Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran
27 Temmuz 2011
Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran tarif Saccharomyces cerevisiae, Bir sıvı taşıma robotu ile dizilmiş plazmid bir kütüphane ve yüksek verimli bir maya dönüşüm protokolü kullanarak.
Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerini bir dizi plazma DNA kütüphanesi ile dönüştürmektir. Bu, önce uygun miktarda maya hücresinin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Maya hücreleri daha sonra DNA dönüşümü için yetkin hale getirmek için lityum asetat ile muamele edilir.
Ardından, yetkin e hücrelerini DNA ile karıştırarak dönüştürün. Prosedürün son adımı, dönüştürücüleri seçmek ve analiz etmektir. Sonuç olarak, maya lekeleme testleri ve/veya mikroskopi yoluyla plazma DNA'sının maya fenotipleri üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu tekniğin standart maya dönüşümleri gibi mevcut protokollere göre ana avantajı, çok sayıda farklı Plazmitin otomatik bir şekilde maya hücrelerine dönüştürülmesine izin vermesidir. Bu yüksek verimli maya dönüşüm protokolü, 10.96 kuyulu plakalar için tasarlanmıştır, ancak buna göre büyütülebilir veya küçültülebilir. Daha büyük ölçekli deneyler için başarının anahtarı, tüm plakaları ve reaktifleri düzenli tutmaktır.
Karışıklığı önlemek için deney başladıktan sonra, bu protokolde bir biobot hızlı plaka sıvı işleyici kullanılacaktır Aliquot'a başlamak için, turun her bir kuyucuğuna bir dizi maya plazmit kütüphanesinden beş ila 10 mikrolitre plazma DNA'sı. Alt 96 kuyu plakası. 96 kuyulu plakayı, kuruması için gece boyunca temiz bir tezgah çeker ocak içine açıkta yerleştirin.
Daha sonra, 200 mililitre maya peptit dekstroz veya YPD ortamını bir sorgu suşu ile 500 mililitrelik şaşkın bir Lin Meyer şişesine aşılayın, gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi sabah çalkalayın. Optimum büyüme için sorgu gerginliğini iki litre YPD ortamında 0,1'lik bir OD 600'e seyreltin. Ayrı 2,8 litrelik şaşkın şişelerde bir litreye kadar kültür büyütün.
Kültürler 0.8 ila 1.0 arasında bir OD 600'e ulaşana kadar şişeleri 30 santigrat derecede dört ila altı saat çalkalayın. Maya Kültürü 0.8 ila 1.0 arasında bir OD 600'e ulaştığında, hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Dört adet tek kullanımlık 225 mililitrelik konik tüpü kültürle doldurun ve bir masa üstü santrifüjde beş dakika boyunca 3000 RPM'lik bir döndürün.
S süpernatantını her tüpten dökün. Aynı tüplere daha fazla kültür ekleyin ve tekrar santrifüjleyin, tüm hücreler toplanana kadar gerektiği kadar tekrarlayın. Her hücre peletini 50 mililitre otoklavda damıtılmış suda yıkayın ve girdap yaparak Resus harcayın.
Hücreleri iki yüz yirmi beş mililitrelik bir konik tüpte birleştirin ve beş dakika boyunca 3000 RPM'de döndürün. S süpernatantını çıkardıktan sonra, hücreleri yüz mililitre lityum asetat çözeltisinde yıkayın. Beş dakika boyunca 3000 RPM'de tekrar döndürün.
SNA'yı çıkarın, hücre peletini 70 mililitre lityum asetat çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Pelet tamamen yeniden askıya alınana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca yüksek hızda girdap. 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin.
Daha sonra, 30 dakika daha 30 santigrat derecede çalkalayarak 0.1 molar inkübata beta me kapto etanol ekleyin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre karışımına iki mililitre haşlanmış ve soğutulmuş somon sperm DNA'sı ekleyin. Hücre karışımını otoklavlanabilir tek kuyucuklu bir plakaya dökün ve ardından oluşan çökeltileri temizleyin çünkü bu, sonraki pipetlemeyi etkileyebilir.
