Name: Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, mikroorganizmaların dinamik kimyasal gradyanlara yönelik kemotaktik davranışlarını mikroakışkan cihazlar ve fotoliz kullanarak nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem, besin kinetiği ve popülasyon dinamikleri hakkında gerçek zamanlı içgörüler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ETH Zürih'te Ilk mikrofabrikasyon tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (D.R.B.), Gordon ve Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (R.S.) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı bursu ile desteklenmiştir. 1-002745-000 (R.S.'ye).

1. Tek Kimyasal-darbe Deneyi için Mikroakışkan Cihazın İmalatı
<ol><li>Bilgisayarı destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak kanalı tasarlayın ve fotoğraf maskesi oluşturmak için şeffaflık filmine yazdırın(Şekil 1A).</li>
	<li>Ustayı yumuşak litografi ile (temiz oda koşullarında) üretin.<ol>
<li>Temiz bir silikon gofret (4 inç) aseton ile hızlı bir şekilde art arda, metanol ve izopropanol, sonra azot kullanarak kuru. 5 dk için 130 °C fırında gofret pişirin.</li>
		<li>Gofret bir spin-coater merkezine yerleştirin ve gofret üzerine SU-8 photoresist dökün. 5 s üzerinden 500 rpm'ye kadar spin-coater hızını rampa ve 10 s. Rampa 10 s üzerinde son hıza kadar 500 rpm tutmak ve 30 s için bu hızda korumak. NOT: Son hızın tam değeri hedeflenen kaplama kalınlığına ve kullanılan SU-8'e bağlıdır.</li>
		<li>Spin kaplama işleminden sonra gofret 65 °C'de ve 95 °C'de pişirin. En az 5 dakika oda sıcaklığında (RT) gofret soğumasını bekleyin. NOT: Pişirme süresi hedeflenen kalınlığa ve kullanılan fotodirenç türüne bağlıdır. Genel bir kural olarak, her 100 μm tabaka için gofret 65 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 45 dakika pişirilmelidir.</li>
		<li>Sadece ilgi alanının açığa çıkarve polimerize olmasını sağlamak için fotoğraf maskesini gofrete yerleştirin. SU-8 kılavuzunda önerilen süre boyunca UV ışığına maruz kanın. NOT: Burada, 350 nm dalga boyunda 200 mJ cm-2 pozlama enerjisi ile gofret 150 s.'ye maruz kalmıştır.</li>
		<li>SU-8 kılavuzunda önerilen süre için 65 °C ve 95 °C'de gofret pişirin. NOT: Genel bir kural olarak, her 100 μm tabaka için gofret 65 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 45 dakika pişirilmelidir.</li>
		<li>Ana elde etmek için polimetil metakrilat (PMMA) geliştirici ile dolu bir beher içinde gofret batırın. Polimerize edilmemiş fotodirenç yıkandığından emin olmak için kabı hafifçe sallayın. SU-8 tabakasını daha fazla bağlamak için 200 °C'de ustayı pişirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Elastomerile kürleme maddesi(Malzeme Tablosu)ile bir kabın 10:1 oranında (burada, 40 mL) birleştirerek bir polidimethylsiloxane (PDMS) karışımı hazırlayın. Sıvı homojen olana kadar şiddetle karıştırın. NOT: Karıştırma işlemi sırasında kabarcıklar oluşturulduğundan PDMS karışımı opak görünür. DİkKAT: Cildin potansiyel olarak tehlikeli kimyasallar veya biyolojik maddeile temas etmesini önlemek için, protokol boyunca her zaman bir laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık plastik eldiven giyin ve Malzeme'ye uygun özel güvenlik protokollerini uygulayın Güvenlik Veri Sayfası (MSDS).</li>
	<li>PDMS karışımını 45 dk.'lık bir vakum odasında RT'de gazlayın. İşlemi hızlandırmak için, arabirimde meydana gelen kabarcıkları patlatmak için vakumu periyodik olarak bırakın. NOT: PDMS karışımının tedaviye başlamasından korunmak için gaz giderme işlemi 1 saat içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>Basınçlı bir temizleyici ile ana yüzeyinin tozunu çıkarın, sonra gazdan arındırılmış PDMS karışımını ananın üzerine dökün ve 80 °C'de 2 saat fırında pişirin. NOT: Alternatif olarak, 60 °C'de geceleme (veya en az 12 saat) pişirme aynı sertleştirilmiş PDMS elde edebilirsiniz.</li>
	<li>PDMS'yi mikroyapıların etrafında bir bıçakla kesin (yaklaşık 5 mm mesafede) ve ardından PDMS'yi anadan dikkatlice soyun.</li>
	<li>Mikrokanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet vermek üzere delik açma (burada, bir giriş ve bir çıkış, Bkz. Şekil 1A). Özelliklerin bulunduğu PDMS'nin alt yüzüne hiçbir şeyin dokunmadığından emin olun. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Mikrokanal depolama sırasında toz ve diğer parçacıkların birikmesini önlemek için yapışkan bant ile kapatılmalıdır.</li>
	<li>PDMS mikrokanalını cam bir slayta bağlayın.<ol>
<li>Cam bir kaydırağı sabun, isopropanol ve deiyonize suyla iyice temizleyin. Cam ın kurumasını bekleyin veya süreci hızlandırmak için basınçlı hava kullanın.</li>
		<li>Yapışkan bantla dabbing ederek toz parçacıklarını çıkarın. 2 dakika boyunca her iki yüzeyi plazma ile (korona sistemi veya plazma oksijen odası kullanarak) tedavi ettikten hemen sonra, temiz cam kaydırak üzerindeki PDMS mikrokanalını bağlayın.</li>
		<li>Mikroakışkan cihazı 80 °C'de sıcak bir plaka üzerinde en az 1 saat ısıtarak camla olan kimyasal bağı güçlendirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Çoklu Bakliyat deneyi için 3D baskılı Milliakışkan Aygıtın Imalatı
<ol><li>3D tasarım yazılımı kullanarak 3B şekli tasarla ve yüksek çözünürlüklü 3D yazıcı(Şekil 1B)ile PDMS kalıp için ana yazdırın. NOT: Ana yı oluşturmak için kullanılan 3B yazıcı ve kalıp malzemesi için Malzeme Tablosu'na bakın.</li>
	<li>Adımları 1,3−1.4'ü tekrarlayın, ardından yapışkan bantla dabbing yaparak ana yüzeyini temizleyin. Bir ölçekte ana koyun, daha sonra, membran tarafından işgal edilecek ana merkezi bölge kaçınarak, ana yüksekliği eşleştirerek PDMS istenilen yüksekliği elde etmek için unred PDMS karışımı (burada, 23,4 g) tam miktarı dökün (burada, 0,5 mm). Basınçlı hava yardımı ile kalan kabarcıkları çıkarın.</li>
	<li>PDMS dökümen az 12 saat pişirin 45 °C'de bir fırında ana yerleştirin.</li>
	<li>3D PDMS kalıbını Petri kabına bağlayın.<ol>
