Name: Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae hücrelerini yüksek verimli plazmid overekspresyon taramaları için otomatik dönüştürme protokolünü. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık proteinlerinin toksisitesini modifiye eden genetik faktörleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Johns Hopkins ALS Araştırma Packard Merkezi (ADG), NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Rita Allen Vakfı Scholar Ödülü bir hibe ile desteklenmiştir. ADG Pew Charitable Ortaklıkları tarafından desteklenen Biyomedikal Bilimler Pew Scholar.

1. Maya dönüşüm için hazırlıklar Bu protokol on 96-kuyucuğu için tasarlanmıştır ancak bu doğrultuda yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Biz bu protokolü, dönüşüm yuvarlak başına yirmiden fazla 96 kuyucuğu için iyi olmadığını bulduk. Tüm dönüşüm prosedürü (adım I.3) yaklaşık sekiz saat sürer. <ol><li> Kısım yuvarlak bir alt her kuyuya Biorobot RapidPlate sıvı işleyici 96-plaka Maya FLEXGene ORF kütüphane plazmid DNA (100 ng / ul) 5-10μL. Place kuru geceleme temiz tezgah davlumbaz 96-kuyucuğu ortaya çıkardı. Biz CEN ve 2μ maya plazmid ile benzer dönüşüm verimliliği bulduk. </li><li> Maya pepton dekstroz (YPD) medya (10g / L maya özü, 20g / L pepton, 20g / L glukoz) ve 200 ml 500ml şaşkın Erlenmeyer şişesinin sorgu suşu ile inoküle edin. Sallayarak (200 rpm) ile 30 ° C'de bir gece inkübe edin. Gerekirse, seçici medya bu starter kültürler için de kullanılabilir. </li><li> Ertesi sabah, sorgu gerginlik OD 600 = 0.1 YPD, 2L sulandırmak. 30 ° C (200 rpm) kültürü OD 600 = 0.8-1.0 ulaşıncaya kadar 4-6 saat çalkalanır. Optimum büyüme için, iki ayrı 2.8 L şaşkın şişeler 1L kültürler büyüyorlar. Gerekirse, seçici medya da YPD yerine kullanılan olabilir. </li></ol> 2. Maya dönüşüm <ol><li> Hasat hücreler santrifüj yoluyla. 5 dakika masaüstü santrifüj (Eppendorf 5810R) 3000rpm (~ 1800 xg) maya kültürü ve spin ile dört tek 225mL konik tüpler doldurun. Süpernatant dökün ve tüm hücreleri hasat kadar tekrarlayın. </li><li> Otoklavlanmış distile H 2 O. 200ml hücrelerin yıkayın Sallayarak veya vorteks yeniden süspanse hücre pelletini. 225mL konik bir tüp içinde hücreleri birleştirin. 5 dakika 3000rpm dönerler. Süpernatantı. </li><li> 0.1MLiOAc/1XTE çözüm (0.1M LiOAc, 10mM Tris, 1mm EDTA, otoklavlanmış distile su, pH 8) hazırlayın. 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE hücrelerin yıkayın. 5 dakika 3000rpm dönerler. Süpernatantı. </li><li> 70mL 0.1M LiOAc/1xTE yeniden süspanse hücre pelletini. Shake ve / veya vorteks pelet tamamen yeniden süspanse sağlamak için. </li><li> 30 ° C'de 30 dakika (200 rpm) sallayarak inkübe edin. </li><li> 0.1M için β-mercaptoethanol ekleyin. 30 ° C'de 30 dakika (200 rpm) sallayarak inkübe edin. Not: beta-mercaptoethanol duyarlı maya suşu kullanılarak, bu adım atlanabilir. Biz bu adımı başarılı bir dönüşüm için zorunlu olduğunu bulduk, ancak dönüşüm verimliliği artırmak. </li><li> Sonicated somon sperm DNA (10mg/ml) 2mL 15 dakika boyunca kaynatın ve ardından buz üzerinde soğutun. </li><li> 2mL haşlanmış somon sperm DNA hücre karışımı ekleyin. Dikkat: hücre karışımı somon sperm DNA eklenmesi halinde bir çökelti. Pipetman ve 200 ul ucu kullanarak, dikkatli bir şekilde bu mansap pipetleme engel olabilir çünkü formları herhangi bir çökelti kaldırın. </li><li> 96-plaka BioRobot Rapidplate kullanarak her bir kuyunun hücre karışımı kısım 50μL (aynı zamanda çok kanallı pipet kullanabilirsiniz). Karışmaz. </li><li> Sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 200ml 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL% 50 PEG-3350, 20ml