Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

Bu yöntem, mikroölçekli ekoloji ve dinamik kimyasal degradeler navigasyon mikroorganizmaların davranışını açıklamak ve ekolojik olarak ilgili mikroortamlarda gizli trade-off, besin kinetik ve nüfus dinamikleri ortaya çıkarmak için izin verir. Mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirerek, kontrol edilen kimyasal darbeler üretiyoruz, lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale geliyor, mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini ölçmek için ilk olarak kararsız kimyasal degradelere maruz kalarak. CAD yazılımını kullanarak kanalı tasarlayın ve fotoğraf maskesi oluşturmak için saydamlık filmine yazdırın.

El yazmasına göre, temiz bir odada yumuşak litografi ile usta imalat. 40 mililitrelik bir kabın 10'a 1 oranında kürleme maddesi ile elastomerbirleştirerek bir PDMS karışımı hazırlayın. Plastik bir bıçakla, sıvı homojen olana kadar şiddetle karıştırın.

PDMS karışımını oda sıcaklığında 45 dakika boyunca vakum odasında hemen gazdan arındırın. İşlemi hızlandırmak için, arabirimde meydana gelen kabarcıkları patlatmak için vakumu periyodik olarak bırakın. Basınçlı bir temizleyici ile ana yüzeyinin tozunu çıkarın.

Sonra ana üzerine gazdan pdms karışımı dökün ve iki saat boyunca 80 derece santigrat bir fırında pişirin. PDMS'yi mikroyapıların etrafında ki bir bıçakla yaklaşık beş milimetre mesafeden kesin ve pdms'yi anadan dikkatlice soyun. Mikrokanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet vermek için delik açar.

Toz birikimini önlemek için mikro kanalı yapışkan bantla kapatın. 3B tasarım yazılımı kullanarak 3B şekli tasarla ve yüksek çözünürlüklü 3D yazıcıyla PDMS kalıbı için ana yı yazdırın. PDMS karışımını daha önce olduğu gibi hazırlayıp gazdan çıkardıktan sonra, yapıştırıcı bantla dabbing yaparak ustanın yüzeyini temizleyin.

Ustayı bir ölçeğe koy. Daha sonra, ana merkezi bölge kaçınarak, 0,5 milimetre ana yüksekliği eşleştirerek PDMS istenilen yükseklik elde etmek için 23.4 gram unred PDMS karışımı dökün. Basınçlı hava yardımı ile kalan kabarcıkları çıkarın.

PDMS döküm en az 12 saat pişirin 45 santigrat derece bir fırında master yerleştirin. Daha sonra, yavaşça sertleştirilmiş PDMS tabakası soyma ve bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu için giriş ve çıkış delikleri yumruk. Bir Petri kabının yüzeyini ve PDMS kalıbını oksijen plazması ile iki dakika aktif hale getirin.

PdMS kalıbını Petri kabına hafifçe bastırarak Petri kabına bağlayın. Özelliklerin bulunduğu yere basmaktan kaçının. PdMS 3D kalıbına bağlanmış Petri kabını, kimyasal bağı güçlendirmek için en az 12 saat boyunca 45 derecede bir fırında yerleştirin.

Daha sonra, oda sıcaklığında bir dakika lığına oksijen plazma odasında nanogözenekli polikarbonat membranı etkinleştirin. Kimyasal bir başlık altında, bir polipropilen tüp kullanarak hacim olarak% 1 deiyonize su 3-aminopropyltriethoxysilane ticari bir çözelti seyreltmek. Seyreltilmiş 3-aminopropiltrietoksisilane çözeltisini petri kabına aktarın ve aktif membranı 3-aminopropiltriethoxysilane çözeltisinde 20 dakika batırın.

Sonra, cımbız ile 3-aminopropyltriethoxysilane çözeltisi membran çıkarın ve kuruması için temiz bir oda silme yerleştirin. Membran üzerinde yer alacak ve bakteriyel arenanın yıkanması için pdms mikroakışkan kanalların imalatı için, daha önce yapıldığı gibi tek kimyasal darbe deneyi için mikroakışkan cihazın imalatını tekrarlayın. PDMS yıkama kanallarını fonksiyonel membrana bağlamak için, önce hem PDMS yıkama kanalını hem de polikarbonat membranı oksijen plazma haznesiyle iki dakika aktif hale getirin.