<li>Yavaşça sertleştirilmiş PDMS tabakası soyma ve bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu için yumruk girişi ve çıkış delikleri(Şekil 1C).</li>
		<li>Petri kabının (90 mm x 15 mm) yüzeyini ve PDMS kalıbını 2 dk. oksijen plazmasıyla 2 dk. Petri kabına bağlayın. Kalıbı Petri kabına hafifçe bastırın, ancak bu durum sorgulama odasını çökertebileceğinden özelliklerin bulunduğu yere basın.</li>
		<li>PdMS 3D kalıbına bağlanmış Petri kabını 45 °C'de en az 12 saat fırında dondurun ve kimyasal bağı güçlendirin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Membran yüzey işlevselleştirme18<ol>
<li>RT'de 1 dakika boyunca bir oksijen plazma odasında nanogözenekli polikarbonat (PCTE) membranı etkinleştirin. DİkKAT: Plazma aktivasyonu için korona sistemi kullanmaktan kaçının, çünkü membrana zarar verir.</li>
		<li>Kimyasal bir başlık altında, bir polipropilen tüp kullanarak, hacim (burada, 40 mL) ile% 1 deiyonize su 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) ticari bir çözelti seyreltmek. DİkKAT: APTES çözeltisi akut toksiktir (MSDS sağlık tehlike skoru 3) ve sadece eldivenli kimyasal başlık altında aşırı özenle ele alınmalıdır. APTES çözümünü işledikten hemen sonra eldivenleri değiştirin. APTES dumanları mukoza ve üst solunum yolları için yıkıcıdır. APTES'in hedef organları sinirler, karaciğer ve böbrektir. Bir duman kapağı yoksa, bir yüz kalkanı ve tam yüz solunum uygulanmalıdır.</li>
		<li>Seyreltilmiş APTES çözeltisini petri kabına aktarın ve aktif membranı 20 dakika boyunca APTES çözeltisindeki batırın.</li>
		<li>Membranı cımbızla APTES çözeltisinden çıkarın ve kuruması için temiz bir sile yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Membran üzerinde yer alan ve bakteri alanının yıkanmasına izin verecek PDMS mikroakışkan kanalların imalatı için 1.1−1.7 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>PDMS yıkama kanallarını işlevsel membrana bağlayın.<ol>
<li>2 dakika boyunca hem PDMS yıkama kanalını hem de PCTE membranını oksijen plazma haznesi ile etkinleştirin. NOT: İki PDMS katmanı arasında sıkıştırılacak olan membran, PDMS yıkama kanalından daha küçük olmalıdır.</li>
		<li>Plazma tedavisinden hemen sonra, PDMS yıkama kanalına membranüzerine hafifçe basarak işlevsel membranı ve PDMS yıkama kanalını temasa getirin. NOT: Bu aşamada aşırı basınç uygulamayın, çünkü membranın kanalın çatısına bağlanmasına (geri dönülemez) bağlı olmasına ve kanalın tıkanmasına neden olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İki PDMS katmanı arasında membran sandviç(Şekil 1E).<ol>
<li>Hem bağlı laminat PDMS yıkama kanalı−PCTE membranını hem de petri kabına daha önce 2 dakika oksijen plazma odası ile bağlanmış 3D PDMS kalıbını etkinleştirin.</li>
		<li>Petri kabını sandviç yapısına bağlı olarak 45 °C'de en az 12 saat fırında yerleştirin ve kimyasal bağı güçlendirin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hücre Kültürü
<ol><li>V. ordalii (12B09 veya 12B09pGFP) popülasyonu 2216 orta19'da 20 saat boyunca 30 °C'de bir orbital shaker (600 rpm) ve geç üstel fazda hasat hücreleri üzerinde bir gecede büyütün. pGFP barındıran izole için, plazmid korumak için spectinomycin (50 μg mL-1)ekleyin.</li>
	<li>3 dk için 2500 x g'de 1 mL'lik bir hücre aliquot'u santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve filtrelenmiş yapay deniz suyunun 1 mL'inde hücreleri yeniden askıya alın. Bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>V. ordalii popülasyonuna 30 °C'de bir orbital shaker (600 rpm) üzerinde 3 saat aç.</li>
	<li>4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat (MNI-kafesli-L-glutamat) 10 mM (burada, 1 mL) bir stok yapay deniz suyu çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. NOT: Fotoluzun oluşmasını önlemek için MNIkafesli-L-glutamat çözeltisini ortam ışığından koruyun.</li>
	<li>1 mM MNI kafesli-L-glutamat yapay bir deniz suyu çözeltisi aç hücreleri yeniden askıya alarak hücreleri 50x seyreltin. NOT: Bu, 5 x 107 mL-1'den daha düşük bir bakteri konsantrasyonu sağlayacaktır (tam değer genellikle ~109 mL-1olan geç üstel hücrelerin ilk konsantrasyonuna bağlıdır). Bakteri konsantrasyonu optik yoğunlukta (OD) 600 nm'lik bir spektrofotometre kullanılarak tahmin edilebildi.</li>
</ol>4. Uncaging Protokolünün Kalibrasyonu
<ol><li>MNI kafesli-L-glutamat20'lik yapay deniz suyu çözeltisinin damlacıklarını (20 μL) cam bir kaydırağa C0 = 10 mM konsantrasyonuna yerleştirin. Damlacık dairesel bir PDMS odası (çapı d = 5 mm, yükseklik h = 250 μm) ile kaplayarak kapsüllemek.</li>
	<li>Cam kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve 20 ms'lik tüm hazneyi 4x nesnel (sayısal diyafram [NA] = 0,13) kullanarak 395 nm (güç 295 mW) dalga boyunda bir LED ışınına maruz bırakın.</li>
	<li>PDMS odasını açın ve UV-Vis spektrofotometre ile analiz için bir damlacık (1 μL) ayıklayın.</li>
	<li>0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (veya kimyasal reaksiyon doygunluğu kadar) ve 0 s (arka plan elde etmek için) LED aydınlatma farklı süreler için 4.1−4.3 adımları tekrarlayın. 4.1−4.4 yordam adımlarını en az 3x (burada, 4x) çoğaltın.</li>
	<li>Emme spektrumundan, kafes molekülü21'inemilim spektrumunda zirveyi temsil eden 405 nm değerindeki değeri ayıklayın. LED pozlama14ile kimyasal uncaging reaksiyonunun k oranını belirlemek için, deneysel verilerin sayısal uyumu için aşağıdaki birinci dereceden kinetik denklemi kullanın17 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60589/60589equ01.jpg"> c(t) çözeltisinin emilim spektrumunun değeri 405 nm (arka plan alındıktan sonra) t saniyesi açKınlama süresi ile. Kt 1 gibi küçük uncaging zaman t için, Eq. 1 doğrusal formülasyon basitleştirilmiş olabilir <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60589/60589equ02.jpg">
</li>
</ol>5. Tek Kimyasal-darbe Deneyi
<ol><li>PdMS içindeki gaz konsantrasyonunu azaltmak için mikroakışkan kanalı 20 dakika vakum altında saklar, böylece kabarcıkların dolum işlemi sırasında oluşma olasılığı daha düşüktür.</li>
