Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerini bir dizi plazma DNA kütüphanesi ile dönüştürmektir. Bu, önce uygun miktarda maya hücresinin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Maya hücreleri daha sonra DNA dönüşümü için yetkin hale getirmek için lityum asetat ile muamele edilir.

Ardından, yetkin e hücrelerini DNA ile karıştırarak dönüştürün. Prosedürün son adımı, dönüştürücüleri seçmek ve analiz etmektir. Sonuç olarak, maya lekeleme testleri ve/veya mikroskopi yoluyla plazma DNA'sının maya fenotipleri üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin standart maya dönüşümleri gibi mevcut protokollere göre ana avantajı, çok sayıda farklı Plazmitin otomatik bir şekilde maya hücrelerine dönüştürülmesine izin vermesidir. Bu yüksek verimli maya dönüşüm protokolü, 10.96 kuyulu plakalar için tasarlanmıştır, ancak buna göre büyütülebilir veya küçültülebilir. Daha büyük ölçekli deneyler için başarının anahtarı, tüm plakaları ve reaktifleri düzenli tutmaktır.

Karışıklığı önlemek için deney başladıktan sonra, bu protokolde bir biobot hızlı plaka sıvı işleyici kullanılacaktır Aliquot'a başlamak için, turun her bir kuyucuğuna bir dizi maya plazmit kütüphanesinden beş ila 10 mikrolitre plazma DNA'sı. Alt 96 kuyu plakası. 96 kuyulu plakayı, kuruması için gece boyunca temiz bir tezgah çeker ocak içine açıkta yerleştirin.

Daha sonra, 200 mililitre maya peptit dekstroz veya YPD ortamını bir sorgu suşu ile 500 mililitrelik şaşkın bir Lin Meyer şişesine aşılayın, gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi sabah çalkalayın. Optimum büyüme için sorgu gerginliğini iki litre YPD ortamında 0,1'lik bir OD 600'e seyreltin. Ayrı 2,8 litrelik şaşkın şişelerde bir litreye kadar kültür büyütün.

Kültürler 0.8 ila 1.0 arasında bir OD 600'e ulaşana kadar şişeleri 30 santigrat derecede dört ila altı saat çalkalayın. Maya Kültürü 0.8 ila 1.0 arasında bir OD 600'e ulaştığında, hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Dört adet tek kullanımlık 225 mililitrelik konik tüpü kültürle doldurun ve bir masa üstü santrifüjde beş dakika boyunca 3000 RPM'lik bir döndürün.

S süpernatantını her tüpten dökün. Aynı tüplere daha fazla kültür ekleyin ve tekrar santrifüjleyin, tüm hücreler toplanana kadar gerektiği kadar tekrarlayın. Her hücre peletini 50 mililitre otoklavda damıtılmış suda yıkayın ve girdap yaparak Resus harcayın.

Hücreleri iki yüz yirmi beş mililitrelik bir konik tüpte birleştirin ve beş dakika boyunca 3000 RPM'de döndürün. S süpernatantını çıkardıktan sonra, hücreleri yüz mililitre lityum asetat çözeltisinde yıkayın. Beş dakika boyunca 3000 RPM'de tekrar döndürün.

SNA'yı çıkarın, hücre peletini 70 mililitre lityum asetat çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Pelet tamamen yeniden askıya alınana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca yüksek hızda girdap. 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin.

Daha sonra, 30 dakika daha 30 santigrat derecede çalkalayarak 0.1 molar inkübata beta me kapto etanol ekleyin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre karışımına iki mililitre haşlanmış ve soğutulmuş somon sperm DNA'sı ekleyin. Hücre karışımını otoklavlanabilir tek kuyucuklu bir plakaya dökün ve ardından oluşan çökeltileri temizleyin çünkü bu, sonraki pipetlemeyi etkileyebilir.

Biobot hızlı plaka aliquot kullanılarak, daha önce hazırlanmış dört oyuğun her birine 50 mikrolitre hücre karışımı eklenir. Plazma DNA'sı içeren 96 oyuklu plakalar karışmaz. Hücreler inkübe edilirken plakaları oda sıcaklığında 30 dakika çalkalamadan inkübe edin.