Biobot hızlı plaka aliquot kullanılarak, daha önce hazırlanmış dört oyuğun her birine 50 mikrolitre hücre karışımı eklenir. Plazma DNA'sı içeren 96 oyuklu plakalar karışmaz. Hücreler inkübe edilirken plakaları oda sıcaklığında 30 dakika çalkalamadan inkübe edin.
200 mililitre PEG DMSO lityum asetat çözeltisi hazırlayın. 160 mililitre% 50 PEG 33, 50 20 mililitre DMSO ve 20 mililitre bir molar lityum asetat birleştirin. Bu çözeltinin kullanımdan hemen önce hazırlanması önemlidir.
Her birine 125 mikrolitre PEG lityum asetat DMSO çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu sekiz kez aspire ederek ve dağıtarak iyice karıştırın. Çalkalamadan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 42 santigrat derecede ısıtın Kuru bir inkübatörde, ısı şokundan sonra plakaları istiflemeyin, 96 kuyulu plakayı yerleştirmek için santrifüj adaptörleri kullanarak plakaları döndürün. Santrifüjlemeden sonra, plakaları bir atık kovası üzerinde ters çevirerek PEG çözeltisini çıkarın. Sonra ters çevrilmiş plakaları kağıt havluların üzerine kurulayın.
Kalan sıvıyı çıkarmak için, hücreler kuyuların dibinde kalacaktır. Her birine 200 mikrolitre minimum ortam ekleyerek hücreleri durulayın. Plakaları tekrar döndürün.
Bir atık kovasının üzerine ters çevirerek ve kağıt havluların üzerine sürerek süpernatanı çıkarın. Hızlı bir plaka ile her bir oyuğa 200 mikrolitre minimum ortam ekleyin, sallamadan iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. İki gün sonra, başarılı bir şekilde Dönüştürülen her birinin dibinde küçük hücre kolonileri oluşmaya başlamalıdır.
Sıçrama tahliline hazırlanmak için, önce yeni bir dairenin her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre OSE bazlı minimal ortam dağıtın. Alt 96 kuyulu plaka. Önümüzdeki. Hücre süspansiyonunu hızlı bir plaka ile sekiz kez aspire ederek ve dağıtarak dönüşüm plakasının her bir kuyusunu karıştırın.
Rafinoz plakasının her bir oyuğunu, dönüşüm plakasından beş mikrolitre hücre karışımı ile aşılayın, bir gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün. Her birinin altında küçük koloniler bulunmalıdır.
Davlumbazda lekelenme testini iyi bir şekilde gerçekleştirin, 96 cıvatayı, çoğaltıcıyı veya kurbağayı alevlendirerek sterilize edin. Kolonileri bir kurbağa ile karıştırın ve ardından kolonileri seçici ortam plakalarında tespit edin. Lekelenmeden sonra, plakaların davlumbazda beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin.
Plakaları iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Burada, TDP 43.Toksisitenin baskılayıcılarını ve arttırıcılarını tanımlamak için bir maya plazmidi aşırı ekspresyon ekranının temsili sonuçları gösterilmektedir. TDP 43, maya hücrelerinde TDP 43'ü eksprese eden bir miyotrofik lateral skleroz veya Lou Gehrig hastalığının patogenezinde rol oynayan bir insan proteinidir ve agregasyon ve sitotoksisite ile sonuçlanır.
Bu plakalar, entegre bir galaktoz indüklenebilir, T DP 43 plazmidi olan ve aynı zamanda esnek gen ORF ekspresyon kütüphanesinden plazmitlerle dönüştürülmüş kolonileri gösterir. Buradaki koloniler kırmızı renkte görünür, çünkü suş kırmızı bir pigment birikimine neden olan bir mutasyona sahiptir. Soldaki plaka, T DP 43 veya esnek gen plazmitlerinin ekspresyonunu baskılayan glikoz içerir.