	<li>Vakum pompası kanal ayıklayın ve hemen 1 mM MNI-kafesli-L-glutamat yapay deniz suyunda seyreltik bakteriyel süspansiyon tanıtmak yavaşça mekanik kesme kuvvetleri tarafından kamçı hasarını önlemek için bir mikropipet kullanarak mikrokanal içine (burada, tüm dolum işlemi 5-10 s sürdü). Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür. NOT: Bu şekilde haznedeki sıvı akışı engellenir.</li>
	<li>Mikrokanalı bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve orta kanalda görüş alanını ayarlamak için sahneyi hareket ettirin. 12 fps kare hızında faz kontrastı (4x hedef) görüntüleme gerçekleştirmek için mikroskop ayarlayın. NOT: Bu değer çeşitli olabilir, ancak görüntü analizi yoluyla bakteriyel yörüngelerin yeniden yapılandırılmasına izin vermek için 10 fps'den az olmamalıdır (bkz. protokol bölüm 7).</li>
	<li>LED ışınının iğne deliğini minimum diyafram açıklığına ayarlayın. Kameranın pozlama süresini 5 s'e ayarlayarak, LED ışınının mekansal konumunun ve boyutunun hassas ölçümlerini elde etmek için birkaç kare kaydedin. NOT: LED ışık kaynağı sıvı ışık kılavuzu bağlantısı ile mikroskobun epi-floresan aydınlatıcısına bağlanır. Led ışını video yakalamayı etkilemez, çünkü video edinimi ve LED stimülasyonu yazılım aracılığıyla bağımsız olarak yönetilir.</li>
	<li>Mikroskop yazılımı aracılığıyla (en büyük kimyasal darbe için 20 dakika) toplam 10 dakika boyunca sürekli görüntüleme yapın ve aynı anda istenilen süre boyunca (bu deneyde, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) kullanıcı tanımlı bir zaman noktasında (burada, video edinimi başladıktan 10 dakika sonra) 395 nm'de odaklanmış LED ışını etkinleştirin. Aynı işlemin birden fazla çoğaltma elde etmek için, mikroakışkan kanalın farklı konumları üzerinde bakteriyel yanıtı kaydetmek için sahne hareket ettirin. Yeni bir mikrokanal kullanarak her darbe boyutu için bu yordamı çoğaltın. NOT: Caging işlemi görüntüleme düzleminde radyal olarak dışa doğru yayılan bir eksenymmetrik silindirik darbe oluşturur.</li>
	<li>Bakterilerin tarafsız yüzme hareketini kaydetmek için daha yüksek bir kare hızında (50 fps) daha yüksek büyütme hızında (20x objective, NA = 0.45) kimyasal uncaging olmadan ayrı deneyler yapın.</li>
</ol>6. Çoklu Kimyasal-darbe Deneyi
<ol><li>20 dakika vakum altında miliakışkan oda koruyun.</li>
	<li>Miliakışkan hazneyi içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Membranın altındaki odayı seyreltik bakteriyel süspansiyonla doldurun (burada, tüm dolum işlemi 10−15 s) GFP-floresan V. ordalii 1 mM MM MNI-kafesli-L-glutamat çözeltisi suni deniz suyunda. Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür. NOT: Bu şekilde haznedeki sıvı akışı engellenir. Görüntülemenanogözenekli membran üzerinden meydana gelen bu kurulumda bakterilerin daha iyi görselleştirilmesi ne izin vermek için, kuvvetle yabani tip (tek kimyasal-darbe deneyde kullanıldığı gibi) floresan suşları kullanılması tavsiye edilir.</li>
	<li>Bir şırıngayı 1 mM MNI kafesli-L-glutamat lı yapay bir deniz suyu çözeltisi ile doldurun ve membranın üzerindeki yıkama kanalının giriş ve çıkışına boru takın.</li>
	<li>Boruyu bir atık haznesine bağlayın ve basınç salınımlarını önlemek için borunun sıvı atık haznesine tamamen batırDığından emin olun.</li>
	<li>Şırınga pompasına uygun akış hızını (burada, 50 μL dk-1)ayarlayın ve kanal geometrisine bağlı olan yıkama kanalında istenilen ortalama akış hızını elde edin.</li>
	<li>Membran üzerinde yıkama kanalında akış kurmak için şırınga pompası başlatın.</li>
	<li>Farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı darbe dizileri oluşturmak için LED ışını ve mikroskop aşamasını kontrol eden yazılımı çalıştırın. NOT: Membranın üzerindeki yıkama kanalında 1 mM MNI kafesli-L-glutamat ın yapay deniz suyu çözeltisinin sürekli akışı kafesli bileşik çözeltiyi yeniler ve harcanan ortamı bakteriyel arenadan yıkar.</li>
	<li>Büyük bir yüzeyi kapsayacak şekilde birkaç saatlik bir süre içinde ve birden fazla bitişik konumda düzenli zaman aralıklarında 4x nesnel kullanarak video kaydedin (burada, 1 cm x 1 cm, Şekil 1F).</li>
</ol>7. Görüntü Analizi ve Veri Analizi
<ol><li>Bakteriyel yörüngelerin yeniden yapılandırılması<ol>
<li>4x hedefi ile kaydedilen filmlerden, izleme yazılımı17kullanarak bakteriyel yörüngeleri yeniden. NOT: Bu yörüngeler mikrokanaldaki 3B bakteriyel hareketin 2B projeksiyonlarını temsil eder.</li>
		<li>Yeniden inşa edilen bakteriyel yörüngelerden, yüzme hızını kimyasal darbenin merkezine doğru yöne yansıtarak her yüzme bireyinin radyal sürüklenme hızını belirleyin(Şekil 2D). Radyal sürüklenme hızının spatio-temporal dinamiklerinin görselleştirilmesi için, uzamsal boyutu 75 μm x 75 μm ve 5−10 s aralığındaki zamansal pencere(Şekil 2D,E)olan bir binning ızgarası kullanın. NOT: Sürecin silindirik simetrisi nedeniyle, veriler kutupsal koordinatlarda analiz edilebilir ve açısal boyut üzerinden ortalama olarak(Şekil 3).</li>
		<li>Yeniden inşa edilen bakteriyel yörüngelerden, kimyasal darbelere tepki olarak bakterilerin dağılımının spatio-zamansal dinamiklerini belirleyin(Şekil 2E).</li>
		<li>Tek darbe deneyleri sırasında 20x hedefi ile kaydedilen yüksek çözünürlüklü filmlerden, kimyasal darbeye yanıt olarak yüzme hızının dağılımını ve bakteri popülasyonunun çalışma süresini ayıklayın(Şekil 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kemotaksis tamamlandıktan sonra bakteri popülasyonunun dağılım dinamikleri göz önünde bulundurularak bakteri difüzyon katsayısını tahmin etmek17 (burada, t &gt; 300 s; Şekil 3).</li>
	<li>Stokes-Einstein denklemini uygulayarak glutamat difüzyon katsayısını tahmin edin <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60589/60589equ03.jpg"> amino asit moleküllerinin hidrodinamik yarıçapı22rGolan küresel parçacıklar olduğu varsayıldığı yerde, kB Boltzmann sabitidir (1,38 x 10-23 m 2 kg s-2 K-1), T sıcaklıktır (296 K) ve 23 °C'de yapay deniz suyunun dinamik viskozitesi (tuzluluk 36 g kg-1)23
</li>
</ol>