DMSO, 20ml 1M LiOAc) hazırlayın. Kullanımdan hemen önce çözüm hazırlayın. </li><li> Her iyi PEG / LioAc / DMSO çözüm 125μL ekleyin. RapidPlate ile sekiz kez aspire ve hücre süspansiyonu dağıtım karıştırın. </li><li> Sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Isı şok hücreleri 42 ° C 15 dakika boyunca kuru bir inkübatör. Plakalar koymayın. Not: Bu ısı şok adım başarılı bir dönüşüm için gerekli olduğunu bulduk. Bazı maya suşları (örneğin, ısıya duyarlı mutantlar), ısı şok zararlı. Daha önce bir dakika ısı şok süresini azalttı ve bu protokolü kullanarak ypt1 ısıya duyarlı mutasyon barındıran bir maya suşu başarıyla dönüştürmek mümkün olmuştur. </li><li> 96-kuyucuğu karşılamak için santrifüj adaptörleri kullanarak, 5 dakika için 2500rpm (~ 1100 xg) plakaları Spin. Atık kovası üzerinde tersini plakaları ile PEG çözüm çıkarın. Kalan sıvı kaldırmak için kağıt havlu üzerine ters plaka Blot (hücreleri kuyu altında kalacaktır). </li><li> RapidPlate her iyi minimal medya 200μL ekleyerek (örneğin SD /-Ura) hücreleri durulayın. </li><li> 2500rpm az 5 dakika boyunca plakalar Spin ve tersini üzerinde atık kovası ve kağıt havlu üzerinde blot süpernatant kaldırmak. </li><li> RapidPlate ile her kuyuya 200μL minimal medya (örneğin SD /-Ura) ekleyin. </li><li> Titreme olmadan 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. 2 gün sonra, hücre başarıyla iyi dönüştürülmüş her altındaki küçük koloniler oluşturmak için başlamalıdır. </li></ol> 3. Tahlil Spotting <ol><li> Her kuyuya raffinose tabanlı minimal medya (örneğin SRaf /-Ura) 200μL Uygulamayeni bir düz-alt 96-plaka. </li><li> Rapidplate ile sekiz kez aspire ve hücre süspansiyonu dağıtım dönüşüm plaka her iyi karıştırın. </li><li> Dönüşüm plaka hücre karışımı 5μL ile SRaf plakalarını aşılamak. </li><li> Bir gün için 30 ° C'de inkübe edin. Küçük kolonileri bir gün sonra, her bir kuyunun dibinde mevcut olmalıdır. </li><li> SD / Ura ve kaputu SGal /-Ura plakaları Spot koloniler. 96-cıvata çoğaltıcı (Frogger) alev tarafından sterilize edin. Frogger ile seçici besiyerleri plakaları lekelenme önce koloniler karıştırın. Lekelenme sonra, tabak, 5-10 dakika kaputu kurumasını bekleyin. </li><li> 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. </li></ol> Dijital kamera ile fotoğraf plakaları ve görsel SGal /-Ura plakaları sorgu gerginlik toksisite (hızlı büyüme / daha yoğun koloniler) (daha yavaş büyüme / daha az yoğun koloniler) ya da bastırılmış gelişmiş olduğu koloniler bulmak için kolonilerin büyüme karşılaştırmak. 4. Temsilcisi sonuçları: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Maya plazmid aşırı ekspresyonu TDP-43 toksisite bastırıcılarının ve arttırıcılar tanımlamak için ekran. TDP-43 Amyotrofik lateral skleroz (Lou Gehrig hastalığı) patogenezinde sorumlu olan bir insan proteini. TDP-43 Sitoplazmik agrega ALS hastası 17 beyin ve omurilik nöronlarının birikir. Agregasyonu ve sitotoksisite 18 maya hücreleri sonuçları ifade TDP-43. Biz TDP-43 toksisite 19,20 mekanizmaları tanımlamak için bu model sistem kullandık. Gösterilen bizim maya TDP-43 toksisite değiştirici ekran plaka repesentative örnekler. Bu plakalar FLEXGene ORF ifade kütüphane plazmid ile entegre bir galaktoz-indüklenebilir TDP-43 plazmid ve aynı zamanda dönüştürülmüş koloniler gösterilecek. Soldaki plaka TDP-43 veya FLEXGene plazmid ifade bastıran glikoz içerir. Sağdaki plaka TDP-43 ekspresyonu ve FLEXGene plazmid Orfs neden olur galaktoz içerir. Yeşil ok ucu TDP-43 toksisite bastırır bir plazmid ile dönüştürülmüş bir koloni gösterir. Kırmızı ok ucu TDP-43 toksisitesini arttırır bir plazmid ile dönüştürülmüş bir koloni gösterir.