Plazma tedavisinden hemen sonra, PDMS yıkama kanalına membranüzerine hafifçe basarak işlevsel membranı ve PDMS yıkama kanalını temasa getirin. PDMS ve membranı hafifçe birbirine bastırmak önemlidir veya membran 200 mikrometre yüksekliğindeki PDMS mikrokanalının tavanına geri dönülmez şekilde bağlanmış olabilir. Daha sonra, hem bağlı laminat PDMS yıkama kanalı polikarbonat membran ı etkinleştirin hem de daha önce Petri kabına bağlanmış 3D PDMS kalıbını iki dakika lığına oksijen plazma odasına yerleştirerek etkinleştirin.

Membranı iki PDMS katmanı arasında sandviç ve birlikte bastırın. Petri kabını sandviç yapısına bağlı olarak 45 derecede, kimyasal bağı güçlendirmek için en az 12 saat fırında yerleştirin. Başlamak için, 20 dakika boyunca vakum altında miliakışkan oda korumak.

Daha sonra, miliakışkan hazneiçeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir pipet ile, yapay deniz suyunda bir milimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat çözeltisi GFP-floresan Vibrio ordalii seyreltik bakteriyel süspansiyon ile membran altında oda doldurun. Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, bir kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür.

Bir şırıngayı bir milimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat yapay bir deniz suyu çözeltisi ile doldurun ve membran üzerinde yıkama kanalının giriş ve çıkış boru takın. Boruyu bir atık haznesine bağlayın ve basınç salınımlarını önlemek için borunun sıvı atık haznesine tamamen batırDığından emin olun. Şırınga pompasındaki akış hızını dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın.

Membran üzerinde yıkama kanalında akış kurmak için şırınga pompası başlatın. LED ışını ve mikroskop aşamasını kontrol eden yazılımı başlatın ve farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı darbe dizileri oluşturun. Büyük bir yüzeyi kapsayacak şekilde birkaç saatlik bir süre boyunca ve birden fazla bitişik konum üzerinde düzenli zaman aralıklarında 4x hedefi kullanarak video kaydedin.

Bu çalışmada, mikroakışkan ve miliakışkan cihazlar dinamik besin koşulları altında bakteriyel kemotaktik yanıt ve birikim profilleri çalışma için kullanılmıştır. Maksimum yoğunluklu projeksiyonlar, darbe nin salınımını hemen izleyen 0,5 saniyelik bir aralıkta ve nabız salınımını 40 saniye sonra, beyaz izlerle gösterilen bakteriyel pozisyonu gösterir. Bakteriyel yörüngeler de darbe nin serbest bırakılmasından 60 saniye sonra siyah olarak gösterilmiştir.

Gölgeli bölge, görüntü alanının ortasında fotoiztarafından salınan kimyasal darbeyi temsil eder. Görüş alanının merkezinde nabız salınımını takiben radyal sürüklenme hızının zamansal dinamiği nin yanı sıra bakteri konsantrasyonu da burada gösterilmiştir. Sürüklenme hızının negatif değerleri, darbenin merkezine doğru yönlendirilmiş kemotaktik harekete karşılık gelir.

Yüzme istatistikleri burada kimyasal degradelerin yokluğunda bir bakteri popülasyonu için sunulmaktadır. Yörüngeler mikrokanaldaki üç boyutlu bakteri hareketinin iki boyutlu projeksiyonlarını temsil eder. Ölçülen bakteriyel yüzme hızının olasılık dağılımı gama dağılımına uygundu.

Bakteriyel yörüngelerden, ardışık yönlendirmeler arasındaki zamanın olasılık dağılımı ayıklanmıştır. Yeniden yönlendirme deseni, yüzme hızının dağılımı ve organizmaların yeniden yönlendirme istatistikleri bireysel tabanlı bir modeli bilgilendirmek için kullanıldı. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan üzerinde test edilmiştir, ancak önerilen metodoloji geniş türler ve kemoattractants farklı kombinasyonu için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için, mekansal heterojen ve dinamik koşullarda nüfus ve toplum dinamikleri gibi.

Mikrobiyal ekoloji ve mikrobiyolojideki klasik teknikler, örneğin toplu kültürlerdeki büyümeler veya chemostatlar gibi, mikrobiyal habitatların spatio-zamansal özelliklerini büyük ölçüde göz ardı etmektedir. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin neredeyse anında oluşturulması, deniz bakterilerinin vahşi doğada karşılaştıkları besin bakliyatlarının türünü çeşitli kaynaklardan yeniden üretmeyi amaçlamaktadır, örneğin, batan organik parçacıkların arkasında tüylerin yayMası veya lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin. Aminosilane çözeltisi akut toksik ve aşırı dikkatli ele alınmalıdır.

Biz sadece duman kaputaltında çalışmak ve laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü ve eldiven gibi koruyucu ekipman giymek. Ürettiğimiz atıkların da icabına bakarız.