<ol><li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArmitage%2C+JP+%22The+biology+of+the+chemotactic+response%22">The biology of the chemotactic response</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li>
<li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+recyclers%3A+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li>
<li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+diversity+modulates+population+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895(2016).</li>
<li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li>
<li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds%3A+New+tools+for+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li>
<li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific%2C+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li>
<li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuBi-Glutamate%3A+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signal+integration+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li>
<li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li>
<li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li>
<li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985(2015).</li>
<li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li>
<li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible%2C+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548(2010).</li>
<li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Marine+Research%22%5BJournal%5D)">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li>
<li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel%2C+fast+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li>
<li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm%3A+Photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li>
<li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T%3D298.15K%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Thermodynamics%22%5BJournal%5D)">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li>
<li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophysical+properties+of+seawater%3A+a+review+of+existing+correlations+and+data%5BTitle%5D)+AND+%22Desalination+and+Water+Treatment%22%5BJournal%5D)">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li>
<li>Nikon depth of field calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019).</li>
<li>Kiørboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates%3A+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li>
<li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li>
<li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231(2011).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li>
<li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yöntem, araştırmacıların mikro ve miliakışkan cihazlarda kontrollü, dinamik degradeler altında bakteriyel kemotaksileri incelemelerine olanak sağlayarak tekrarlanabilir veri toplamayı mümkün kılmasını sağlar. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin yakın anında oluşturulması, örneğin, batan deniz parçacıkları25arkasında tüylerin diffüzive yayılması, ya da lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin sinyalleri bir dizi doğada karşılaşma besin bakliyat türlerini yeniden üretmeyi...