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
<li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li>
<li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li>
<li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li>
<li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li>
<li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%28%28R%29%29+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li>
<li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Mnaimneh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Burada maya yüksek verimli bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, birçok farklı hücre fenotipleri genetik nitelemeler için hızlı ve tarafsız bir tarama sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bir araştırmacı, birkaç hafta içinde maya genomu önemli bir bölümünü ekrana. Bu tarafsız bir yaklaşım aynı zamanda, önceki bulgulara göre tahmin edilmiş olabilir değiştirici belirlenmesi için olanak sağlar. Biz insan nörodejeneratif hastalık proteinlerin 19,21-23 toplama ile i...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 cıvata çoğaltıcı (Frogger) </td><td> V &amp; P Bilimsel </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF Kütüphanesi </td><td> Proteomik Enstitüsü, Harvard Tıp Fakültesi </td><td></td></tr><tr><td> Masa üstü santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500ml şaşkın şişesi </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2.8L üçlü şaşkın FERNBACH şişesi </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> 100μL Rapidplate pipet uçları </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200μL Rapidplate pipet uçları </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

yüksek verim maya plazmid overekspresyonu ekran

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Saccharomyces cerevisiae, tomurcuklanan bir maya, insan hastalığı ile doğrudan ilgili olanlar da dahil olmak üzere birçok önemli hücresel süreçlerin temel mekanizmaları, tanımlamak için güçlü bir model sistem. Çünkü, kısa üretim süresi ve iyi karakterize genom, maya model sistem büyük bir deneysel avantajı, belirli bir süreç içinde yer genler ve yolları belirlemek için genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeteneğidir. Son otuz yıl içinde bu tür genetik ekranlar hücre döngüsü, salgı yolağı ve ökaryotik hücre biyolojisi 1-5 çok daha yüksek oranda korunmuş yönlerini aydınlatmak için kullanılmaktadır . Son birkaç yıl içinde, maya suşları ve plazmid birkaç genomewide kütüphaneler 6-10 oluşturuldu. Bu koleksiyon, kazanç ve kayıp fonksiyon-yaklaşımları kullanarak 11-16 genin fonksiyonu ile sistematik bir sorgulama için izin verir. Burada dizilmiş 5.500 maya plazmid bir kütüphaneyi kullanarak, plazmid aşırı ekspresyonu ekranı gerçekleştirmek için bir sıvı taşıma robotu ile yüksek verimli bir maya dönüşüm protokolü kullanımı için ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz kümeleme eğilimli insan nörodejeneratif hastalık proteinlerin birikimi ile ilişkili toksisite genetik nitelemeler tanımlamak için bu ekranlar kullanıyoruz. Burada sunulan yöntemler diğer ilgi hücre fenotipleri çalışma kolayca uyarlanabilir.

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran tarif<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Bir sıvı taşıma robotu ile dizilmiş plazmid bir kütüphane ve yüksek verimli bir maya dönüşüm protokolü kullanarak.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Tomurcuklanan maya olan Saccharomyces cerevisiae, birçok önemli hücresel sürecin temel mekanizmalarını belirlemek için güçlü bir model sistemdir, ...

Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerini plazmid DNA'larından oluşan bir dizi kütüphanesi ile transforme etmektir. Bu işlem, öncelikle uygun miktarda maya hücresi yetiştirilerek gerçekleştirilir. Ardından maya hücreleri, DNA transformasyonu için yetkin hale gelmelerini sağlamak amacıyla lityum asetat ile işleme tabi tutulur.Ardından, kompetan e hücrelerini DNA ile karıştırarak transformasyon işlemini gerçekleştirin. Prosedürün son adımı, transformantların seçilmesi ve analiz edilmesidir. Nihayetinde, maya spotting assay'leri ve/veya mikroskopi yoluyla plazmit DNA'nın maya fenotipleri üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, standart maya transformasyonları gibi mevcut protokollerin önündeki temel avantajı, çok sayıda farklı Plazmidin maya hücrelerine otomatik bir şekilde transformasyonuna olanak tanımasıdır. Bu yüksek verimli maya transformasyon protokolü 10 adet 96 kuyucuklu plaka için tasarlanmıştır, ancak ihtiyaca göre ölçeği artırılabilir veya azaltılabilir. Daha büyük ölçekli deneyler için başarının anahtarı, tüm plakaların ve reaktiflerin düzenli tutulmasıdır.Karışıklığı önlemek için, deney başladıktan sonra bu protokolde Biobot hızlı plaka sıvı taşıyıcı kullanılacaktır. Başlangıç olarak, bir dizi maya plazmit kütüphanesinden alınan 5 ila 10 µL plazma DNA'sını, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna paylaştırın. 96 kuyucuklu plakaları kurumaları için gece boyunca temiz bir laminar akışlı kabin içinde, üzeri açık şekilde bırakın.Ardından, 500 mL'lik bölmeli bir Lin Meyer erleninde 200 mL maya peptit dekstroz veya YPD besiyerine sorgu suşunu inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, optimal büyüme için sorgu suşunu iki litre YPD besiyerinde 0,1 OD 600 değerine seyreltin. Ayrı 2,8 L'lik bölmeli erlenlerde bir litreye kadar kültürler büyütün.Kültürler 0,8 ile 1,0 arasında bir OD 600 değerine ulaşana kadar flaskları 30 °C'de dört ila altı saat boyunca çalkalayın. Maya kültürü 0,8 ile 1,0 arasında bir OD 600 değerine ulaştığında, hücreleri santrifüjleme yoluyla hasat edin. Dört adet tek kullanımlık 225 mililitrelik konik tüpü kültürle doldurun ve masaüstü santrifüjle 3000 RPM'de beş dakika boyunca döndürün.Her tüpteki S süpernatanını dökün. Aynı tüplere daha fazla kültür ekleyin ve tüm hücreler hasat edilene kadar gerekirse işlemi tekrarlayarak tekrar santrifüjleyin. Her hücre peletini 50 mililitre otoklavda steril edilmiş distile su ile yıkayın ve vortexleyerek resüspande edin.Hücreleri tek bir 225 mL'lik konik tüpte birleştirin ve 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. S süpernatantını uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 100 mL lityum asetat çözeltisi ile yıkayın. Tekrar 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.SNA'yı uzaklaştırın ve hücre peletini 70 mililitre lityum asetat çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Pelet tamamen süspande olana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin. 30 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.Ardından, 0,1 molar beta-mercaptoethanol ekleyin ve 30 °C'de çalkalayarak 30 dakika daha inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, hücre karışımına iki mililitre kaynatılmış ve soğutulmuş somon spermi DNA'sı ekleyin. Hücre karışımını otoklavlanabilir tek kuyucuklu bir plakaya dökün ve ardından, sonraki pipetleme işlemlerine engel olabileceği için oluşan tüm çökelekleri uzaklaştırın.Biobot hızlı plaka dağıtıcısı kullanarak, plazma DNA'sı içeren önceden hazırlanmış dört adet 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 50 µL hücre karışımı ekleyin ve karıştırmayın. Hücreler inkübe olurken, plakaları oda sıcaklığında, çalkalamadan 30 dakika boyunca inkübe edin.200 mililitre PEG DMSO lityum asetat çözeltisi hazırlayın. 