Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerini plazmid DNA'larından oluşan bir dizi kütüphanesi ile transforme etmektir. Bu işlem, öncelikle uygun miktarda maya hücresi yetiştirilerek gerçekleştirilir. Ardından maya hücreleri, DNA transformasyonu için yetkin hale gelmelerini sağlamak amacıyla lityum asetat ile işleme tabi tutulur.

Ardından, kompetan e hücrelerini DNA ile karıştırarak transformasyon işlemini gerçekleştirin. Prosedürün son adımı, transformantların seçilmesi ve analiz edilmesidir. Nihayetinde, maya spotting assay'leri ve/veya mikroskopi yoluyla plazmit DNA'nın maya fenotipleri üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, standart maya transformasyonları gibi mevcut protokollerin önündeki temel avantajı, çok sayıda farklı Plazmidin maya hücrelerine otomatik bir şekilde transformasyonuna olanak tanımasıdır. Bu yüksek verimli maya transformasyon protokolü 10 adet 96 kuyucuklu plaka için tasarlanmıştır, ancak ihtiyaca göre ölçeği artırılabilir veya azaltılabilir. Daha büyük ölçekli deneyler için başarının anahtarı, tüm plakaların ve reaktiflerin düzenli tutulmasıdır.

Karışıklığı önlemek için, deney başladıktan sonra bu protokolde Biobot hızlı plaka sıvı taşıyıcı kullanılacaktır. Başlangıç olarak, bir dizi maya plazmit kütüphanesinden alınan 5 ila 10 µL plazma DNA'sını, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna paylaştırın. 96 kuyucuklu plakaları kurumaları için gece boyunca temiz bir laminar akışlı kabin içinde, üzeri açık şekilde bırakın.

Ardından, 500 mL'lik bölmeli bir Lin Meyer erleninde 200 mL maya peptit dekstroz veya YPD besiyerine sorgu suşunu inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, optimal büyüme için sorgu suşunu iki litre YPD besiyerinde 0,1 OD 600 değerine seyreltin. Ayrı 2,8 L'lik bölmeli erlenlerde bir litreye kadar kültürler büyütün.

Kültürler 0,8 ile 1,0 arasında bir OD 600 değerine ulaşana kadar flaskları 30 °C'de dört ila altı saat boyunca çalkalayın. Maya kültürü 0,8 ile 1,0 arasında bir OD 600 değerine ulaştığında, hücreleri santrifüjleme yoluyla hasat edin. Dört adet tek kullanımlık 225 mililitrelik konik tüpü kültürle doldurun ve masaüstü santrifüjle 3000 RPM'de beş dakika boyunca döndürün.

Her tüpteki S süpernatanını dökün. Aynı tüplere daha fazla kültür ekleyin ve tüm hücreler hasat edilene kadar gerekirse işlemi tekrarlayarak tekrar santrifüjleyin. Her hücre peletini 50 mililitre otoklavda steril edilmiş distile su ile yıkayın ve vortexleyerek resüspande edin.

Hücreleri tek bir 225 mL'lik konik tüpte birleştirin ve 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. S süpernatantını uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 100 mL lityum asetat çözeltisi ile yıkayın. Tekrar 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

SNA'yı uzaklaştırın ve hücre peletini 70 mililitre lityum asetat çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Pelet tamamen süspande olana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin. 30 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.

Ardından, 0,1 molar beta-mercaptoethanol ekleyin ve 30 °C'de çalkalayarak 30 dakika daha inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, hücre karışımına iki mililitre kaynatılmış ve soğutulmuş somon spermi DNA'sı ekleyin. Hücre karışımını otoklavlanabilir tek kuyucuklu bir plakaya dökün ve ardından, sonraki pipetleme işlemlerine engel olabileceği için oluşan tüm çökelekleri uzaklaştırın.

Biobot hızlı plaka dağıtıcısı kullanarak, plazma DNA'sı içeren önceden hazırlanmış dört adet 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 50 µL hücre karışımı ekleyin ve karıştırmayın. Hücreler inkübe olurken, plakaları oda sıcaklığında, çalkalamadan 30 dakika boyunca inkübe edin.