Mikroplar chemotaxis güveniyor, kimyasal degradeler tespit ve yanıt motilite değiştirme süreci1, kimyasal manzara gezinmek için, besin kaynakları ve konakları yaklaşım, ve zararlı maddeler kaçmak. Bu mikroölçekli süreçler mikroplar ve çevreleri arasındaki etkileşimlerin makroölçekli kinetik belirlemek2,3. Mikroakışkanlar ve mikrofabrikasyon teknolojilerinde son zamanlarda ki gelişmeler, yumuşak litografi4de dahil olmak üzere, mikropların etkileşimlerini incelemek için kontrollü mikroortamlar yaratma yeteneğimizi kökten leştirmektedir. Örneğin, geçmiş deneyler yüksek besin konsantrasyonları için yüksek kontrollü, kararlı degradeler üreterek bakteriyel kemotaksis inceledik5,6. Ancak, doğal ortamlarda, mikro ölçekli kimyasal degradeler moleküler difüzyon tarafından kısa ömürlü―dağılmış―ve arka plan koşulları genellikle yüksek seyreltik7. Mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini doğrudan ölçmek için, mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirmek için yöntemler tasarladık ve burada tanımladık, böylelikle vahşi bakterilerin doğada karşılaştıkları degradeleri taklit ettik.
Uncaging teknolojisi, biyomolekülleri aktif olmayan bir biçimde işlevsel olarak kapsülleyen ışığa duyarlı problar kullanır. Işınlama kafesli molekülü serbest bırakır, biyolojik bir sürecin hedeflenen tedirginliği sağlar8. Hücresel kimyanın hızlı ve hassas kontrolü sayesinde 9,kafesli bileşiklerin fotolsisi geleneksel olarak biyologlar, fizyologlar ve nörologlar tarafından genlerin aktivasyonunu incelemek için kullanılmıştır10, iyon kanalları11, ve nöronlar12. Daha yakın zamanda, bilim adamları kemotaksis13çalışma fotoliz önemli avantajları kaldıraçlı var , bir adım adım kemoattractant uyarıcı maruz bireysel bakteri hücrelerinin flagella anahtarlama dinamiklerini belirlemek için14,15, ve üç boyutlu tek sperm hücrelerinin hareketlilik desenleri araştırmak için (3D) gradyanlar16.
Yaklaşımımızda, kafesli amino asitlerin fotolizisini mikroakışkan cihazlar içinde uygulayıp, bir bakteri popülasyonunun kontrollü kimyasal darbelere karşı davranışsal tepkisini incelemek için, fotosalınım yoluyla neredeyse anında kullanılabilir hale gelir. Düşük büyütme (4x) hedefinin (NA = 0,13, odak derinliği yaklaşık 40 μm) kullanımı, hem binlerce bakterinin geniş bir görüş alanı (3,2 mm x 3,2 mm) üzerinde popülasyon düzeyindeki toplama tepkisini gözlemlemenizi hem de tek hücre düzeyinde hareket ölçümü sağlar. Bu yöntemin iki uygulamasını salıyoruz: 1) tek tip koşullardan başlayarak bakteri birikimi−dağılım dinamiklerini incelemek için tek bir kimyasal darbenin serbest bırakılması ve 2i) zaman değişen, mekansal heterojen kemoattractant koşullar altında bakteri birikimi dinamiklerini karakterize etmek için birden fazla darbenin serbest bırakılması. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan test edilmiştir17, ama yöntem geniş tür ve kemoattractants farklı kombinasyonları için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için (örneğin, besin alımı, antibiyotik maruzkalma, çoğunluk algılama). Bu yaklaşım, mikroorganizmaların gerçekçi ortamlardaki ekoloji ve davranışlarını niçin açıklığa kavuşturmayı ve geçici dinamik degradelerde gezinirken tek tek bakterilerin karşılaştıkları gizli dengeleri ortaya çıkarmayı vaat eder.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan (APTES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>>% 98 saflık, oldukça toksik</td></tr><tr><td>CELLSTAR tüp Greiner</td><td>Bio-One</td><td>210261</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td>, <td>bakteri kültüründen harcanan ortamı ortadan kaldırmak için</td></tr><tr><td>Dijital İnkübatörler Incu-Line</td><td>VWR-CH</td><td>390-0384</td><td>3D master</td></tr><tr><td>Duster pişirmek için</td><td>Gofret ve mikrokanalları temizlemek için</td> <td>VWR-CH</td><td>16650-22</td></tr><tr><td>Mikrokanalları yapıştırmak için</td><td>sıcak plaka</td><td>VWR-CH</td><td>444-0601</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>LightSafe mikro santrifüj tüpleri</td> Görüntü analizi ve bakteri takibi <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> için Sigma-Aldrich Z688312 1,5 ml MATLAB Mathworks <td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop cam slayt</td><td>VWR-CH</td><td>631-1552</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse TiE</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100</td><td>motorlu kademeli</td></tr><tr><td>MNI-Glutamat</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1490></td><td>98 % saflık, ışığa duyarlı</td></tr><tr><td>Kalıp baskı ekipmanları</td><td>Stratasys</td><td></td><td>Objet30 3D yazıcı</td></tr><tr><td>Kalıp baskı hizmeti</td><td>3D Baskı Stüdyoları</td><td>Özel</td><td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td></tr><tr><td>Nanodrop One UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td>, <td>kafesi açmayı kalibre etmek için</td></tr><tr><td>NIS Elemanları</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Mikroskop Görüntüleme Yazılım</td></tr><tr><td>Fırın Venti-Line</td><td>VWR-CH</td><td>466-3516</td><td>PDMS pişirmek için (zorlanmış konveksiyon ile)</td></tr><tr><td>Photoresist SU-8-3050</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-3050</td><td></td></tr><tr><td>Plazma odası Zepto</td><td>Diener Elektronik</td><td>ZEPTO-1</td>, <td>Polikarbonat</td></tr><tr><td>membran</td><td>Sterlitech</td><td>PCT0447100</td><td>0.4 & mikro; m gözenek boyutu, %19 açık alan, 24 & m kalınlık</td></tr><tr><td>Polietilen mikroboru</td><td>Bilimsel Ürünler</td><td>BB31695-PE / 2</td><td>ID x OD: 0.015 "x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm</td></tr><tr><td>Polistiren Petri kabı</td><td>VWR-CH</td><td>25373-100</td><td>alt yüzey (90 mm x 15 mm) miliakışkan cihazı bağlamak için</td></tr><tr><td>Ölçek</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>ağırlık PDMS karışımı</td></tr><tr><td>sCMOS kamera Andor Zyla</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>faz kontrastı ve floresan mikroskobu için (maks. 100 fps)</td></tr><tr><td>Deniz tuzu</td><td>Instant Ocean</td><td>Ürün No. SS1-160p</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 2015</td><td>Dassault Systemes SolidWorks</td><td></td><td>Kalıbı tasarlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Spectra X hafif motor</td> LED <td>395 nm için</td><td>Lümen Rengi</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>110-41-155</td><td>PDMS Si Elastomer Kiti; kürleme maddesi</td></tr><tr><td>Şırınga (Luer-Lok)</td><td>B Braun Omnifix</td><td>4616308F</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga İğnesi</td><td>Agani</td><td>A228</td><td>10 ila 30 ml</td></tr><tr><td>Şırınga Pompası 11 Pico Plus Elite</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-4506</td><td>Terumo Agani 23 ölçü 5/8 inç (16mm)</td></tr><tr><td>VeroGrey</td><td>Stratasys</td><td></td><td>Çift Şırınga Pompası</td></tr><tr><td>Vortex-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Kalıp Malzemesi</td></tr></tbody></table>