Sağdaki plaka, esnek gen plazmitlerinde TDP 43 ve O Fs'nin ekspresyonunu indükleyen galaktoz içerir. Yeşil ok ucu, daha hızlı büyüme ve daha yoğun koloniler ile gösterildiği gibi, TDP 43'ün toksisitesini baskılayan bir plazmit ile dönüştürülmüş bir koloniyi gösterir. Kırmızı ok ucu, daha yavaş büyüme ve daha az yoğun Koloniler ile gösterildiği gibi TDP 43'ün toksisitesini artıran bir plazmit ile dönüştürülmüş bir koloniyi gösterir.
Bu videoyu izledikten sonra, plazma DNA'larından kaçınma kütüphanesinin nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Saccharomyces cerevisiae'de, yüksek verimli bir maya dönüştürme protokolü kullanarak bir plazmid aşırı ekspresyon taraması tanımlar. Süreç, maya fenotipleri üzerindeki etkileri analiz etmek için maya hücrelerinin bir plazmid DNA dizisi kütüphanesi ile dönüştürülmesini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Genetik
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Plazmid aşırı ekspresyon taraması, gen fonksiyonunu incelemek için gereklidir.
- Saccharomyces cerevisiae, genetik çalışmalar için bir model organizma olarak hizmet eder.
- Yüksek verimli yöntemler, genetik dönüşümlerin verimliliğini artırır.
- Maya fenotiplerinin anlaşılması, daha geniş biyolojik süreçler hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Gen fonksiyonunu değerlendirmek için maya hücrelerini plazmid DNA ile dönüştürmek.
- Yüksek verimli dönüşümler için bir sıvı işleme robotu kullanmak.
- Fenotip değişiklikleri açısından sonuçta elde edilen transformantları analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Maya hücreleri uygun bir yoğunlukta yetiştirilir.
- Hücreler, dönüştürme için yetkinlik sağlamak üzere lityum asetat ile işlem görür.
- Yetkin hücreler, dönüştürme için plazmid DNA ile karıştırılır.
- Transformantlar, maya leke testleri ve mikroskopi kullanılarak seçilir ve analiz edilir.
Ana Sonuçlar
- Maya hücrelerinin plazmid DNA ile başarılı bir şekilde dönüştürülmesi.
- Transformantlarda fenotip değişikliklerinin tanımlanması.
- Yüksek verimli yöntemlerin etkinliğinin gösterilmesi.
- Mayadaki spesifik genlerin fonksiyonel rolleri hakkında bilgiler sağlanması.
Sonuçlar
- Plazmid aşırı ekspresyon taraması, genetik analiz için değerli bir araçtır.
- Yüksek verimli teknikler, maya genetiğinde araştırmayı önemli ölçüde hızlandırabilir.
- Sonuçlar, gen fonksiyonu ve düzenlemesinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-throughput yeast plasmid overexpression screens enable systematic identification of genetic modifiers impacting cellular phenotypes relevant to human disease. This scalable approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by leveraging a well-characterized eukaryotic model. Integration of automated liquid handling accelerates discovery inflection points and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in disease-relevant phenotypes.
- Supports identification of genetic suppressors and enhancers for mechanistic de-risking.
- Facilitates functional target validation through systematic gain-of-function screening.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets in complex biological systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes assay conditions using automated liquid handling for reproducibility.
- Generates quantitative phenotypic outputs for reliable compound or genetic evaluation.
- Enables scalable screening of thousands of plasmids in parallel for robust data generation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast phenotypes with human disease mechanisms for translational continuity.
- Supports identification of genetic modifiers relevant to neurodegenerative disease models.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of targets into preclinical validation.
- Offers predictive de-risking value by modeling aggregation-prone protein toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput yeast transformation protocol bridges early discovery and lead identification by enabling systematic genetic screens with direct translational relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible yeast models for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides quantitative colony growth and density measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast-based findings to preclinical disease models when aligned with human protein toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable screening capability for diverse phenotypic endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and high-throughput screening protocols.
- Depends on access to liquid handling robotics and 96-well plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay setup and data analysis.
- Adaptable to various phenotypes but may require optimization for specific readouts.
- Scalability and reproducibility depend on rigorous plate and reagent management.