200 mililitre PEG DMSO lityum asetat çözeltisi hazırlayın. 160 mililitre% 50 PEG 33, 50 20 mililitre DMSO ve 20 mililitre bir molar lityum asetat birleştirin. Bu çözeltinin kullanımdan hemen önce hazırlanması önemlidir.

Her birine 125 mikrolitre PEG lityum asetat DMSO çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu sekiz kez aspire ederek ve dağıtarak iyice karıştırın. Çalkalamadan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 42 santigrat derecede ısıtın Kuru bir inkübatörde, ısı şokundan sonra plakaları istiflemeyin, 96 kuyulu plakayı yerleştirmek için santrifüj adaptörleri kullanarak plakaları döndürün. Santrifüjlemeden sonra, plakaları bir atık kovası üzerinde ters çevirerek PEG çözeltisini çıkarın. Sonra ters çevrilmiş plakaları kağıt havluların üzerine kurulayın.

Kalan sıvıyı çıkarmak için, hücreler kuyuların dibinde kalacaktır. Her birine 200 mikrolitre minimum ortam ekleyerek hücreleri durulayın. Plakaları tekrar döndürün.

Bir atık kovasının üzerine ters çevirerek ve kağıt havluların üzerine sürerek süpernatanı çıkarın. Hızlı bir plaka ile her bir oyuğa 200 mikrolitre minimum ortam ekleyin, sallamadan iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. İki gün sonra, başarılı bir şekilde Dönüştürülen her birinin dibinde küçük hücre kolonileri oluşmaya başlamalıdır.

Sıçrama tahliline hazırlanmak için, önce yeni bir dairenin her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre OSE bazlı minimal ortam dağıtın. Alt 96 kuyulu plaka. Önümüzdeki. Hücre süspansiyonunu hızlı bir plaka ile sekiz kez aspire ederek ve dağıtarak dönüşüm plakasının her bir kuyusunu karıştırın.

Rafinoz plakasının her bir oyuğunu, dönüşüm plakasından beş mikrolitre hücre karışımı ile aşılayın, bir gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün. Her birinin altında küçük koloniler bulunmalıdır.

Davlumbazda lekelenme testini iyi bir şekilde gerçekleştirin, 96 cıvatayı, çoğaltıcıyı veya kurbağayı alevlendirerek sterilize edin. Kolonileri bir kurbağa ile karıştırın ve ardından kolonileri seçici ortam plakalarında tespit edin. Lekelenmeden sonra, plakaların davlumbazda beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin.

Plakaları iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Burada, TDP 43.Toksisitenin baskılayıcılarını ve arttırıcılarını tanımlamak için bir maya plazmidi aşırı ekspresyon ekranının temsili sonuçları gösterilmektedir. TDP 43, maya hücrelerinde TDP 43'ü eksprese eden bir miyotrofik lateral skleroz veya Lou Gehrig hastalığının patogenezinde rol oynayan bir insan proteinidir ve agregasyon ve sitotoksisite ile sonuçlanır.

Bu plakalar, entegre bir galaktoz indüklenebilir, T DP 43 plazmidi olan ve aynı zamanda esnek gen ORF ekspresyon kütüphanesinden plazmitlerle dönüştürülmüş kolonileri gösterir. Buradaki koloniler kırmızı renkte görünür, çünkü suş kırmızı bir pigment birikimine neden olan bir mutasyona sahiptir. Soldaki plaka, T DP 43 veya esnek gen plazmitlerinin ekspresyonunu baskılayan glikoz içerir.

Sağdaki plaka, esnek gen plazmitlerinde TDP 43 ve O Fs'nin ekspresyonunu indükleyen galaktoz içerir. Yeşil ok ucu, daha hızlı büyüme ve daha yoğun koloniler ile gösterildiği gibi, TDP 43'ün toksisitesini baskılayan bir plazmit ile dönüştürülmüş bir koloniyi gösterir. Kırmızı ok ucu, daha yavaş büyüme ve daha az yoğun Koloniler ile gösterildiği gibi TDP 43'ün toksisitesini artıran bir plazmit ile dönüştürülmüş bir koloniyi gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, plazma DNA'larından kaçınma kütüphanesinin nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamış olmalısınız.