mikrobiyal davranışı İncelemek için kontrollü, dinamik kimyasal manzaralar Üretmek

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Kontrollü, dinamik kimyasal darbelerin üretimi için bir yöntem gösteriyoruz―lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale gelir―mikrobiyal kemotaksis deneyleri için mikro ortamlar oluşturmak için. Kimyasal darbeler oluşturmak için, bakteriyel süspansiyon içeren bir polidimethylsiloxane (PDMS) mikroakışkan odası içinde kafesli amino asitlerin fotolizi ile anında amino asit kaynaklarını yakın-anında tanıtmak için bir sistem geliştirdi. Bu yöntemi, video mikroskopi ile takip edilirken bu dinamik kimyasal degradelere aktif olarak tırmanabilen kemotaktik bakteri Vibrio ordalii'yeuyguladık. Fotoçıkarılabilir koruma grubu ile kimyasal modifikasyon ile biyolojik olarak inert ('kafesli') haline getirilen amino asitler, neredeyse UV-A odaklı LED ışını ile zaman ve mekanda kullanıcı tarafından tanımlanan noktalarda meydana gelen ani salınımına kadar süspansiyonda düzgün bir şekilde mevcut değildir, ancak tüketilemez. Darbede salınan molekül sayısı, fotoliz sonrası emilim spektrumunun UV-Vis spektroskopisi ile karakterize olduğu maruz kalma süresi ile uncaging fraksiyonu arasındaki kalibrasyon ilişkisi ile belirlenebilir. Bir nanogözenekli polikarbonat (PCTE) membran kafeslenmemiş bileşikler ve harcanan ortam akışı ile sürekli kaldırma sağlamak için mikroakışkan cihaza entegre edilebilir. PCTE membranı ile PDMS mikroakışkan yapısı arasında güçlü, geri dönüşü olmayan bir bağ, membranın 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi ile kaplanması ve ardından bağlanacak yüzeylerin plazma aktivasyonu ile elde edilir. Bilgisayar kontrollü bir sistem, farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı bakliyat dizileri oluşturabilir, böylece öngörülen uzamsal ve zamansal değişkenlik ile kaynak manzaraları oluşturabilir. Her kimyasal ortamda, bireysel ölçekte bakteri hareketinin dinamiği ve popülasyon düzeyinde birikmesi elde edilebilir, böylece kemotaktik performans ve ekolojik olarak ilgili ortamlarda bakteriyel toplamalar üzerindeki etkilerinin ölçülmesi izin.

Dinamik besin koşulları altında bakteri birikimi profillerini incelemek için mikroakışkan ve miliakışkan cihazları(Şekil 1)kullandık. Bakteriyel yörüngeler fotoliz tarafından salınan kimyasal darbesonrasında bakteri popülasyonunun birikim-dağılma dinamiklerinin faz kontrast mikroskobu ile elde edilen kaydedilen videolardan elde edilmiştir(Şekil 2 ve Şekil 3). Ortalama milyonlarca yörünge ile radyal sürüklenme hızı ve bakteri konsant...