200 mililitre PEG DMSO lityum asetat çözeltisi hazırlayın. 160 mililitre %50 PEG 33, 50, 20 mililitre DMSO ve 20 mililitre bir molar lityum asetatı birleştirin. Bu çözeltinin hemen kullanımdan önce hazırlanması önemlidir.

Her birine 125 µL PEG lityum asetat DMSO çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu sekiz kez aspire edip dağıtarak iyice karıştırın. Sallamadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, hücrelere kuru bir inkübatörde 15 dakika boyunca 42 °C'de ısı şoku uygulayın; ısı şokundan sonra plakaları üst üste dizmeyin, 96 kuyucuklu plakalara uygun santrifüj adaptörlerini kullanarak plakaları döndürün. Santrifüjleme işleminden sonra, plakaları bir atık kovasının üzerine ters çevirerek PEG solüsyonunu uzaklaştırın. Daha sonra ters çevrilmiş plakaları kağıt havlu üzerinde kurulayın.

Kalıntı sıvıyı uzaklaştırmak için hücreler kuyucukların dibinde bırakılacaktır. Her birine 200 µL minimal medya ekleyerek hücreleri durulayın. Plakaları tekrar santrifüjleyin.

Süpernatanı, bir atık kovasına ters çevirerek ve kağıt havluyla kurulayarak uzaklaştırın. Her kuyuya 200 µL minimal besiyeri ekleyin ve plakayı 30 °C'de, sarsmadan iki gün boyunca inkübe edin. İki gün sonra, başarıyla transforme edilmiş her kuyunun dibinde küçük hücre kolonileri oluşmaya başlamalıdır.

Spatting analizi hazırlığı için öncelikle, yeni bir düz tabanlı 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 200 microliters OSE bazlı minimal besiyeri dağıtın. Ardından, hücre süspansiyonunu hızlı bir plaka ile sekiz kez çekip boşaltarak transformasyon plakasındaki her bir kuyucuğu karıştırın.

Raffinose plakasının her kuyucuğuna, transformasyon plakasındaki hücre karışımından beş µL ekleyin ve 30 °C'de bir gün boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her kuyucuğun dibinde küçük koloniler oluşmuş olmalıdır.

Spotting deneyi laminer akışlı kabinde gerçekleştirilecektir; 96 uçlu replikatör veya frogger, alevle sterilize edin. Kolonileri frogger ile karıştırın ve ardından kolonileri selektif besiyeri plakalarına spotlayın. Spotlama işleminden sonra, plakaların kabin içerisinde beş ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin.

Plakaları 30 °C'de iki ila üç gün boyunca inkübe edin. Burada, TDP 43 toksisitesinin baskılayıcılarını ve artırıcılarnı belirlemek için yapılan bir maya plazmid aşırı ekspresyon taramasının temsili sonuçları gösterilmektedir. TDP 43, amyotrofik lateral skleroz veya Lou Gehrig hastalığının patogenezinde rol oynadığı belirtilen bir insan proteinidir; maya hücrelerinde TDP 43 ekspresyonu, agregasyona vele sitotoksisiteye yol açar.

Bu plaklar, flex gen ORF ekspresyon kütüphanesinden plazmidlerle de transforme edilmiş, entegre galaktozla indüklenebilir T DP 43 plazmidli kolonileri göstermektedir. Buradaki koloniler, suşun kırmızı pigment birikimine yol açan bir mutasyona sahip olması nedeniyle kırmızı renkte görünmektedir. Soldaki plaka, T DP 43 veya flex gen plazmidlerinin ekspresyonunu baskılayan glikoz içermektedir.

Sağdaki plaka, flex gen plazmidlerinde TDP 43 ve O Fs ekspresyonunu indükleyen galaktoz içermektedir. Yeşil ok ucu, daha hızlı büyüme ve daha yoğun kolonilerle belirtildiği üzere, TDP 43 toksisitesini baskılayan bir plazmidle transforme edilmiş bir koloniyi göstermektedir. Kırmızı ok ucu ise, daha yavaş büyüme ve daha az yoğun kolonilerle belirtildiği üzere, TDP 43 toksisitesini artıran bir plazmidle transforme edilmiş bir koloniyi göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerden plazma DNA'larının bir kütüphanesini nasıl dönüştüreceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.