachomatis efektör proteinlerinin etkilediği konak yollarının başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Bakteryel efektörlerin incelenmesinde maya taramalarının etkinliğinin gösterilmesi.
- Çeşitli bakteriyel patojenlerin biyolojik hedefleri hakkında bilgiler.
- Bu yöntemin diğer hücre içi bakteriler için olası uygulamaları.
Sonuçlar
- Maya toksisitesi ve baskılayıcı taramalar, bakteriyel efektör proteinlerini incelemek için değerli araçlardır.
- Bu yaklaşım, patojen-konakçı etkileşimlerinin anlaşılmasını artırır.
- Bu yöntemi kullanarak yapılan daha ileri araştırmalar, bakteriyel enfeksiyonlara karşı yeni tedavi stratejileri ortaya çıkarabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Identifying host pathways manipulated by bacterial effector proteins is critical for de-risking target validation in anti-infective discovery. Yeast toxicity and suppressor screens provide a functional, phenotype-driven approach to pinpoint dysregulated host biology when traditional binding assays fail. This enables mechanistic insight into pathogen virulence factors, supporting early-stage target confidence and portfolio prioritization for intracellular pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking effector toxicity to specific host pathways through suppressor identification.
- Operational Value: Enables functional target validation when effector proteins lack detectable binding partners or interact with multifunctional host proteins.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-level perturbations rather than isolated protein interactions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated yeast strains expressing effector proteins for reproducible toxicity screening.
- Quantitative Output: Measures growth defect magnitude (e.g., two- to three-log reduction) as a threshold for proceeding to suppressor screens.
- Scalability: Uses 96-well formats and serial dilution spotting for high-throughput suppressor clone evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to intracellular pathogens like Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, and Coxiella burnetii, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Identifies host factors that, when suppressed, rescue effector toxicity, enabling follow-up validation via pull-downs, colocalization, or knockout studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses efforts on effectors with confirmed pathway modulation, reducing late-stage biological attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to inform lead identification by connecting effector expression to host pathway disruption, enabling data-driven target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking effector expression to growth defects in yeast, indicating pathway interference.
- Screening: Delivers assay-ready toxic strains and suppressor libraries for identifying host factors that rescue phenotype.
- Analytics: Provides quantitative growth readouts on selective media to compare effector toxicity and suppressor efficacy.
- Translational Research: Connects yeast-identified suppressors to mammalian homologs for preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening effector libraries across multiple intracellular pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through functional pathway interrogation.
- Operational Value: Standardized toxicity and suppressor screening workflows with defined growth thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by filtering effectors lacking measurable host pathway impact.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of effector targets based on validated pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular cloning, galactose-inducible expression, and plasmid library transformation.
- Dependent on instrumentation for sterile culture handling, centrifugation, and incubation at 30°C with shaking.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, plate spotting, and toxicity scoring criteria.
- Adaptation considerations include promoter compatibility, effector toxicity thresholds, and suppressor validation in mammalian systems.
- Practical limitations include the need for large volumes of media and plates, and potential false negatives if effector expression is toxic to yeast library strains.