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Bu yöntem, mikroölçekli ekoloji ve dinamik kimyasal degradeler navigasyon mikroorganizmaların davranışını açıklamak ve ekolojik olarak ilgili mikroortamlarda gizli trade-off, besin kinetik ve nüfus dinamikleri ortaya çıkarmak için izin verir. Mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirerek, kontrol edilen kimyasal darbeler üretiyoruz, lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale geliyor, mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini ölçmek için ilk olarak kararsız kimyasal degradelere maruz kalarak. CAD yazılımını kullanarak kanalı tasarlayın ve fotoğraf maskesi oluşturmak için saydamlık filmine yazdırın.El yazmasına göre, temiz bir odada yumuşak litografi ile usta imalat. 40 mililitrelik bir kabın 10'a 1 oranında kürleme maddesi ile elastomerbirleştirerek bir PDMS karışımı hazırlayın. Plastik bir bıçakla, sıvı homojen olana kadar şiddetle karıştırın.PDMS karışımını oda sıcaklığında 45 dakika boyunca vakum odasında hemen gazdan arındırın. İşlemi hızlandırmak için, arabirimde meydana gelen kabarcıkları patlatmak için vakumu periyodik olarak bırakın. Basınçlı bir temizleyici ile ana yüzeyinin tozunu çıkarın.Sonra ana üzerine gazdan pdms karışımı dökün ve iki saat boyunca 80 derece santigrat bir fırında pişirin. PDMS'yi mikroyapıların etrafında ki bir bıçakla yaklaşık beş milimetre mesafeden kesin ve pdms'yi anadan dikkatlice soyun. Mikrokanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet vermek için delik açar.Toz birikimini önlemek için mikro kanalı yapışkan bantla kapatın. 3B tasarım yazılımı kullanarak 3B şekli tasarla ve yüksek çözünürlüklü 3D yazıcıyla PDMS kalıbı için ana yı yazdırın. PDMS karışımını daha önce olduğu gibi hazırlayıp gazdan çıkardıktan sonra, yapıştırıcı bantla dabbing yaparak ustanın yüzeyini temizleyin.Ustayı bir ölçeğe koy. Daha sonra, ana merkezi bölge kaçınarak, 0,5 milimetre ana yüksekliği eşleştirerek PDMS istenilen yükseklik elde etmek için 23.4 gram unred PDMS karışımı dökün. Basınçlı hava yardımı ile kalan kabarcıkları çıkarın.PDMS döküm en az 12 saat pişirin 45 santigrat derece bir fırında master yerleştirin. Daha sonra, yavaşça sertleştirilmiş PDMS tabakası soyma ve bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu için giriş ve çıkış delikleri yumruk. Bir Petri kabının yüzeyini ve PDMS kalıbını oksijen plazması ile iki dakika aktif hale getirin.PdMS kalıbını Petri kabına hafifçe bastırarak Petri kabına bağlayın. Özelliklerin bulunduğu yere basmaktan kaçının. PdMS 3D kalıbına bağlanmış Petri kabını, kimyasal bağı güçlendirmek için en az 12 saat boyunca 45 derecede bir fırında yerleştirin.Daha sonra, oda sıcaklığında bir dakika lığına oksijen plazma odasında nanogözenekli polikarbonat membranı etkinleştirin. Kimyasal bir başlık altında, bir polipropilen tüp kullanarak hacim olarak% 1 deiyonize su 3-aminopropyltriethoxysilane ticari bir çözelti seyreltmek. Seyreltilmiş 3-aminopropiltrietoksisilane çözeltisini petri kabına aktarın ve aktif membranı 3-aminopropiltriethoxysilane çözeltisinde 20 dakika batırın.Sonra, cımbız ile 3-aminopropyltriethoxysilane çözeltisi membran çıkarın ve kuruması için temiz bir oda silme yerleştirin. Membran üzerinde yer alacak ve bakteriyel arenanın yıkanması için pdms mikroakışkan kanalların imalatı için, daha önce yapıldığı gibi tek kimyasal darbe deneyi için mikroakışkan cihazın imalatını tekrarlayın. PDMS yıkama kanallarını fonksiyonel membrana bağlamak için, önce hem PDMS yıkama kanalını hem de polikarbonat membranı oksijen plazma haznesiyle iki dakika aktif hale getirin.Plazma tedavisinden hemen sonra, PDMS yıkama kanalına membranüzerine hafifçe basarak işlevsel membranı ve PDMS yıkama kanalını temasa getirin. PDMS ve membranı hafifçe birbirine bastırmak önemlidir veya membran 200 mikrometre yüksekliğindeki PDMS mikrokanalının tavanına geri dönülmez şekilde bağlanmış olabilir. Daha sonra, hem bağlı laminat PDMS yıkama kanalı polikarbonat membran ı etkinleştirin hem de daha önce Petri kabına bağlanmış 3D PDMS kalıbını iki dakika lığına oksijen plazma odasına yerleştirerek etkinleştirin.Membranı iki PDMS katmanı arasında sandviç ve birlikte bastırın. Petri kabını sandviç yapısına bağlı olarak 45 derecede, kimyasal bağı güçlendirmek için en az 12 saat fırında yerleştirin. Başlamak için, 20 dakika boyunca vakum altında miliakışkan oda korumak.Daha sonra, miliakışkan hazneiçeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir pipet ile, yapay deniz suyunda bir milimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat çözeltisi GFP-floresan Vibrio ordalii seyreltik bakteriyel süspansiyon ile membran altında oda doldurun. Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, bir kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür.Bir şırıngayı bir milimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat yapay bir deniz suyu çözeltisi ile doldurun ve membran üzerinde yıkama kanalının giriş ve çıkış boru takın. Boruyu bir atık haznesine bağlayın ve basınç salınımlarını önlemek için borunun sıvı atık haznesine tamamen batırDığından emin olun. Şırınga pompasındaki akış hızını dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın.Membran üzerinde yıkama kanalında akış kurmak için şırınga pompası başlatın. LED ışını ve mikroskop aşamasını kontrol eden yazılımı başlatın ve farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı darbe dizileri oluşturun. Büyük bir yüzeyi kapsayacak şekilde birkaç saatlik bir süre boyunca ve birden fazla bitişik konum üzerinde düzenli zaman aralıklarında 4x hedefi kullanarak video kaydedin.Bu çalışmada, mikroakışkan ve miliakışkan cihazlar dinamik besin koşulları altında bakteriyel kemotaktik yanıt ve birikim profilleri çalışma için kullanılmıştır. Maksimum yoğunluklu projeksiyonlar, darbe nin salınımını hemen izleyen 0,5 saniyelik bir aralıkta ve nabız salınımını 40 saniye sonra, beyaz izlerle gösterilen bakteriyel pozisyonu gösterir. Bakteriyel yörüngeler de darbe nin serbest bırakılmasından 60 saniye sonra siyah olarak gösterilmiştir.Gölgeli bölge, görüntü alanının ortasında fotoiztarafından salınan kimyasal darbeyi temsil eder. Görüş alanının merkezinde nabız salınımını takiben radyal sürüklenme hızının zamansal dinamiği nin yanı sıra bakteri konsantrasyonu da burada gösterilmiştir. Sürüklenme hızının negatif değerleri, darbenin merkezine doğru yönlendirilmiş kemotaktik harekete karşılık gelir.Yüzme istatistikleri burada kimyasal degradelerin yokluğunda bir bakteri popülasyonu için sunulmaktadır. Yörüngeler mikrokanaldaki üç boyutlu bakteri hareketinin iki boyutlu projeksiyonlarını temsil eder. Ölçülen bakteriyel yüzme hızının olasılık dağılımı gama dağılımına uygundu.Bakteriyel yörüngelerden, ardışık yönlendirmeler arasındaki zamanın olasılık dağılımı ayıklanmıştır. Yeniden yönlendirme deseni, yüzme hızının dağılımı ve organizmaların yeniden yönlendirme istatistikleri bireysel tabanlı bir modeli bilgilendirmek için kullanıldı. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan üzerinde test edilmiştir, ancak önerilen metodoloji geniş türler ve kemoattractants farklı kombinasyonu için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için, mekansal heterojen ve dinamik koşullarda nüfus ve toplum dinamikleri gibi.Mikrobiyal ekoloji ve mikrobiyolojideki klasik teknikler, örneğin toplu kültürlerdeki büyümeler veya chemostatlar gibi, mikrobiyal habitatların spatio-zamansal özelliklerini büyük ölçüde göz ardı etmektedir. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin neredeyse anında oluşturulması, deniz bakterilerinin vahşi doğada karşılaştıkları besin bakliyatlarının türünü çeşitli kaynaklardan yeniden üretmeyi amaçlamaktadır, örneğin, batan organik parçacıkların arkasında tüylerin yayMası veya lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin. Aminosilane çözeltisi akut toksik ve aşırı dikkatli ele alınmalıdır.Biz sadece duman kaputaltında çalışmak ve laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü ve eldiven gibi koruyucu ekipman giymek. Ürettiğimiz atıkların da icabına bakarız.