160 mililitre %50 PEG 33, 50, 20 mililitre DMSO ve 20 mililitre bir molar lityum asetatı birleştirin. Bu çözeltinin hemen kullanımdan önce hazırlanması önemlidir.Her birine 125 µL PEG lityum asetat DMSO çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu sekiz kez aspire edip dağıtarak iyice karıştırın. Sallamadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, hücrelere kuru bir inkübatörde 15 dakika boyunca 42 °C'de ısı şoku uygulayın; ısı şokundan sonra plakaları üst üste dizmeyin, 96 kuyucuklu plakalara uygun santrifüj adaptörlerini kullanarak plakaları döndürün. Santrifüjleme işleminden sonra, plakaları bir atık kovasının üzerine ters çevirerek PEG solüsyonunu uzaklaştırın. Daha sonra ters çevrilmiş plakaları kağıt havlu üzerinde kurulayın.Kalıntı sıvıyı uzaklaştırmak için hücreler kuyucukların dibinde bırakılacaktır. Her birine 200 µL minimal medya ekleyerek hücreleri durulayın. Plakaları tekrar santrifüjleyin.Süpernatanı, bir atık kovasına ters çevirerek ve kağıt havluyla kurulayarak uzaklaştırın. Her kuyuya 200 µL minimal besiyeri ekleyin ve plakayı 30 °C'de, sarsmadan iki gün boyunca inkübe edin. İki gün sonra, başarıyla transforme edilmiş her kuyunun dibinde küçük hücre kolonileri oluşmaya başlamalıdır.Spatting analizi hazırlığı için öncelikle, yeni bir düz tabanlı 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 200 microliters OSE bazlı minimal besiyeri dağıtın. Ardından, hücre süspansiyonunu hızlı bir plaka ile sekiz kez çekip boşaltarak transformasyon plakasındaki her bir kuyucuğu karıştırın.Raffinose plakasının her kuyucuğuna, transformasyon plakasındaki hücre karışımından beş µL ekleyin ve 30 °C'de bir gün boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her kuyucuğun dibinde küçük koloniler oluşmuş olmalıdır.Spotting deneyi laminer akışlı kabinde gerçekleştirilecektir; 96 uçlu replikatör veya frogger, alevle sterilize edin. Kolonileri frogger ile karıştırın ve ardından kolonileri selektif besiyeri plakalarına spotlayın. Spotlama işleminden sonra, plakaların kabin içerisinde beş ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin.Plakaları 30 °C'de iki ila üç gün boyunca inkübe edin. Burada, TDP 43 toksisitesinin baskılayıcılarını ve artırıcılarnı belirlemek için yapılan bir maya plazmid aşırı ekspresyon taramasının temsili sonuçları gösterilmektedir. TDP 43, amyotrofik lateral skleroz veya Lou Gehrig hastalığının patogenezinde rol oynadığı belirtilen bir insan proteinidir; maya hücrelerinde TDP 43 ekspresyonu, agregasyona vele sitotoksisiteye yol açar.Bu plaklar, flex gen ORF ekspresyon kütüphanesinden plazmidlerle de transforme edilmiş, entegre galaktozla indüklenebilir T DP 43 plazmidli kolonileri göstermektedir. Buradaki koloniler, suşun kırmızı pigment birikimine yol açan bir mutasyona sahip olması nedeniyle kırmızı renkte görünmektedir. Soldaki plaka, T DP 43 veya flex gen plazmidlerinin ekspresyonunu baskılayan glikoz içermektedir.Sağdaki plaka, flex gen plazmidlerinde TDP 43 ve O Fs ekspresyonunu indükleyen galaktoz içermektedir. Yeşil ok ucu, daha hızlı büyüme ve daha yoğun kolonilerle belirtildiği üzere, TDP 43 toksisitesini baskılayan bir plazmidle transforme edilmiş bir koloniyi göstermektedir. Kırmızı ok ucu ise, daha yavaş büyüme ve daha az yoğun kolonilerle belirtildiği üzere, TDP 43 toksisitesini artıran bir plazmidle transforme edilmiş bir koloniyi göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerden plazma DNA'larının bir kütüphanesini nasıl dönüştüreceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-throughput-yeast-plasmid-overexpression-screen

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Mikrobiyal mühendisliğin 'tasarım-yap-test' döngüsündeki bir darboğaz, suşların işlevsel ekranlarını gerçekleştirebildiğimiz hızdır. Damlacık bazlı RNA dizilimi kullanan deney başına yüzlerce ila binlerce maya hücresine uygulanan gerinim taraması için yüksek iş letme yöntemini tanımlıyoruz.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Burada, enzimatik modifikasyon deneyleri için maya yüzeyinde görüntülenen substratların kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Platform, temsili bir enzimatik modifikasyon deneyi olarak tirozin fosfataz SHP-2'nin substratlarından birine karşı defosforilasyon aktivitesinin analizi kullanılarak gösterildi.

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae hücrelerini yüksek verimli plazmid overekspresyon taramaları için otomatik dönüştürme protokolünü. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık proteinlerinin toksisitesini modifiye eden genetik faktörleri belirlemeye yardımcı olur.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Daha fazla video keşfet