generating-controlled-dynamic-chemical-landscapes-to-study-microbial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kayma akışı içinde derme çatma bir besin bir deniz manzarası ve yüzme davranışı içinde bakteri deniz mikropların kemotaktik toplayıcı davranış eğitimi için mikroakışkan kanalları ve deneylerde bunların uygulanmasını imalat açıklanmıştır.

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Kimyasal bahçe oluşumunu, denizaltı hidrotermal menfezlerinde oluşan doğal kimyasal bahçe sistemlerinin laboratuvar simülasyonlarına izin veren enjeksiyon deneyleri yoluyla tanımlıyoruz.

Kimyasal Bahçeleri olarak Reaktörler Taklit Doğal Hidrotermal Sistemler Akış

Siyanobakterilere çoklu genomik değişikliklerin sokulması, endüstriyel ve temel araştırma amaçları için suşların geliştirilmesinde önemli bir araçtır. Model siyanobakteri türü Synechocystis sp. PCC6803'da işaretlenmemiş mutantlar ve Synechococcus sp. PCC7002'da işaretli mutantlar üretmek için bir sistem tarif ediyoruz.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

evrim senaryolarda çeşitler (mekansal ayrışmanın) rolü mekansal dağılımı ayarı kontrollü izin laboratuvarda basit mikrobik sistemler kullanılarak incelenebilir. Kurucu hücre yoğunluğu değiştirerek, çeşitli çeşitler seviyeleri, Bacillus subtilis, koloni biyofilm floresan etiketli bakteriyel suşlar kullanılarak görüntülenebilir.

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Aerobik metan oksitleyici bakterilerin doğal ortamlarında bulunan metan-oksijen karşı gradyanını yeniden oluşturan ve fizyolojilerinin mekansal olarak çözülmüş bir bağlamda incelenmesini sağlayan basit bir model ekosistem hazırlamak için bir protokol açıklanmaktadır. Agaroz bazlı model ekosistemi ile kullanım için yaygın biyokimyasal tahlillerde yapılan değişiklikler de açıklanmaktadır.

Metan-oksijen karşı gradyanında metanotrof yetiştirmek için agaroz tabanlı model ekosistem

Bakteri popülasyonlarının sürekli düşük besinli koşullarda (yüzlerce nanomolar konsantrasyona kadar) veya geçici besin dalgalanmaları altında küçük bir zaman ölçeğinde yetiştirilmesini sağlayan milifluidik sürekli kültür cihazı (MCCD) için bir protokol sunuyoruz.

Düşük ve Dalgalanan Besin Koşullarında Escherichia coli'nin Incelenmesi için Sürekli Kültür Milifluidik Cihaz

Öğrenin, mikroorganizmaların dinamik kimyasal gradyanlara yönelik kemotaktik davranışlarını mikroakışkan cihazlar ve fotoliz kullanarak nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem, besin kinetiği ve popülasyon dinamikleri hakkında gerçek zamanlı içgörüler sunar.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

Daha fazla video keşfet